מדריך הייצור, התגבשות ונחישות מבנה של IKK1 האנושי/α
Summary
קינאז IκB 1/α (IKK1/α CHUK) הוא חלבון Ser/חמישי קינאז מעורב מספר עצום של פעילויות הסלולר בעיקר באמצעות הפעלה של גורמי שעתוק NF-κB. כאן, אנו מתארים את השלבים העיקריים הדרושים כדי להפוך את ייצור מכשור לקביעת קשיות ומבנה הגביש של חלבון זה.
Abstract
מחלקה של גירויים חוץ-תאית מחייב הפעלה של IKK1/α לזירוז דור של יחידת משנה NF-κB, p52, דרך עיבוד p100 קודמן שלו. פונקציות p52 homodimer או heterodimer עם יחידת משנה נוספת של NF-κB, RelB. הדימרים הללו בתורו לווסת את הביטוי של מאות גנים מעורבים דלקת, הישרדות cell ו מחזור התא. IKK1/α בעיקר נשאר משויך IKK2/β, נמו כמו קומפלקס ternary. עם זאת, בריכה קטנה של זה הוא ציין גם בתור complex(es) נמוך משקל מולקולרי. זה לא ידוע אם הפעילות עיבוד p100 המופעלת על-ידי הפעלה של IKK1/α במרחק גדול יותר או של הבריכה מורכבת קטנים יותר. פעילות המכונן של IKK1/α זוהתה במספר סוגי סרטן ומחלות דלקתיות. כדי להבין את המנגנון של הפעלה של IKK1/α, ולאפשר את השימוש בו כמטרה סמים, אנחנו הביע IKK1 רקומביננטי/α במערכות מארח שונים, כגון e. coli, חרקים, ואת תאי יונקים. שהצלחנו להביע מסיסים IKK1 α ב baculovirus נגוע תאים חרקים, קבלת mg כמויות של פרוטאין טהור מאוד, אך איבדו מחוזקן. בנוכחות מעכבי, וקביעת מבנה שלה. כאן, אנו מתארים את השלבים המפורטים כדי לייצר חלבון רקומביננטי להתגבשותו, נחישותה מבנה הגביש רנטגן.
Introduction
פעילות גנים ברמת השעתוק NF-κB משפחתו של גורמי שעתוק dimeric נדרשים לפונקציות הסלולר מגוונות, החל דלקת וחסינות הישרדות ומוות. פעילויות אלה נשלטים והטכני תאים, לאובדן של רגולציה מוביל מצבים פתולוגיים שונים, כולל הפרעות אוטואימוניות וסרטן1,2,3. בהיעדר גירוי, הפעילות של NF-κB נשמרים עכבות על ידי חלבונים IκB (מעכב של – κB)4. זירחון של שאריות Ser ספציפי על חלבונים IκB מסמן אותם ubiquitination, proteasomal הבאים השפלה או עיבוד סלקטיבי5. Kinases שני Ser/חמישי מאוד הומולוגיים, IKK2/β, IKK1/α, לשמש הרגולטורים המרכזי של NF-κB פעילויות על-ידי ביצוע אלה זרחון אירועים6,7.
אינטראקציות בין ליגנד קולטן transduces אות דרך סדרה של מתווכים מובילים לקראת הפעלת גורמי NF-κB. באופן כללי ניתן לסווג תהליך האיתות NF-κB שני מסלולים נפרדים – ואמנות קאנונית (אלטרנטיבית)8. הפעילות של IKK2/β בעיקר מסדיר את NF-κB איתות של הנתיב הקנוני חיונית תגובות חיסוניות דלקתיות, מולדת9. תכונה ברורים של מסלול זה היא הפעלה של מהיר ולא קצרת ימים של IKK2/β10 בתוך IKK עד כה מבחינה ביוכימית uncharacterized מורכבות – אוכל מורכב IKK1, IKK2, כמו גם רכיב תקינה, נמו (NF-κB חיוני אפנן )11,12,13. בין שני קטליטי IKK subunits של המתחם IKK, IKK2 הוא בעיקר אחראי14 עבור זירחון של שאריות ספציפית של IκBs טיפוסית (α, – β, & – γ) קשורה NF-κB, וגם של החלבון IκB טיפוסיות, NF-κB1/p105, אשר הוא קודמן של יחידת משנה p505NF-κB. זרחון המושרה ubiquitination ומוביל proteasomal השפלה של IκB (או עיבוד של p105) שחרור, הפעלה של קבוצה ספציפית של NF-κB הדימרים15. פעילות חריגה NF-κB בשל הפונקציה מוסדר בצורה שגויה של IKK2 נצפתה ב סרטן רבים כמו גם כמו הפרעות אוטואימוניות2,3,16.
בניגוד IKK2/β, מווסת פעילות של IKK1/α NF-κB איתות של מסלול קאנונית, שהיא הכרחית עבור פיתוח חסינות. IKK1 phosphorylates שאריות ספציפי של NF-κB2/p100 שלה קטע C-terminal IκBδ, מה שמוביל את העיבוד שלו, את הדור של p52. היווצרות של heterodimer p52:RelB transcriptionally פעיל יוזם תגובה איטית ומתמשכת אותות התפתחותית7,17,18,19,20. מעניין, הדור של p52 גורם מרכזי NF-κB של מסלול זה תלויה באופן ביקורתי גורם נוסף, NF-κB גרימת קינאז (NIK)21,22, אבל לא על IKK2 או נמו. בתאים resting, הרמה של ניק נשאר נמוך עקב שלה24,23,השפלה מתמדת פרוטאוזום תלוית25. על גירוי של תאים על-ידי ליגנדים ‘קאנונית’ ולאחר בתאים ממאירים מסוימים, ניק הופך התייצב לגייס ולהפעיל IKK1 / α. פעילות קינאז של ניק וגם IKK1 הם חיוניים עבור עיבוד יעיל של p100 לתוך p527. IKK1, ניק phosphorylate serines 3 (Ser866, 870, 872) של NF-κB2/p100 בקטע שלה-IκBδ C-מסוף המוביל את העיבוד שלו את הדור של p52. ההפעלה aberrant של השביל קאנונית היה מעורב ממאירות רבות כולל מיאלומה26,27,28.
מספר מעכבי מאוד יעילה, מדויקת עבור IKK2/β ידועים, למרות אף אחד עד כה יש התברר להיות תרופה יעילה. לעומת זאת, מעכבי IKK1/α-ספציפיות הם דלילים. זה עשויה לנבוע בחלקה שלנו חוסר מידע ביוכימי מבניים על IKK1/α, אשר מגביל את ההבנה שלנו של הבסיס מכניסטית של הפעלה של NF-κB מאת IKK1 תאים, תכנון תרופות רציונלי. המבנים רנטגן של IKK2/β סיפק לנו תובנות לגבי מנגנון ההפעלה של IKK2/β29; עם זאת, מבנים אלה לא יכלו לחשוף כמה שונה לגירויים במעלה להפעיל הפעלה של IKK1/α או IKK2/β להסדיר סטים ברורים של NF-κB פעילויות 30,31. כדי להבין את הבסיס מכניסטית שבבסיס הפונקציה האיתות מובהק של IKK1/α, וכדי ליצור פלטפורמה עבור תכנון רציונלי תרופות, התמקדנו לקביעת המבנה של IKK1/α.
Protocol
Representative Results
Discussion
פתרון ייצור, התגבשות, מבנה של שני חלבונים IKK קשורים
. יצאנו כדי לקבוע את המבנה של IKK1/α עם הרעיון שיהיה זה תרגיל פשוט למדי בהתחשב בניסיון שלנו עם ייצור החלבון IKK2/β, התגבשות ונחישות מבנה… עם זאת, היינו מאוד מופתעים כי אלה שני חלבונים הקשורים התנהגו אחרת לגבי הקלות של התגבשות. למרות ה?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים הצוות beamlines 19ID, 24ID, ו 13ID מתקדם פוטון במקור, Lemont, איל, לתמיכה במהלך איסוף נתונים על קריסטלים שונים. אנחנו מודים דמיטרי Lyumkis, מכון סאלק להבאה אותנו על המפה הקפאה-EM ברזולוציה נמוכה בשלבים המוקדמים של EM מפה/דגם בניין, אשר שימש כדי לבנות את הדגם הראשוני של חיפוש תחליף מולקולרית IKK1. המחקר שהוביל את התוצאות הללו זכה למימון מענקים NIH AI064326, CA141722 ו- GM071862 כדי GG. SP הוא כעת Wellcome אמון DBT הודו ביניים עמית.
Materials
| Cellfectin/Cellfectin II | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II |
| Sf900 III Insect cell medium | Thermo Fisher Scientific | 12658-027 | |
| SF9 cells | Thermo Fisher Scientific | 12659017 | |
| anti-IKK1 antibody | Novus Biologicals | NB100-56704 | Previously sold by Imgenex |
| anti-PentaHis antibody | Qiagen | 34460 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Nitrocellulose can also be used |
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
| Bradford assay reagent | BioRad | 500001 | |
| Superdex 200 column | GE Healthcare | 28989335 | |
| Amicon concentrator | Millipore | UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024 | |
| Compound A | Bayer | ||
| Calbiochem IKK-inhibitor XII | Calbiochem | 401491 | |
| Staurosporine | SIGMA | S4400 | |
| MLN120B | Millenium | Gift item | |
| AMPPNP | SIGMA | A2647 | |
| Dextran sulfate | SIGMA | 51227, 42867, 31404, | |
| Dextran sulfate | Alfa Aesar | J62101 | |
| PEG | SIGMA | 93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172 | Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #. |
| Crystallization Screens | |||
| Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT) | Hampton Research | HR2-130 | |
| Index HT | Hampton Research | HR2-134 | |
| PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT) | Hampton Research | HR2-139 | |
| PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT) | Hampton Research | HR2-086 | |
| SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT) | Hampton Research | HR2-136 | |
| Crystal mounts | Hampton Research | HR8-188, 190, 192, 194 | |
| Synchrotron | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory | Beamline 19 ID | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines. |
Referências
- Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. NF-kappaB, an active player in human cancers. Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140 (6), 883-899 (2010).
- Ben-Neriah, Y., Karin, M. Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker. Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).
- Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).
- Karin, M., Ben-Neriah, Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity. Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).
- Ghosh, S., Karin, M. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. Cell. 109, S81-S96 (2002).
- Sun, S. C. The noncanonical NF-kappaB pathway. Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).
- Bonizzi, G., Karin, M. The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).
- DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB. Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).
- Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity. Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).
- Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation. Cell. 91 (2), 243-252 (1997).
- Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex. Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).
- Yamaoka, S., et al. Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation. Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).
- Li, Z. W., et al. The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis. J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).
- Hayden, M. S., Ghosh, S. Shared principles in NF-kappaB signaling. Cell. 132 (3), 344-362 (2008).
- Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity. Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).
- Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells. Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).
- Senftleben, U., et al. Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway. Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).
- Coope, H. J., et al. CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52. EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).
- Dejardin, E., et al. The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways. Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).
- Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation. The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).
- Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100. Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).
- Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100. J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).
- Zarnegar, B. J., et al. Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK. Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).
- Vallabhapurapu, S., et al. Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling. Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).
- Annunziata, C. M., et al. Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).
- Keats, J. J., et al. Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).
- Staudt, L. M. Oncogenic activation of NF-kappaB. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109 (2010).
- Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS Biol. 11 (6), e1001581 (2013).
- Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).
- Scheidereit, C. IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription. Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).
- Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).
- Polley, S., et al. Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha. Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).
- Otwinowski, Z. a. M., W, Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode. Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).
- Liu, S., et al. Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer. J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
- McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
- Vagin, A. T., Teplyakov, A. MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).
- Brunger, A. T. Version 1.2 of the Crystallography and NMR system. Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).
- Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).
- McRee, D. E. XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview. J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).
- Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data. Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).
- Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS biology. 11 (6), e1001581 (2013).
- Christopher, J. A., et al. The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).
- Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking crystallographic model and data quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
