Cyanobacteriën accumuleren glycogeen aangezien de belangrijkste koolhydratenopslag van koolstof uit CO ₂ in licht door fotosynthese wordt vastgesteld. Glycogeen is een glycan die bestaat uit lineair a-1,4-gebonden glucan met takken die zijn gecreëerd door a-1,6-gekoppelde glucosyl bindingen. Glycogene biosynthese bij cyanobacteriën begint bij de omzetting van glucose-6-fosfaat in ADP-glucose door de sequentiële werking van fosfoglucomutase en ADP-glucose pyrophosphorylase. De glucosegroep in ADP-glucose wordt overgebracht naar het niet-reducerende einde van het a-1,4-glucan ruggengraat van glycogeen door één of meer glycogensynthasen (GlgA). Vervolgens introduceren een vertakende enzymen de a-1,6-gekoppelde glucosylkoppeling, die verder wordt uitgebreid om het glycogeenpartikel te genereren. In het donker wordt glycogeen afgebroken door glycogeenfosforylase, glycogeenafbrekende enzymen, a-glucanotransferase en malto-dextrinefosforylase in gefosforyleerde glucose en vrije glucose. Deze feed intO catabolische wegen, inclusief de oxidatieve pentosefosfaatweg, de Embden-Meyerhof-Parnas-route (glycolyse) en de Entner-Doudoroff-weg ^{1 , 2 , 3 , 4} .

Glycogeen metabolisme in cyanobacteriën heeft de afgelopen jaren steeds meer belangstelling gekregen vanwege het potentieel dat cyanobacteriën zich ontwikkelen tot microbiële celfabrieken die door zonlicht worden aangedreven om chemicaliën en brandstoffen te produceren. Glycogeenmetabolisme kan worden aangepast om de opbrengst van de producten te verhogen, omdat glycogeen het grootste flexibele koolstofbad in deze bacteriën is. Een voorbeeld is de cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002, die genetisch gemanipuleerd is om mannitol te produceren; De genetische verstoring van glycogensynthese verhoogt de mannitolopbrengst 3 keer ⁵ . Een ander voorbeeld is de productie van bioethanol uit glycogeenbelaste wildtYpe Synechococcus sp. PCC 7002 ⁶ . Het glycogeengehalte van het wildtype cel kan tot 60% van het droge gewicht van de cel zijn tijdens stikstofhongersnij ⁶ .

Ons begrip van glycogeen metabolisme en regulering is ook in de afgelopen jaren uitgebreid. Terwijl glycogeen bekend is om in het licht op te accumuleren en in het donker te worden gekatalyseerd, werd de gedetailleerde kinetiek van glycogeenmetabolisme gedurende de dielcyclus pas onlangs geopenbaard in Synechocystis sp. PCC 6803 ⁷ . Bovendien zijn verschillende genen die de accumulatie van glycogeen beïnvloeden geïdentificeerd. Een opvallend voorbeeld is de ontdekking dat de vermeende histidinkinase PmgA en het niet-coderende RNA PmgR1 een regulerende cascade vormen en de accumulatie van glycogeen controleren. Interessant genoeg accumuleren de pmgA pt pmgR1 deletiemutanten tweemaal zo veel glycogeen als de wildtypestam van Synechocystis sp. PCC 68038 ^{, 9} . Andere regulerende elementen zijn ook bekend om de accumulatie van glycogeen te beïnvloeden, met inbegrip van de alternatieve sigma factor E en de transcriptieve factor CyAbrB2 ^{10 , 11} .

Aangezien belangstelling voor glycogeenregulatie en metabolisme groeit, is een gedetailleerd protocol dat de bepaling van het glycogeengehalte omschrijft, gerechtvaardigd. In de literatuur worden verschillende methoden gebruikt. Zure hydrolyse, gevolgd door de bepaling van het monosaccharidegehalte door middel van hoge druk anionuitwisselingsvloeistofchromatografie gekoppeld met een gepulseerde amperometrische detector of spectrometrische bepaling na behandelingen met zuur en fenol, zijn veel gebruikte methoden om het glycogeengehalte ^{9 , 10 , 12 , 13} te benaderen. Echter, een hoge druk anionuitwisseling vloeistofchromatografieC-instrument is zeer duur en onderscheidt geen glucose afgeleid van glycogeen van die afgeleid van andere glucose-bevattende glycoconjugaten, zoals sucrose ¹⁴ , glucosylglycerol ¹⁵ en cellulose ^{16 , 17 , 18} , die bekend zijn om te accumuleren in sommige cyanobacteriële species. De methode van zuur-fenol kan worden uitgevoerd met behulp van standaard laboratoriumapparatuur. Het maakt echter gebruik van zeer giftige reagentia en onderscheidt geen glucose afgeleid van verschillende glycoconjugaten, noch onderscheidt het glucose uit andere monosacchariden die cellulaire materialen, zoals glycolipiden, lipopolysacchariden en extracellulaire matrices ^{12 vormen} . Met name wordt de hete zuur-fenol-analyse vaak gebruikt voor het bepalen van het totale koolhydraatgehalte in plaats van voor de specifieke bepaling van glucose-gehalte ¹² . Enzymatische hyDrolyse van glycogeen naar glucose door a-amyloglucosidase gevolgd door de detectie van glucose door middel van een enzymgekoppelde assay, produceert een colorimetrische aflezing die zeer gevoelig en specifiek is voor glucose afgeleid van glycogeen. De specificiteit kan verder worden versterkt met de preferentiële precipitatie van glycogeen uit cellysaten door ethanol ^{5 , 8 , 19} .

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor een enzym gebaseerde assay van het glycogeengehalte in twee van de meest geteste cyanobacteria, Synechocystis sp. PCC 6803 en Synechococcus sp. PCC 7002, in de wildtype en mutantstammen. Om een ​​efficiënte hydrolyse te waarborgen wordt een cocktail van a-amylase en a-amyloglucosidase gebruikt ⁸ . Het endo-werkende a-amylase hydrolyseert de a-1,4-bindingen in verschillende glucanen in dextrinen, die verder worden gehydrolyseerd tO glucose door exo-werkende a-amyloglucosidase ²⁰ . De synergistische effecten van deze enzymen zijn bekend, en deze enzymen worden routinematig gebruikt voor de selectieve hydrolyse van zetmeel, dat een a-gebonden glucan achtig glycogeen is, zonder andere glycoconjuganten, zoals cellulose, in de plantbiomassa ²¹ te beïnvloeden. De uitgebrachte glucose wordt kwantitatief gedetecteerd na een enzymgekoppelde assay bestaande uit glucoseoxidase, dat de reductie van zuurstof naar waterstofperoxide en de oxidatie van glucose naar een lacton- en peroxidase katalyseert, die een roze gekleurde quinoneimine kleurstof uit waterstofperoxide produceert, Een fenolische verbinding en 4-aminoantipyrine ²² .