تحديد محتوى الجليكوجين في البكتيريا الزرقاء

البكتيريا الزرقاء تراكم الجليكوجين كمخزن الكربوهيدرات كبير من الكربون CO ₂ من الثابت في الضوء من خلال عملية التمثيل الضوئي. الجليكوجين هو غليكان يتكون من الخطي α-1،4 مرتبطة الجلوكان مع الفروع التي تم إنشاؤها من قبل روابط α-1،6 مرتبطة الجلوكوزيل. الجليكوجين الحيوي في البكتيريا الزرقاء يبدأ مع تحويل الجلوكوز 6-الفوسفات إلى أدب الجلوكوز من خلال العمل المتسلسل من فسفوغلوكوموتاس و أدب الجلوكوز بيروفوسفوريلاز. يتم نقل شدة الجلوكوز في أدب الجلوكوز إلى نهاية غير الحد من العمود الفقري α-1،4-غلوكان من الجليكوجين من قبل واحد أو أكثر من سينثاسيس الجليكوجين (غلغا). في وقت لاحق، إنزيمات المتفرعة إدخال α-1،6 ربط الجلوكوزيل الربط، الذي هو أبعد من ذلك لتوليد الجسيمات الجليكوجين. في الظلام، يتم تقسيم الجليكوجين أسفل الفوسفوريلاز الجليكوجين، الانزيمات جليكوجين التحضير، α غلوكانوترانزفيراس، و فسفوريلاز مالتو ديكسترين إلى الجلوكوز فسفوريلاتد والجلوكوز الحر. هذه الخلاصة إنتo مسارات تقويضية، بما في ذلك مسار فوسفات البنتوز المؤكسد، ومسار إمبدين-مايرهوف-بارناس (التحلل)، ومسار إنتنر-دودوروف ^{1 ، 2 ، 3 ، 4} .

وقد اكتسب استقلاب الجليكوجين في البكتيريا الزرقاء اهتماما متزايدا في السنوات الأخيرة بسبب إمكانية أن تتطور البكتيريا الزرقاء إلى مصانع خلايا ميكروبية مدفوعة بأشعة الشمس لإنتاج المواد الكيميائية والوقود. ويمكن تعديل عملية التمثيل الغذائي الجليكوجين لزيادة العائد من المنتجات، لأن الجليكوجين هو أكبر تجمع الكربون المرن في هذه البكتيريا. مثال على ذلك هو سيانوباكتريوم سينيكوكوكوس سب. يك 7002، التي تم هندستها وراثيا لإنتاج مانيتول؛ والخلل الجيني من تخليق الجليكوجين يزيد من مانيتول العائد 3 أضعاف ⁵ . مثال آخر هو إنتاج الإيثانول الحيوي من ويلدت الجليكوجين المحملةيب سينيكوكوكوس سب. يك 7002 ⁶ . قد يكون محتوى غليكوجين الخلية ويلديب تصل إلى 60٪ من الوزن الجاف للخلية خلال المجاعة النيتروجين ⁶ .

وقد توسع أيضا فهمنا لأيض الجليكوجين والتنظيم في السنوات الأخيرة. في حين من المعروف أن الجليكوجين تتراكم في الضوء، و كابوليزد في الظلام، حركية مفصلة من استقلاب الجليكوجين خلال دورة دييل كشفت مؤخرا فقط في سينكوسيستيس سب. يك 6803 ⁷ . وعلاوة على ذلك، تم تحديد العديد من الجينات التي تؤثر على تراكم الجليكوجين. ومن الأمثلة البارزة على ذلك اكتشاف أن الكيناز الهستيدين المفترض بمغا والرنا غير المشفر PmgR1 تشكيل سلسلة تتالي والسيطرة على تراكم الجليكوجين. ومن المثير للاهتمام، وpmgA وpmgR1 المسوخ الحذف تتراكم ضعف كمية الجليكوجين لان السلالة wildtype من Synechocystis س. يك 68038 ^{، 9} . ومن المعروف أيضا أن العناصر التنظيمية الأخرى تؤثر على تراكم الجليكوجين، بما في ذلك عامل سيغما البديل E والعامل النسخي CyAbrB2 ^{10 ، 11} .

كما الفائدة في تنظيم الجليكوجين والتمثيل الغذائي تنمو، وبروتوكول مفصل يصف تحديد محتوى الجليكوجين هو ما يبرره. وتستخدم عدة طرق في الأدب. يتبع التحليل المائي الحمضي الذي يتبعه تحديد محتوى السكريات الأحادية من خلال كروماتوجرافيا السائل الأنيوني ذات الضغط العالي إلى جانب كاشف أمبيروميتري نابض أو تحديد مطياف بعد المعاملات مع حامض والفينول على نطاق واسع أساليب لتقريب محتوى الجليكوجين ^{9 ، 10 ، 12 ، 13} . ومع ذلك، فإن الضغط العالي أنيون الصرف الكروماتوجرافي السائلc مكلفة جدا ولا تميز الجلوكوز المستمدة من الجليكوجين من تلك المستمدة من غيرها من غليكوكونجوغاتس التي تحتوي على الجلوكوز، مثل السكروز ¹⁴ ، الجلوكوسيل غليسيرول ¹⁵ ، والسليلوز ^{16 ، 17 ، 18} ، والتي من المعروف أن تتراكم في بعض الأنواع السيانوبكتيرية. طريقة حمض الفينول يمكن أن يؤديها باستخدام معدات المختبرات القياسية. ومع ذلك، فإنه يستخدم الكواشف عالية السمية ولا يميز الجلوكوز المستمدة من غليكوكونغاتاتس مختلفة، كما أنه لا يميز الجلوكوز من السكريات الأخرى التي تشكل المواد الخلوية، مثل السكر الشحمي، عديدات السكاريد الدهنية، والمصفوفات خارج الخلية ¹² . والجدير بالذكر أن مقايسة الحمض الفينول الساخن غالبا ما تستخدم لتحديد محتوى الكربوهيدرات الكلي بدلا من التحديد المحدد لمحتوى الجلوكوز ¹² . الأنزيمية هيدروليسيس من الجليكوجين إلى الجلوكوز بواسطة α-أميلوغلوكوسيداس تليها الكشف عن الجلوكوز من خلال مقايسة الإنزيم يقترن قراءات اللونية التي هي حساسة للغاية ومحددة للجلوكوز المستمدة من الجليكوجين. ويمكن تعزيز خصوصية أبعد من ذلك مع هطول الأمطار التفضيلية من الجليكوجين من ليسيتس الخلية عن طريق الإيثانول ^{5 ، 8 ، 19} .

هنا، نحن تصف بروتوكول مفصل لمقايسة القائم على الإنزيم من محتوى الجليكوجين في اثنين من الأنواع الدرامية سيانوباكتريال الأكثر دراسة على نطاق واسع، سينكوسيستيس سب. يك 6803 و سينيكوكوكوس سب. يك 7002، في ويلديب وسلالات متحولة. من أجل ضمان التحلل المائي الفعال، يتم استخدام كوكتيل من α- الأميليز و α-أميلوغلوكوسيداز ⁸ . تحلل α- الأميليز إندو المفعول α-1،4-الروابط في مختلف الجلوكان في ديكسترينز، والتي هي أكثر تحلل tس الجلوكوز بواسطة إكسو-أكتينغ α-أميلوغلوكوسيداز ²⁰ . الآثار المتآزرة لهذه الانزيمات معروفة جيدا، وتستخدم هذه الانزيمات بشكل روتيني للتحلل المائي الانتقائي للنشا، وهو غلوكان مرتبط α مثل الجليكوجين، دون التأثير على غليكوكونوجانتس أخرى، مثل السليلوز، في الكتلة الحيوية النباتية ²¹ . تم الكشف عن الجلوكوز صدر كميا بعد مقايسة انزيم مقترنة تتكون من أوكسيديز الجلوكوز الذي يحفز خفض الأكسجين إلى بيروكسيد الهيدروجين وأكسدة الجلوكوز إلى لاكتون والبيروكسيديز – التي تنتج صبغة كينونيمين الوردي اللون من بيروكسيد الهيدروجين، مركب الفينول، و 4-أمينوانتيبيرين ²² .