IκB キナーゼ 1/α (IKK1/α CHUK) は主に転写因子の NF-κ B の活性化を介して細胞活動の無数に関係するセリン/スレオニン蛋白質キナーゼ。ここでは、生産、この蛋白質の結晶構造解析に必要な主な手順について述べる。
細胞外刺激のクラスには、NF-κ B サブユニット、p52、その前駆体の p100 の処理による生成を誘導する IKK1/α の活性化が必要です。p52 ホモまたはヘテロダイマー別 NF-κ B サブユニット、RelB ととして機能します。これらの二量体はターンでは何百もの炎症、細胞生存率、細胞周期に関与する遺伝子の発現を調節します。IKK1/α 三元複合体として主に IKK2/β とネモに関連付けられたままです。しかし、それの小さなプールがまた低分子量 complex(es) として観察されます。P100 処理アクティビティが大きく内 IKK1/α の活性化または小さい複雑なプールによってトリガーされる場合は不明です。IKK1/α の構成アクティビティがいくつかの癌や炎症性疾患で検出されました。IKK1/α の活性化のメカニズムを理解し、創薬のターゲットとしての使用を有効にする、我々 は大腸菌など、別のホスト システムでの組換え IKK1/α を表明した昆虫および哺乳類細胞。成功したバキュロ ウイルスで水溶性 IKK1/α を表現する感染昆虫細胞、非常に純粋な蛋白質の mg 量を取得、阻害剤の存在下で結晶化、x 線結晶構造を決定します。ここでは、組換えタンパク質、その結晶の x 線結晶構造解析を生成する詳細な手順について述べる。
二量体転写因子の NF κ B 家族の転写活性は、炎症と免疫生存と死に至るまで多様な細胞機能に必要です。これらの活動は、細胞と自己免疫疾患や癌1,2,3を含む様々 な病理学の条件に規制つながるの損失に厳しく制御されます。刺激がないと、NF-κ B の活性抑制 IκB (κ B の阻害剤) 蛋白質4で保持されます。IκB タンパク質特定 Ser 残基のリン酸化ユビキチン化とそれに続くプロテアソームまたは選択的処理5のマークを付けます。セリン/スレオニンの 2 つの高い相同性キナーゼ IKK2/β と IKK1/α はこれらのリン酸化イベント6、7の遂行によって NF-κ B の活動の調節因子として機能します。
リガンドと受容体の相互作用は、一連の仲介因子 NF-κ B の活性化につながる信号をペリプラズムします。NF-κ B シグナル伝達プロセスは、2 つの異なる経路-正規と非正規 (代替)8に広く分類できます。IKK2/β の活動は主に、炎症性と生得免疫応答9に不可欠な標準的な経路の NF-κ B シグナル伝達を調節します。この経路の特徴はこれまで生化学メタボライト IKK 複雑な内 IKK2/β10の迅速かつ短時間活性化-IKK1、IKK2、規制成分、ネモ (NF-κ B 重要な変調器で構成されると推定)11,12,13。IKK 複合体の 2 つの触媒 IKK サブユニット、間 IKK2 主担当です14原型 IκBs (α ・ β ・ γ) の特定の残基のリン酸化のため NF-κ B とも非定型の IκB 蛋白質にバインド NF-κB1/p105 である、NF-κ B p50 サブユニット5の前駆体。リン酸化によるユビキチンとプロテアソームの IκB (または p105 の処理) がリリースと NF-κ B 二量体15の特定のセットの活性化に 。IKK2 の誤規制機能による異常な NF-κ B 活性は、自己免疫疾患2,3,16のように同様に多くの癌で観察されています。
IKK2/β と対照をなして IKK1/α の活動は、NF-κ B が開発と耐性のために不可欠である非正規の経路のシグナル伝達を調節します。IKK1 は、C 末端 IκBδ のセグメントについては、その処理と p52 の生成につながる NF-κB2/p100 の特定残基を廃止します。転写活性状態 p52:RelB ヘテロダイマーの形成発達信号7,17,18,19,20をゆっくりと持続的な応答を開始します。興味深いことに、この経路の中央 NF-κ 係数 p52 の世代はもう一つの要因は、NF-κ B を誘発するキナーゼ (NIK)21,22ではなく、IKK2 またはネモに大きく依存します。静止期細胞のニックのレベルがその一定のプロテアソーム依存低下23,24,25により低いまま。’非正規’ の配位子と特定の悪性の細胞で細胞の刺激、ニック化を採用して IKK1 をアクティブにするが安定/ニック ・ IKK1 α キナーゼ活動が p527に p100 の効率的な処理に不可欠であります。IKK1 とニックはに対する 3 セリン (Ser866、870 と 872) NF-κB2/p100 の処理と p52 の世代につながる、C 末端 IκBδ セグメント上です。非正規の経路の異常な活性化は、多発性骨髄腫26,27,28を含む多くの癌に関与しています。
IKK2/β のいくつかの非常に効率的かつ特定阻害剤が知られているが、どれもはこれまで有効な薬剤であると判明しています。対照的に、IKK1/α-特定の阻害剤は、まばら。これは、部分的に構造および生化学的 IKK1/α、セル、および合理的な薬剤設計の IKK1 によって NF-κ B の活性化の機構の基礎を理解することについての私達の欠如から幹があります。IKK2/β の x 線構造は、IKK2/β29; の活性化機構への洞察を提供してくれましたしかし、これらの構造がどのように異なる上流の刺激を明らかに IKK1/α または IKK2/β NF-κ B 活動30,31の異なるセットを規制するためのアクティブ化をトリガーします。IKK1/α の異なるシグナル伝達関数の基になる機構の基礎を理解して、合理的な薬剤設計のためのプラットフォームを確立するには、我々 は IKK1/α の構造決定に焦点を当てた。
2 つの関連する IKK タンパク質の生産、結晶化・構造ソリューション
IKK2/β タンパク生産、結晶化、構造決定と私たちの経験を与えられる比較的簡単な運動であろう概念と IKK1/α の x 線結晶構造を決定するのに着手しました。ただし、我々 はこれら 2 つの関連蛋白質は結晶化のしやすさに関する非常に異なる振る舞いこと非常に驚いていた。いくつかの知名度の高い所から努力…
The authors have nothing to disclose.
ビームライン 19ID、24ID、および様々 な結晶でのデータ収集の間にサポートのための高度な光子源、レモント、イリノイ州で 13ID でスタッフに感謝いたします。EM 地図/モデルの構築、初期 IKK1 分子置換検索モデルの作成に使用された初期の段階での低分解能の低温電子顕微鏡マップを取得私たちのドミトリー ・ Lyumkis、ソーク研究所に感謝しております。これらの結果につながる研究は、GG に NIH 助成金 AI064326、CA141722、および GM071862 から資金を受けています。SP は、Wellcome の信頼 DBT インド中間。
Cellfectin/Cellfectin II | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II |
Sf900 III Insect cell medium | Thermo Fisher Scientific | 12658-027 | |
SF9 cells | Thermo Fisher Scientific | 12659017 | |
anti-IKK1 antibody | Novus Biologicals | NB100-56704 | Previously sold by Imgenex |
anti-PentaHis antibody | Qiagen | 34460 | |
PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Nitrocellulose can also be used |
Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
Bradford assay reagent | BioRad | 500001 | |
Superdex 200 column | GE Healthcare | 28989335 | |
Amicon concentrator | Millipore | UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024 | |
Compound A | Bayer | ||
Calbiochem IKK-inhibitor XII | Calbiochem | 401491 | |
Staurosporine | SIGMA | S4400 | |
MLN120B | Millenium | Gift item | |
AMPPNP | SIGMA | A2647 | |
Dextran sulfate | SIGMA | 51227, 42867, 31404, | |
Dextran sulfate | Alfa Aesar | J62101 | |
PEG | SIGMA | 93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172 | Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #. |
Crystallization Screens | |||
Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT) | Hampton Research | HR2-130 | |
Index HT | Hampton Research | HR2-134 | |
PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT) | Hampton Research | HR2-139 | |
PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT) | Hampton Research | HR2-086 | |
SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT) | Hampton Research | HR2-136 | |
Crystal mounts | Hampton Research | HR8-188, 190, 192, 194 | |
Synchrotron | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory | Beamline 19 ID | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines. |