دليل للإنتاج وتبلور، وتصميم هيكل للبشرية IKK1/α
Summary
كيناز IκB 1/α (IKK1/α الشق) هو كيناز بروتين Ser/منتدى المجالس الرومانسية التي تشارك في مجموعة متنوعة أنشطة الخلوية أساسا من خلال تفعيل عوامل النسخ نف κB. وهنا يصف لنا الخطوات الرئيسية اللازمة لإنتاج وتصميم هيكل الكريستال هذا البروتين.
Abstract
فئة من المحفزات خارج الخلية يتطلب التنشيط من IKK1/α للحث على جيل من وحدة فرعية NF-κB، p52، من خلال تجهيز p100 السلائف. وظائف p52 هوموديمير أو هيتيروديمير مع وحدة فرعية NF-κB آخر، ريلب. وتنظم هذه dimers بدوره التعبير عن مئات جينات المعنية بالتهاب وبقاء الخلية، ودورة الخلية. IKK1/α أساسا يظل المقترنة مع IKK2/β ونيمو كمجمع ثلاثي. ومع ذلك، يلاحظ أيضا بركة صغيرة لأنها complex(es) وزن الجزيئي منخفض. من غير المعروف إذا كان يتم تشغيل نشاط تجهيز p100 بتفعيل IKK1/α داخل أكبر أو أصغر مجموعة معقدة. تم الكشف عن نشاط المكونة من IKK1/α في العديد من أنواع السرطان والأمراض الالتهابية. لفهم الآلية لتفعيل IKK1/α، ويمكن استخدامه كهدف المخدرات، أعربنا عن المؤتلف IKK1/α في أنظمة المضيف مختلفة، مثل كولاي، والحشرات، وخلايا الثدييات. لقد نجحنا في التعبير عن IKK1/α القابلة للذوبان في باكولوفيروس إصابة خلايا الحشرات، الحصول على كميات ملغ من البروتين النقي جداً، وبلورة ذلك حضور مثبطات، وتحديد هيكلها كريستال بالأشعة السينية. هنا، نحن تصف الخطوات التفصيلية لإنتاج البروتين المؤتلف وفي التبلور، وعزمه الهيكل كريستال بالأشعة السينية.
Introduction
الأنشطة النسخي NF-κB الأسرة من عوامل النسخ dimeric مطلوبة من أجل وظائف خلوية متنوعة تتراوح بين الالتهاب والحصانة للبقاء على قيد الحياة والموت. وتخضع هذه الأنشطة صارم في الخلايا وفقدان التنظيم يؤدي إلى مختلف الحالات المرضية، بما في ذلك أمراض المناعة الذاتية والسرطان1،،من23. نظراً لغياب حافز، يتم الاحتفاظ بأنشطة NF-κB تحول دون ب البروتينات IκB (المانع-κB)4. علامات الفسفرة بقايا Ser محددة على البروتينات IκB لهم أوبيكويتينيشن وتدهور proteasomal اللاحقة أو معالجة انتقائية5. اثنين مؤنزم Ser/Thr عالية مثلى، IKK2/β و IKK1/α، تعمل كوسط منظمي الأنشطة NF-κB بالاضطلاع بهذه الأحداث الفسفرة6،7.
التفاعلات بين يجند ومستقبلات ترانسدوسيس إشارة من خلال سلسلة من الوسطاء مما يؤدي إلى تنشيط عوامل NF-κB. ويمكن تصنيف عملية التنبيه NF-κB على نطاق واسع إلى مسارين متميزة-المقبول وغير المقبول (البديلة)8. وينظم نشاط IKK2/β أساسا NF-κB إشارات من مسار الكنسي الذي يعتبر أساسيا للاستجابات المناعية التحريضية والفطرية9. سمة مميزة لهذا المسار تنشيط السريع ولم تدم طويلاً من IKK2/β10 داخل إيك أونتشاراكتيريزيد المتحلل حتى الآن معقدة – يفترض أن تكون مؤلفة من IKK1 و IKK2، فضلا عن عنصر تنظيمي، نيمو (NF-κB “المغير الأساسية” )11،،من1213. بين وحدتين فرعيتين إيك الحفاز لمجمع إيك، IKK2 هو أساسا مسؤولة14 الفسفرة بقايا محددة لتنميط IκBs (α،-β، وγ) منضمة إلى NF-κB، وأيضا بروتين IκB شاذة، NF-κB1/p105، الذي تمهيدا ل وحدة فرعية p50 NF-κB5. الناجم عن الفسفرة أوبيكويتينيشن وتدهور proteasomal IκB (أو تجهيز p105) يؤدي إلى إطلاق سراح والتنشيط لمجموعة محددة من NF-κB dimers15. وقد لوحظ نشاط NF-κB الشاذة بسبب سوء تنظيم وظيفة IKK2 في العديد من أنواع السرطان، وكذلك كما هو الحال في اضطرابات المناعة الذاتية2،،من316.
على النقيض من IKK2/β، ينظم نشاط من IKK1/α NF-κB يشير المسار غير متعارف عليه، هو أمر ضروري للتنمية والحصانة. IKK1 فوسفوريلاتيس بقايا محددة من NF-κB2/p100 في جزئه IκBδ ج-الطرفية، مما يؤدي إلى المعالجة وتوليد p52. يبدأ تشكيل هيتيروديمير p52:RelB ترانسكريبتيونالي النشطة استجابة بطيئة ومتواصلة لإشارات التنموية7،17،،من1819،20. من المثير للاهتمام، جيل p52 عامل نف κB المركزية لهذا المسار اعتماداً كبيرا على عامل آخر، كيناز الذي يحفز NF-κB (NIK)21،22، لكن ليس على IKK2 أو نيمو. في الخلايا يستريح، لا يزال مستوى NIK منخفضا بسبب لها التردي المستمر تعتمد على بروتوزوم23،24،25. عند تنشيط خلايا يغاندس ‘غير مقبول’، وفي بعض الخلايا الخبيثة، يصبح استقرت NIK لتوظيف وتفعيل IKK1/α-أنشطة كيناز NIK و IKK1 ضرورية لفعالية تجهيز p100 إلى p527. IKK1 و NIK فوسفوريلاتي سيرينس الثلاثة (Ser866، 870 و 872) من NF-κB2/p100 في جزئه IκBδ ج-الطرفية مما يؤدي إلى المعالجة وتوليد p52. قد تورط الشاذة تفعيل المسار غير متعارف عليه في كثير من الأورام الخبيثة بما في ذلك الورم النخاعي المتعدد26،،من2728.
عدة مثبطات كفاءة عالية ومحددة ل IKK2/β معروفة، على الرغم من أن لا شيء حتى الآن وقد اتضح أن دواء فعال. وفي المقابل، مثبطات IKK1/α-محددة متفرق. وهذا قد تنبع جزئيا من افتقارنا للمعلومات الهيكلية والبيوكيميائية على IKK1/α، مما يحد من فهمنا للأساس آليا إلى تفعيل NF-κB التي IKK1 في الخلايا، وتصميم الأدوية العقلاني. هياكل الأشعة السينية IKK2/β قدم لنا رؤى في تفعيل إليه بيتا IKK2/29؛ ومع ذلك، هذه الهياكل يمكن أن لا تكشف عن مدى اختلاف المحفزات المنبع يؤدي التنشيط IKK1/α أو IKK2/β لتنظيم مجموعات متميزة من NF-κB الأنشطة 30،31. لفهم أساس الميكانيكية الأساسية لوظيفة التنبيه متميزة IKK1/α، وإنشاء منبر لتصميم الأدوية العقلاني، ركزنا على تحديد هيكل IKK1/α.
Protocol
Representative Results
Discussion
حل الإنتاج وتبلور وهيكل من اثنين من البروتينات إيك ذات الصلة
لقد حددنا لتحديد هيكل الكريستال الأشعة السينية IKK1/α مع الفكرة القائلة أنه سيكون عملية معقدة نسبيا نظراً لتجربتنا مع IKK2/β إنتاج البروتين والتبلور، وتصميم الهيكل. ومع ذلك، فوجئنا بدرجة عالية أن هذه البروتينات ذات الصلة…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الموظفين في 19ID بيملينيس، 24ID، و 13ID في “المتقدم فوتون المصدر”، ولاية، وايل، للدعم المقدم من خلال جمع البيانات عن بلورات مختلف. نحن ممتنون لديمتري ليومكيس، ومعهد سولك لجلب لنا خريطة م البرد دقة منخفضة في المراحل المبكرة من م خريطة/نموذج البناء، الذي كان يستخدم لبناء نموذج البحث استبدال الجزيئية IKK1 الأولى. البحوث المؤدية إلى هذه النتائج تلقت تمويلاً من المعاهد الوطنية للصحة منح AI064326 و CA141722 و GM071862 جيغاغرام. SP هو حاليا “ويلكوم ترست DBT الهند الوسيطة زميل”.
Materials
| Cellfectin/Cellfectin II | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II |
| Sf900 III Insect cell medium | Thermo Fisher Scientific | 12658-027 | |
| SF9 cells | Thermo Fisher Scientific | 12659017 | |
| anti-IKK1 antibody | Novus Biologicals | NB100-56704 | Previously sold by Imgenex |
| anti-PentaHis antibody | Qiagen | 34460 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Nitrocellulose can also be used |
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
| Bradford assay reagent | BioRad | 500001 | |
| Superdex 200 column | GE Healthcare | 28989335 | |
| Amicon concentrator | Millipore | UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024 | |
| Compound A | Bayer | ||
| Calbiochem IKK-inhibitor XII | Calbiochem | 401491 | |
| Staurosporine | SIGMA | S4400 | |
| MLN120B | Millenium | Gift item | |
| AMPPNP | SIGMA | A2647 | |
| Dextran sulfate | SIGMA | 51227, 42867, 31404, | |
| Dextran sulfate | Alfa Aesar | J62101 | |
| PEG | SIGMA | 93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172 | Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #. |
| Crystallization Screens | |||
| Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT) | Hampton Research | HR2-130 | |
| Index HT | Hampton Research | HR2-134 | |
| PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT) | Hampton Research | HR2-139 | |
| PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT) | Hampton Research | HR2-086 | |
| SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT) | Hampton Research | HR2-136 | |
| Crystal mounts | Hampton Research | HR8-188, 190, 192, 194 | |
| Synchrotron | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory | Beamline 19 ID | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines. |
Referências
- Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. NF-kappaB, an active player in human cancers. Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140 (6), 883-899 (2010).
- Ben-Neriah, Y., Karin, M. Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker. Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).
- Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).
- Karin, M., Ben-Neriah, Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity. Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).
- Ghosh, S., Karin, M. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. Cell. 109, S81-S96 (2002).
- Sun, S. C. The noncanonical NF-kappaB pathway. Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).
- Bonizzi, G., Karin, M. The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).
- DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB. Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).
- Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity. Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).
- Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation. Cell. 91 (2), 243-252 (1997).
- Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex. Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).
- Yamaoka, S., et al. Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation. Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).
- Li, Z. W., et al. The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis. J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).
- Hayden, M. S., Ghosh, S. Shared principles in NF-kappaB signaling. Cell. 132 (3), 344-362 (2008).
- Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity. Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).
- Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells. Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).
- Senftleben, U., et al. Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway. Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).
- Coope, H. J., et al. CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52. EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).
- Dejardin, E., et al. The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways. Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).
- Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation. The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).
- Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100. Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).
- Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100. J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).
- Zarnegar, B. J., et al. Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK. Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).
- Vallabhapurapu, S., et al. Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling. Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).
- Annunziata, C. M., et al. Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).
- Keats, J. J., et al. Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).
- Staudt, L. M. Oncogenic activation of NF-kappaB. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109 (2010).
- Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS Biol. 11 (6), e1001581 (2013).
- Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).
- Scheidereit, C. IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription. Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).
- Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).
- Polley, S., et al. Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha. Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).
- Otwinowski, Z. a. M., W, Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode. Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).
- Liu, S., et al. Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer. J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
- McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
- Vagin, A. T., Teplyakov, A. MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).
- Brunger, A. T. Version 1.2 of the Crystallography and NMR system. Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).
- Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).
- McRee, D. E. XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview. J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).
- Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data. Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).
- Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS biology. 11 (6), e1001581 (2013).
- Christopher, J. A., et al. The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).
- Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking crystallographic model and data quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
