Generación de variantes de Escape de neutralizar anticuerpos Monoclonal del Virus de la Influenza

PRECAUCIÓN: un número de virus de la gripe circulantes en la población humana (por ejemplo, H1, H3) son patógenos de clase de nivel 2 de bioseguridad que deben manejarse con cuidado y equipo de protección personal adecuado. Manejo de virus debe ser aprobado por la Junta de revisión institucional. El siguiente protocolo fue aprobado por la Junta de revisión institucional en el Monte Sinaí. Nota: anticuerpos HA específicos que inhiben la replicación viral se pueden categorizar generalmente en i) que se unen en o cerca del sitio de unión del receptor encima de la cabeza globular y ii) que se unen a distal del atascamiento del receptor dominio, que incluye el lado lateral de la cabeza globular y la región del tallo de la HA. Anticuerpos que atacan el sitio de unión del receptor evitar la motivos de ácido siálico en la superficie de las células diana y se pueden medir mediante una prueba de hemoaglutinación inhibición (HI). Anticuerpos que son HI-negativas, tales como anticuerpos específicos para tallo, todavía puede inhibir la replicación viral, pero sólo pueden ser evaluadas mediante ensayos de neutralización. 1. categorización de anticuerpos basados en HI y neutralización de actividades análisis de HI en una placa de 96 pocillos V-inferior, añada 25 μl de PBS 1 x en las columnas 2 a 12. Diluir la 7B2 mAb (específica de la cabeza), 6F12 (específico de tallo) 23 y un control de isotipo a 100 μg/mL 1 x PBS y alícuotas de 50 μl de las preparaciones de anticuerpo diluido en columna 1. También no incluyen un control de mAb agregando 50 μl de PBS 1 x ( figura 1A). Realizar diluciones seriadas 2 veces de los anticuerpos mediante la transferencia de 25 μl de la columna 1 columna 2 y así sucesivamente. Deseche los últimos 25 μl de la columna 12 ( figura 1A). Nota: Asegúrese de incluir una fila de no control del anticuerpo. Diluir la acción de virus (virus recombinante expresando la HA y NA de A/California/04/09 con los segmentos internos de A/Puerto Rico/8/34) hasta 8 hemaglutinación unidades/25 μl diluir virus stock. Añadir 25 μl del stock de virus diluido (8 hemaglutinación) a cada pozo (filas A G). Nota: La mezcla de anticuerpos y virus debe tener un volumen final de 50 μL con una concentración final a partir de 50 μg/mL. Incubar la placa a temperatura ambiente (RT) durante 45 min. De la fila de volumetría (H), añadir 50 μl de PBS 1 x en pozos H2 a H12. Añada 100 μl de la 8 hemaglutinación unidades/25 μl a H1. En serie diluir dos veces al transferir 50 μl de H1 a H2 y así sucesivamente. Desechar la última 50 μl de H12 bien. Por último, añada 50 μl de 0.5% pollo células de sangre rojas (RBC) en todos los pocillos de la placa de 96 pocillos fondo V. Nota: Las muestras de mAb en el ensayo deben tener un volumen final de 100 μl: mAb (25 μl), virus (25 μl) y RBC (50 μL). El volumen final del no control mAb debe contener 25 μl de 1 x PBS, 25 μl de virus y 50 μl de eritrocitos. Incubar la placa a 4 ° C por 1 h. Lectura visual las placas para la actividad de HI. Si hay una lectura positiva de un anticuerpo particular, proceda al paso 2.1 para generar variantes de escape. Si el anticuerpo es HI-negativo, proceda a continuación al paso 1.2 para evaluar si el anticuerpo tiene que neutralizar la actividad en un ensayo de cultivo celular. Nota: Una lectura positiva de un mAb HI activa se indica mediante una pelotilla de RBC rojo oscurezca en el centro de un pozo ( figura 1B 7B2) que formará una lágrima cuando la placa de 96 pocillos fondo V se mantiene en un ángulo de 45 °. Una lectura negativa no formarán un diábolo rojo oscuro de RBC en el pozo ( figura 1B 6F12 y no mAb). El control de isotipo también no forma una pelotilla de RBC rojo oscurezca y aspecto idéntico del anticuerpo específico de tallo, 6F12 o el mAb no debe controlar la muestra ( figura 1B) 23. Ensayo de microneutralización las células de la placa Madin Darby Canine riñón (MDCK) a una densidad de 2 x 10 4 células/pozo en un cultivo de tejidos tratados placa de 96 pocillos e incubar a 37 ° C y 5% de CO 2 de 17 a 19 h . Nota: Las células pueden también podrán adherirse al fondo del pozo durante al menos 4 h antes de su uso. En una placa de 96 pocillos separada, realizar siete diluciones seriadas 3-fold del mAb humano 4D 05 5, CR9114 17 control o de isotipo IgG, en una concentración inicial de 200 μg/mL en 1 X medio esencial mínimo (MEM) suplementado con tosyl Fenilalanil clorometil cetona (TPCK)-tratado de tripsina (1 μg/mL) ( figura 2). Nota: La columna A debe contener 75 μl de anticuerpo diluido (a partir de la concentración de 200 μg/mL). En serie diluir (3-fold) abajo de la placa mediante la transferencia de 25 μl de la columna A la fila B y así sucesivamente. Filas A H deben tener un volumen final de 50 μl. No es necesario cambiar consejos entre dilución transferencias. Diluir la acción de virus (virus recombinante expresando la HA y la NA de A/Shanghai/1/13 con el segmento interno de A/Puerto Rico/8/34) a una dosis infectiva de cultivo de tejidos 50% (TCID 50) 100 / 50 μL en 1 x MEM complementado con tratados de TPCK tripsina (1 μg/mL) 24. Añadir 50 μL/pocillo de virus diluido a las preparaciones de anticuerpo (paso 1.2.2). Añadir 50 μl de MEM X 1 a los pocillos control de células no infectadas. Incubar las mezclas virus anticuerpos en una incubadora de 37 ° C (con 5% CO 2) durante 1 h. Nota: Las mezclas de anticuerpo del virus deben tener un volumen total de 100 μl: 50 μl de la dilución del anticuerpo (paso 1.1.2) y 50 μl de virus que contiene 100 TCID 50 (paso 1.2.3). Los medios de comunicación en los pozos de aspirar y añadir el todo 100 μl de las mezclas de anticuerpo del virus a los pocillos correspondientes. Nota: La aspiración se realiza utilizando un adaptador aspirador 8 canales conectado a un vacío. Como alternativa, puede usarse una pipeta multicanal de micro de 8 o 12 pozos para aspirar manualmente. Toda aspiración durante la eliminación de inóculo o lavados se realiza desde la mayor concentración de anticuerpos menor sin necesidad de cambiar consejos. Lavar la monocapa con 200 μL de 1 x PBS. Aspirar 200 μL de PBS 1 x (como en el paso 1.2.5). Repita el lavado una vez más para un total de dos lavados. Infectar la monocapa de células MDCK añadiendo el todo 100 μL/pocillo de mezclas de anticuerpo del virus (de paso 1.2.4) en la monocapa e infectar/incubar a 37 ° C (con 5% CO 2) durante 1 h. Durante la infección, en una placa de 96 pocillos separada, preparar otra serie de diluciones del anticuerpo. Añadir 150 μL de 100 μg/mL del anticuerpo correspondiente en la fila A y 100 μl de 1 x MEM suplementado con tripsina tratada TPCK (1 μg/mL) en filas B H. realizar 3-fold diluciones transfiriendo 50 μl de la columna A fila b , y así sucesivamente, hasta la fila H. desechar la última 50 μl de la fila H. El volumen total de cada bien debe ser igual a 100 μl. apartar. Nota: Los anticuerpos se diluyen en 1 x MEM suplementado con tripsina tratada TPCK (1 μg/mL). Aspire el inóculo de anticuerpo del virus de la monocapa en paso 1.2.7 y reponer con el entero 100 μL/pocillo de la dilución del anticuerpo correspondiente preparado en el paso 1.2.8. Nota: Si un bien independiente una concentración de anticuerpo final de 100 μg/mL durante la infección (paso 1.2.7), entonces los medios de comunicación llenando también debe contener una concentración de anticuerpo final de 100 μg/mL (paso 1.2.8). Incubar durante 24 h en una incubadora de 37 ° C (con 5% CO 2). Los medios de comunicación de las placas de 96 pozos de aspirar y lavar con 200 μL/pocillo de PBS 1 x tres veces. Fijar las células con 100 μl de acetona fría de 80% durante 1 h a -20 ° C. Nota: La solución de acetona 80% se diluye en doble destilada (dd) H 2 O (p. ej., 80 mL de acetona al 100% más 20 mL de ddH 2 0). La solución de acetona 80% puede ser enfriada en hielo antes de su uso. Lavar las células con 200 μL/pocillo de 1 X PBS tres veces. Bloque las placas con 200 μL/pocillo de leche 5% diluyeron en 1 X PBS e incuban las placas a temperatura ambiente por 1 h. Agregar 100 μl de biotinilado anti-influenza un anticuerpo primario de nucleoproteína (NP) diluido 1:2,000 1 x PBS/1% de albúmina de suero bovino (BSA) e Incube las placas a temperatura ambiente por 1 h. Nota: Para el virus de la gripe B, un anticuerpo de anti-NP influenza B virus-específica debe utilizarse. Lavar las placas con 1 x PBS tres veces. Añadir 100 μl del anticuerpo conjugado de peroxidasa (HRP) rábano estreptavidina diluido 1:3,000 1 x PBS/1% BSA e incubar las placas a temperatura ambiente por 1 h. Lavar las placas con 200 μL de PBS 1 x tres veces. Añadir Reactivo de substrato HRP en 100 μL/pocillo e incubar en la oscuridad a RT. Nota: El tiempo de incubación debe optimizarse antes de la adición del buffer ácido parada (abajo). Por lo general, basta con 15 a 30 min. Calmar la reacción con 50 μL/pocillo de 5 M HCl. 5M PRECAUCIÓN: el ácido clorhídrico es un reactivo altamente corrosivo que puede causar daños a ojos, piel y membranas mucosas. Además de este reactivo deben realizarse bajo una campana de ventilación con equipo de protección personal adecuado. Leer las placas a 492 nm y restar los pocillos fondo (células no infectadas). Calcular el porcentaje de inhibición con la siguiente fórmula: si un anticuerpo tiene actividad de neutralización (y ninguna actividad HI), continúe con el paso 2.2. Nota: Carece de anticuerpos que carecen de actividad de neutralización en vitro actividad HI. 2. Generación de variantes de mutantes de Escape Nota: anticuerpos neutralizantes que tienen o carecen de actividad de HI se analizan más lejos con los protocolos específicos que se describen a continuación. Protocolo 1: anticuerpos HI-positivo/neutralización-positivo ( Figura 3A ) Prepare un caldo de virus de 10 6 placa formando unidades/mililitro (PFU/mL) en PBS 1 x en el un volumen de 400 μl. Preparar cuatro diluciones del anticuerpo de interés en el aumento de las concentraciones (por ejemplo, 0, 0.5, 0,05 y 0,005 mg/mL) en PBS 1 x en un volumen de 100 μl dilución. Nota: Virus tipo salvaje siempre deben ser pasados en paralelo y en la ausencia de anticuerpos. Las secuencias de estos virus los ayudará a distinguir entre la adaptación a las condiciones de cultivo de células y mutaciones de escape. Mezclar 100 μl de 10 6 PFU/mL de virus con 100 μl de cada dilución de anticuerpo o 100 μl de PBS 1 x. Incubar durante 1 h en una incubadora de 37 ° C (con 5% CO 2). Vortex brevemente. Inyecte 200 μL de cada mezcla en huevos de pollo de patógeno específico libres (SPF) embrionados. Incubar los huevos a 37 ° C (sin CO 2) 40-44 h. Sacrificar los huevos embrionados infectados de virus por incubación a 4 ° C durante un mínimo de 6 h. Cosecha el líquido alantoideo de los huevos, como se describió anteriormente 24 , 25. Realizar el ensayo de hemaglutinación, como se describe anteriormente 24 , 26. Si todos los preparativos fluidos alantoico no tienen títulos de hemoaglutinación, repita del paso 2 con las diluciones de anticuerpo que van de 0,005 mg/mL a 0,00005 mg/mL. Nota: Una concentración de saturación de un anticuerpo positivo HI puede neutralizar todas las partículas de virus presentes. Por lo tanto, puede ser necesario disminuir la cantidad de anticuerpos presentes en los pases. Confirmar 24 (paso 1.1) del análisis de las variantes de escape mediante la realización de la HI. Nota: Los anticuerpos HI-activo bloquean HA participación de adornos de ácido siálico en las células diana. Por lo tanto, un virus en presencia de su anticuerpo cognado pierde la capacidad de aglutinar glóbulos rojos (presencia de pellets de RBC). Teóricamente, escape variantes de anticuerpos HI-active pueden todavía atar ácido siálico motivos incluso en presencia de su anticuerpo cognado y así pueden aglutinar los glóbulos rojos (no pellet de RBC). Si la altura del anticuerpo de interés es todavía perceptible, repetir el protocolo de paso 2.1.2 con una mayor concentración partida del anticuerpo. Protocolo 2: anticuerpos HI-positivo/negativo neutralización ( figura 3B ) Nota: para generar variantes de escape contra la neutralización de anticuerpos que no HI actividad, el virus debe ser pasado en presencia de cantidades crecientes de anticuerpos. Las células MDCK la placa en una placa de 6 pozos a una densidad de 1 x 10 6 células/pocillo e incubar durante un mínimo de 4 h en una incubadora de 37 ° C (con 5% CO 2). Diluir la acción de virus 10 6 PFU/mL o el virus del paso anterior en el 1 x MEM con tripsina tratada TPCK (1 μg/mL) en un volumen de 500 μl. Preparar una sola dilución de anticuerpo (0,02 mg/mL para el pasaje original o superior para todos después de pasajes) en 1 x MEM con tripsina TPCK tratados en un volumen de 250 μl. Mix 250 μl de virus diluido con 250 μl de anticuerpo diluido (+ anticuerpo) o 250 μl de 1 x MEM (no control del anticuerpo). Incubar la mezcla del anticuerpo del virus por 30 min en una incubadora de 37 ° C (con 5% CO 2). Aspirado los medios de comunicación utilizando un vidrio Pasteur pipeta y lavan la monocapa de células con 1 mL de 1 X PBS. Añadir 500 μl de las mezclas en los pocillos e incubar en una incubadora de 37 ° C (con 5% CO 2) durante 1 h. Después de 1 h, complementar los pozos con 2 mL de 1 x MEM con tripsina tratada TPCK (1 μg/mL). Comprobar las células en las 48 h post-infección signos de efecto citopático (CPE) en el microscopio o realizar un ensayo de hemaglutinación para la detección de crecimiento viral 26. Si hay bruto CPE en las culturas con anticuerpos, recoger el sobrenadante en cryo-tubos múltiples, la etiqueta con el paso número y conservar a -80 ° C. Guardar 100 μl del sobrenadante para infectar una monocapa fresca de MDCKs con 2 mL de 1 x MEM suplementado con tripsina TPCK y anticuerpo. No olvide no incluir ningún control del anticuerpo para cada paso. Nota: Aumentar la concentración del anticuerpo doble (o a discreción del investigador) en el siguiente pasaje (cada dos días). Aumentar la concentración de anticuerpo en cada paso sucesivo, hasta que el crecimiento del virus es todavía viable incluso con una concentración final de 0.6 mg/mL de anticuerpos. Congelar los frascos múltiples del sobrenadante de cada paso y almacenan a -80 ° C. Nota: El no control del anticuerpo es crucial para verificar el crecimiento del virus de un pasaje a otro. Si hay bruto CPE en el no control del anticuerpo, pero no CPE en la + grupo de anticuerpos, esto indica que la concentración del anticuerpo era demasiado alta y no variantes de escape fueron generadas. Si hay bruto CPE en el no control del anticuerpo, pero solamente moderado CPE en el grupo de anticuerpos, esto indica la presencia de posibles variantes de escape. En el siguiente pasaje, aumentar el volumen de paso a 200 μL del sobrenadante y mantener la concentración de anticuerpo para aumentar la probabilidad de generar variantes de escape. 3. Aislamiento de variantes escapar a través de la purificación de placa las células MDCK la placa en una placa de 6 pozos a una densidad de 1 x 10 6 células/pocillo e incubar durante un mínimo de 4 h en una incubadora de 37 ° C (con 5% CO 2). Diluir los anticuerpos en 1 x MEM con tripsina TPCK tratados a partir de 300 μg/mL en un volumen de 250 μl y mezclar con 250 μl de virus mutante de escape correspondiente. Pasados en ausencia de anticuerpos de virus debería ser placa purificada. Aspirar los medios de comunicación de las células, lavar con PBS 1 x tres veces y agregar el entero 500 μl de la mezcla de anticuerpo del virus (paso 3.2). Incubar las placas durante 1 h en una incubadora de 37 ° C (con 5% CO 2) asegurándose de roca ida y vuelta cada 10 minutos para evitar la sequedad de la monocapa. Aspire las mezclas de anticuerpo del virus y llenar los pozos con medios de agar de recubrimiento que contienen cantidades correspondientes de anticuerpo (300 μg/mL; paso 3.2). Incubar la placa de 40-44 h en una incubadora de 37 ° C (con 5% CO 2). Las placas visibles del círculo con un marcador de color azul o negro para facilitar la selección de la placa. Pick cuatro placas para cada uno escapan de anticuerpo del virus mutante, así como virus de tipo salvaje que fueron pasados en huevos en ausencia de anticuerpos o células MDCK. Suspender la placa en 100 μl de PBS 1 x. Inyectar la entera 100 μl de virus mutante de escape purificado placa 10 – viejos huevos de pollo embrionados SPF. Incubar los huevos de 40-44 h en una incubadora de 37 ° C (sin 5% CO 2). Realizar un ensayo de hemaglutinación para confirmar la presencia de virus (paso 1.1). 4. Extracción de RNA Viral y análisis de HA secuencia de variación Extracto de RNA viral de 200 μL de fluido alantoideo infeccioso del virus mutante de escape con una mono-fásica solución de fenol con isotiocianato de guanidina. PRECAUCIÓN: El fenol es un reactivo líquido volátil que puede causar tos, dificultad para respirar y moderadamente irrita la piel por contacto. Amplificar el segmento HA partir de RNA viral con el uso de una transcriptasa inversa y cartillas gene-específicas de la gripe A HA segmento 27. Nota: Los iniciadores universales para virus de la gripe B se describe en la tabla 2 amplifican tanto la HA (~ 1.800 bp) y la NA (~ 1.500 bp) 28. Resolver el producto de RT-PCR en un gel de agarosa al 1% y recortar la banda de tamaño correcto (~ 1.800 bp). Gel extracto del producto PCR utilizando un procedimiento de purificación de sílice-membrana base y enviar el cDNA para secuenciación. Identificar los residuos de aminoácidos requeridos para la Unión de anticuerpos distinguiendo las mutaciones encontradas en variantes de escape supuesta y pasados virus de tipo salvaje debido a la adaptación de la cultura de célula o selección inmunológica. Clonar el producto PCR que contiene el tipo salvaje o variante HA de escapar en un vector de expresión de pCAGGs (NotI y NheI). Unión de anticuerpo a la variante de escape HA puede evaluarse con una de dos opciones (o ambas) se describe más adelante. 5. Anticuerpo vinculante análisis de escapar variantes células 293T de inmunofluorescencia la placa a una densidad de 2 x 10 4 células/pozo en una placa de 96 pocillos e incubar en la incubadora de 37 ° C (con 5% CO 2) durante 24 h. Transfectar las células con 0.10 μg/pocillo de la pCAGGS plásmidos codifican el mutante de escape HA, virus pasados HA y HA de tipo salvaje (unpassaged) con el uso de un reactivo de transfección. Incubar las placas de 96 pozos durante 48 h en incubadora de 37 ° C (con 5% CO 2). Fix con 100 μl de paraformaldehído al 0.5% durante 15 min a TA. PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es un reactivo líquido volátil que puede causar tos, dificultad para respirar y moderadamente irrita la piel por contacto. Ha sido designado como un potencial carcinógeno humano. Adición del reactivo debe realizarse en una campana química ventilación. Lavado con PBS 1 x tres veces. Bloque con leche de 5% en PBS 1 x por 1 h a RT. Lavado con PBS 1 x tres veces. Incubar con 5 μg/mL del anticuerpo de interés por 1 h a RT. Incubar con 100 μl de anticuerpo secundario (humana o anti-ratón Alexa 488) a una dilución de 1:2,000 en 1 x PBS/1% BSA durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Lavado con PBS 1 x tres veces. Observar las células en un microscopio de fluorescencia para tinción positiva o negativa. Activado por fluorescencia de la célula clasificación (FACS) las células 293T la placa a una densidad de 2 x 10 5 células/pozo en una placa de 6 pozos e incuban a 37 ° C (con 5% CO 2) por 24 h. Transfectar las células con 0.50 μg/pocillo con pCAGGS plásmidos codifican el mutante de escape HA, virus pasados sólo HA y HA de tipo salvaje con el uso de un reactivo de transfección. Incubar las placas de 6 pozos durante 48 h a 37 ° C (con 5% CO 2). Después de 48 h, aspirar el medio de crecimiento y lavar con PBS 1 x dos veces suavemente (Asegúrese de que la monocapa es imperturbada). Cosechar las células 293T transfected con 500 μl de tampón FACS (1 x suero de ternera fetal de PBS/2%). Nota: Tampón FACS debe ser previamente enfriada a 4 º c antes de su uso. Centrifugar las células 293T cosechados a 300 x g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar el tampón FACS y resuspender con 200 μL de tampón FACS que contiene mAbs de interés (concentración final de 1 a 5 μg/mL). Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos Centrifugar las células a 300 x g durante 5 minutos a 4 ° C. lavado dos veces con 500 μl de tampón FACS. Aspirar cuidadosamente con un vaso de pipeta Pasteur en cuanto a no perturbar el sedimento. Resuspender con 200 μL de tampón FACS que contiene anticuerpo secundario conjugado a Alexa 488 (dilución final de 1:1, 000). Incubar en la oscuridad a 4 ° C durante 20 min Centrifugar las células a 300 g durante 5 min a 4 ° C. lavado dos veces con 500 μl de tampón FACS y Aspire cuidadosamente el tampón de lavado. Suspender en 500 μl de tampón FACS y evaluar atascamiento de mAbs o policlonales sera a las células transfectadas con HA por FACS. Nota: No olvide incluir un sin control de sueros policlonales/mAb como una muestra de untransfected en el experimento de.