Un lievito modificato - un sistema ibrido per studi di interazione tra DNA e proteine ​​eteromeriche

In generale, per comprendere le interazioni proteine-DNA, il saggio Y1H è il sistema preferito utilizzato con successo in un ambiente di laboratorio ¹ . Il test Y1H di base coinvolge due componenti: a) un costruttore di reporter con DNA di interesse con successo clonato a monte di un gene che codifica una proteina reporter; E b) un costrutto di espressione che genera una proteina di fusione tra il TF di interesse e un dominio di attivazione della trascrizione di lieviti (AD). Il DNA di interesse è comunemente indicato come 'esca' mentre la proteina di fusione è conosciuta come 'preda'. Negli ultimi anni sono state sviluppate più versioni del test Y1H per soddisfare le esigenze specifiche con i propri vantaggi ² . Il test Y1H esistente può essere implementato con successo per identificare e convalidare l'interazione di una proteina alla volta con l'esca del DNA, ma manca la capacità di identificare interazioni tra proteine ​​e DNA eterodimeriche o multimeriche.

"> Il metodo descritto qui è una versione modificata dei ricercatori che consentono Y1H di studiare contemporaneamente più proteine ​​legate alla loro sequenza di DNA target. L'obiettivo di questo test è quello di esprimere la proteina di interesse con un dominio di attivazione (pDEST22: TF) e valutare l'attivazione delle regioni del DNA candidato fuso ad un reporter in presenza e / o assenza del partner proteico interagente (pDEST32ΔDBD-TF) nel sistema di lievito.Questo dosaggio ci permetterà di determinare se l'interazione tra questi due Proteine ​​è necessario per l'attivazione del bersaglio.Questo è un sistema compatibile di clonazione GATEWAY e quindi è possibile utilizzare in un ambiente di laboratorio regolare.Questo protocollo è basato sulla trasformazione diretta, che fornisce la facilità di co-trasformazione di TF differenti in un sistema di lievito , Quindi è una strategia vantaggiosa per convalidare i complessi proteici che si legano ai loro possibili bersagli del DNA per la convalida molecolare e funzionale in vitro fO qualsiasi sistema. Le tecniche attuali quali i metodi di purificazione di affinità tandem (TAP) sono costosi e impegnativi nel lavoro, ma consentono la rilevazione di hetrocomplex proteici su larga scala ^{3 , 4 , 5} . Questo ibrido di lievito modificato può essere eseguito con successo in una regolazione regolare di laboratorio su piccola scala ( figura 1 ) ed è anche conveniente. Il test Y1.5H può facilitare i ricercatori in tutta la comunità per verificare e convalidare la loro ipotesi per definire il ruolo del complesso proteico multimerico legato ad un comune obiettivo del DNA utilizzando un sistema eterologo. Sulla base dei risultati, l'ipotesi potrebbe essere convalidata in vivo nel sistema di studio preferito. Recentemente, abbiamo utilizzato questo approccio per definire il ruolo di un TF e il suo modo di azione per regolare la fioritura in Arabidopsis ⁶ .