高分解能断層顕微鏡（HREM） - 有機材料の処理および可視化のための簡単で堅牢なプロトコル

すべての手順は、ウィーン医科大学の倫理ガイドラインに従って実施した。 サンプル調製 胚と胚の組織を準備する（最大5 x 5 x 5 mm 3 ） 4℃で4％PFA / PBSまたはBouin固定液中の胚または胚の一部を固定し、少なくとも16〜24時間一定ロッキング下で固定する。 注：48時間のゼブラフィッシュ、19時間のニワトリおよびウズラ、および出生前のマウス胚など、いくつかの種および様々な発達段階の胚を使用することができます（ 代表結果を参照）。検体を採取し、固定液に入れる前に、ステージングのために室温でPBSに移した。必要に応じて、埋め込み型にフィットするように固定する前に、マイクロハサミまたはメスで標本をトリムします。 固定液を除去し、4℃でPBS中の胚組織を洗浄する。一定のロッキング下でgで24時間（2-3回の変化）。 70％、80％、90％、96％エタノール中のサンプルを4℃で2〜3時間脱水する。試料が入っているチューブを回転装置に置きます。 注：小さなサンプル（<2 x 2 x 2 mm 3 ）では、サンプルが各エタノールに入っている時間を60分に短縮することができます。大きなサンプル（> 5 x 5 x 5 mm 3 ）では、4時間まで延長することができます。 防護手袋を着用している煙霧ボンネットの下で以下の浸透ステップを実行します。 1.25gの過酸化ベンゾイル（可塑化触媒）と0.4gのエオシンを100mLの溶液Aに添加することにより浸潤溶液を調製する（詳細については、 表の表を参照）。エオシンと触媒が完全に溶解するまで（2-3時間）、磁気攪拌プレート上のビーカーで4℃で撹拌する。 浸潤溶液に試料を12〜24時間置く。連続的な揺れや回転のもとで4℃に保つ。 3と12の後に浸透溶液を新鮮な溶液に交換するh。 注：大型胚（> 1cmクラウン/臀部の長さ）では、浸潤時間を48時間に延長する。 成体組織サンプルを調製する（最大5×5×7mm 3 ） 少なくとも3日間4℃で4％のコール酸を含む2％PFA / PBSで組織を固定する。 注：このソリューションでは、皮膚、肝臓、膵臓、腎臓、甲状腺、心臓、線条筋肉、脳、神経およびいくつかの新生児および成人、げっ歯類、ブタ、ミバエおよびゼブラフィッシュの腫瘍モデルに由来する組織サンプルを固定することができますHREMイメージングのために処理されます（サンプルの修正を示します; 代表結果を参照）。メス、はさみまたは生検パンチで組織サンプルを切り出し、固定剤に直接移す。神経組織を固定するには、4％PFA / PBSを使用する。 固定剤を除去し、実行中の水道水の下で組織を3〜6時間洗う。 続いてプラックでサンプルを脱水する70％、80％、90％、96％エタノール中でそれらを100mL当たり0.4gのエオシン（各2-3時間）と混合する。サンプルを4°Cで一定のロッキングまたはローテーター下に保ちます。 注：小さなサンプル（<2 x 2 x 2 mm 3 ）では、サンプルが各エタノールに入っている時間を60分に短縮することができます。大きなサンプル（> 5 x 5 x 5 mm 3 ）では、4〜8時間に延長することができます。 防護手袋を着用したヒュームフードの下で以下の浸透ステップをすべて実行してください。 1.25gの過酸化ベンゾイル（可塑化触媒）と0.4gのエオシンを100mLのSolution Aに加えて浸透溶液を調製する（詳細は表の表を参照）。エオシンと触媒が完全に溶解するまで（2-3時間）、磁気攪拌プレート上のビーカーに4℃でかき混ぜる。 試料を24〜36時間浸透溶液に入れる。連続的な揺れや回転のもとで4℃に保つ。 3の後、浸透溶液を新鮮な溶液に交換する。12時間。 注：大きなサンプル（> 5 x 5 x 5 mm 3 ）の場合、浸透時間を48時間に延長します。 他の有機材料の準備 注：通常のはさみで、皮膚の代用品と用紙を所望のサイズにトリムします。固定は必要ありません。 固定、脱水、脱水の手順を省略します。 防護手袋を着用したヒュームフードの下で以下の浸透ステップをすべて実行してください。 1.25gの過酸化ベンゾイル（可塑化触媒）と0.4gのエオシンを100mLのSolution Aに加えて浸透溶液を調製する（詳細は表の表を参照）。エオシンと触媒が完全に溶解するまで（2〜3時間）、磁気攪拌プレート上で4℃でビーカー中で撹拌する。 浸透溶液にサンプルを3〜12時間置く。連続的な揺れや回転のもとで4℃に保つ。浸透溶液を1〜2時間後に新しい溶液に交換する。 </ li> 埋め込み注記：保護手袋を着用しているフュームフードの下ですべての手順を実行します。 上記のように新鮮な浸潤溶液を調製する（ステップ1.1.4.1）。浸透溶液100mLに溶液B（詳細は表を参照）4mLを加えて包埋溶液を調製する。 注記：包埋モールド内の試料の正確な向きが必要であり、いくつかのサンプルを平行に埋め込むことができるようにするには、ビーカーを氷浴に入れてストック溶液の重合を遅くします。 6 x 8 x 5 mm 3または13 x 19 x 5 mm 3の定型容積の金型または最大8 x 10 x 15 mmのボリュームを持つカスタマイズされた金型を使用して、成形カップトレイ（詳細は表を参照）を使用してください3 （ 図2 ）。 金型に包埋溶液を充填し、金型に試料を移す。スプーン。移送中は、空気トラップを避けるためにサンプルが包埋溶液で完全に覆われていることを確認してください。 注：これは、試料および冷蔵庫からの包埋溶液を収集した直後に開始する場合、室温で行うことができる。 ニードルまたは鉗子を使用して型の内側にサンプルを向ける。 埋め込み溶液が粘性になるとすぐに、金型の上にブロックホルダー（ 材料の表を参照）を置​​き、ブロックホルダーの底面が1〜2で覆われるまでブロックホルダーの中心穴に埋め込み溶液を加えますmmである。 モールドカップトレイを液体パラフィンワックスで覆いシールし、硬化するまで待ちます。あるいは、サンプル付きのモールドカップトレイに第2のモールドカップトレイを上下逆に置き、粘着テープで密封して防塵します。 密封された成形カップのトレイを1〜室温で2日間。 重合後処理のためには、標準的な実験室オーブンに重合ブロックを入れた成形カップトレイを置き、暗赤色になるまで最低1〜2日間70〜80℃で焼きます。オーブンからトレイを収集し、金型からブロックを取り出します。 注：ベーキングは通常の環境条件で行うことができます。埋め込み後の第1段階の気密シールを確実にする被覆成形カップトレイは、10時間後に樹脂の色をチェックできるように取り除くことができる。ベーキングの直後、樹脂は柔らかく、ブロックは成形カップトレイから容易に取り外すことができる。 2〜3時間以内に、それらは硬く、数ヶ月間室温で保存することができます。 3.データ生成注：ここで使用されているHREMプロトタイプ18,25は、以下の項目で構成されています。（i）ブロックホルダー付きロータリーミクロトーム各切断の後にその上方転向点で停止する。 （ii）標準の使い捨てではないミクロトームナイフ、硬質金属、プロファイルD（詳細は表を参照）。 （iii）対物レボルバーおよびGFP-フィルター立方体（励起470/40;発光フィルター525/50）をその光軸に有する蛍光化合物顕微鏡のヘッド。光軸は、ミクロトームに取り付けられたブロックの新たに切断された表面に対して垂直に配置され、上下運動を可能にする装置によって保持される。 （iv）ミクロトームを担持する電動クロステーブル。テーブルは、光軸の方向および横方向にシフトすることができる。 （v）蛍光化合物顕微鏡に取り付けられたデジタルビデオカメラ。 （vi）モノクローム光源（470nm）。 （vii）カメラに接続されたコンピュータ、データ生成ソフトウェア（詳細は表を参照）。 手順 関心のある領域を示します。 標準的な実験室のリ白色光をブロック面に斜めに照射するための光源（ 表の表を参照）。 埋め込みマテリアルの輪郭をブロックサーフェスに投影する際にその輪郭を特定します。ペンまたはカミソリの刃を使用して、関心領域および後の視野をブロック表面上に示す。 注：この手順は、セクション化する前に視野の範囲を定義するために必須です。 視野を定義します。 ミクロトーム上にサンプルを含む樹脂ブロックをマウントします。 ブロックホルダーを停止位置に移動します（ブロックホルダーエクスカーションの上部転回点）。 デジタルカメラとデータ生成ソフトウェアを起動し、ライブイメージを取得します。 ブロック面に表示された関心領域をカバーするために適切な倍率で対物レンズを選択します。 注：倍率が2.5倍、5倍、10倍、20倍、開口数が0.07〜0.40のものがよく使用されます。 </li> 関心領域がコンピュータ画面上に表示される視野と一致するまで、電動クロステーブルを使用して、視神経を上下左右に動かします。 フォーカス。 サンプルの最初の構造が目に見えるようになるまで手動でセクションを段階的に実行します。 ミクロトームを光軸の方向に動かすことによって、光学系の焦点面内にブロック面を配置する。 セクションの厚さを選択します。セクションの厚さは0.5〜5μmが推奨されます。 データの生成と処理 セクションとイメージのキャプチャを調整するソフトウェアルーチンを起動します。画像キャプチャソフトウェアの文書化された指示に従ってください。 ソフトウェアルーチンを停止し、サンプルが完全に分割されるとすぐにブロックサーフェスの前面にスケーリングスライドを配置します。 後のキャリブレーションのために画像をインタラクティブにキャプチャする。 注：これは、新たに設定された設定で目的が使用されるたびに実行されなければなりません。 画像シリーズを8ビットグレースケール画像in.jpg形式に変換します。 画像シリーズを3Dビジュアライゼーションソフトウェアにロードし、コントラストを調整します。 注：イメージ変換と3Dビジュアライゼーションは、それぞれのソフトウェアの指示に従って、さまざまな商用または自由に利用可能な標準ソフトウェアパッケージで行うことができます。