Um Sistema Híbrido de Levedura-Um Modificado para Estudos de Interação de DNA de Complexo de Proteínas Heteroméricas

Em geral, para entender as interações proteína-DNA, o teste Y1H é o sistema preferido usado com sucesso em uma configuração laboratorial ¹ . O ensaio básico de Y1H envolve dois componentes: a) uma construção repórter com ADN de interesse clonado com sucesso a montante de um gene que codifica uma proteína repórter; E b) uma construção de expressão que irá gerar uma proteína de fusão entre o TF de interesse e um domínio de ativação da transcrição de fermento (AD). O DNA de interesse é comumente referido como "isca", enquanto a proteína de fusão é conhecida como "presa". Nos últimos anos, várias versões do ensaio Y1H foram desenvolvidas para atender às necessidades específicas com suas próprias vantagens ² . O ensaio Y1H existente pode ser implementado com sucesso para identificar e validar a interação de uma proteína de cada vez com a isca de DNA, mas não possui a capacidade de identificar interações heterodiméricas ou multimeric proteína-DNA.

"> O método descrito aqui é uma versão modificada dos pesquisadores habilitados para Y1H para estudar simultaneamente múltiplas proteínas que se ligam à sua sequência de DNA alvo. O objetivo deste ensaio é expressar a proteína de interesse com um domínio de ativação (pDEST22: TF) e avaliar a ativação das regiões de DNA candidatas fundidas a um repórter na presença e / ou ausência do parceiro de proteína que interage (pDEST32ΔDBD-TF) no sistema de levedura. Esse ensaio nos permitirá determinar se a interação entre esses dois As proteínas são necessárias para a ativação do alvo. Este é um sistema compatível com clonagem GATEWAY e, portanto, é viável para uso em uma configuração regular de laboratório. Este protocolo baseia-se na transformação direta, o que proporciona a facilidade de co-transformação de diferentes TFs em um sistema de levedura . Assim, é uma estratégia vantajosa para validar os complexos de proteína que se ligam aos seus possíveis alvos de DNA para validação molecular e funcional in vitro fOu qualquer sistema. As técnicas atuais, como os métodos de purificação por afinidade em Tandem (TAP), são caras e intensivas em mão-de-obra, mas permitem a detecção de hetrocomplexos protéicos em grande escala ^{3 , 4 , 5} . Este um híbrido de levedura modificado pode ser realizado com sucesso em uma configuração de laboratório regular em pequena escala ( Figura 1 ) e também é rentável. O ensaio Y1.5H pode facilitar pesquisadores em toda a comunidade para testar e validar sua hipótese para definir o papel da ligação do complexo de proteína multimérica a um alvo de DNA comum usando um sistema heterólogo. Com base nos achados, a hipótese poderia ser validada in vivo no sistema de estudo preferido. Recentemente, utilizamos essa abordagem para definir o papel de um TF e seu modo de ação para regular a floração em Arabidopsis ⁶ .