جيل متغيرات الهروب من تحييد الأجسام المضادة فيروس الإنفلونزا
Summary
يصف لنا أسلوب الذي علينا أن نحدد المخلفات الحيوية المطلوبة لربط الإنسان أو مورين الأجسام المضادة التي تستهدف الفيروسية هيماغلوتينين لفيروسات الإنفلونزا أ. البروتوكول يمكن تكييفها لأخرى glycoproteins سطح الفيروس وعلى الأجسام المضادة لتحييد المقابلة.
Abstract
فيروسات الإنفلونزا يحمل قدرة رائعة على التكيف والتملص من الاستجابة المناعية المضيف. طريقة واحدة عن طريق مستضدي التغيرات التي تحدث في جليكوبروتينس السطحي للفيروس. جيل الهروب المتغيرات وسيلة قوية في توضيح كيفية الهروب الفيروسات الكشف المناعي وتحديد بقايا الحاسمة اللازمة لربط الأجسام المضادة. هنا، نحن تصف بروتوكولا حول كيفية إنشاء متغيرات الهروب فيروس الإنفلونزا أ عن طريق استخدام الإنسان أو مورين مونوكلونل (مابس) الموجهة ضد هيماغلوتينين الفيروسية (هكتار). باستخدام تقنية لدينا، نحن سابقا تتميز المخلفات الحيوية المطلوبة لربط الأجسام المضادة التي تستهدف رأس أو ساق رواية إنفلونزا الطيور H7N9 هكتار. البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لأنظمة الفيروسات الأخرى. تحليل المتغيرات الهروب مهمان للنمذجة الانجراف مستضدي، تحديد النوكليوتيدات واحدة مجمع الأشكال المتعددة (بطانات) منح المقاومة واللياقة البدنية، والفيروسات، وفي تصميم لقاحات أو علاجات.
Introduction
مماثلة لفيروسات الرنا أخرى، تمتلك فيروسات الإنفلونزا A بوليميراز عرضه لخطأ الذي يسمح لتوليد عدد كبير من المتغيرات مستضدي مع كل جولة من النسخ المتماثل1،،من23. فيروس الإنفلونزا لديه قدرة مذهلة على التكيف والتملص من الاستجابة المناعية البشرية عن طريق الانجراف مستضدي، الذي يتحقق من خلال تراكم الطفرات في glycoproteins السطحي الذي يؤدي إلى فقدان جسم ملزمة. الانجراف مستضدي من glycoproteins السطحية الفيروسية، هكتار والنورامينيداز (غ)، يقتضي ضرورة إعادة صياغة وإدارة اللقاح سنوياً.
التقدم التكنولوجي في العزلة وتوليد أجسام مضادة محددة مستضد قد أسفرت عن عدد كبير من مابس المستحثة بلقاح4،5،6،،من78. بدوره، الوصف [ابيتوبس] مابس على نطاق واسع تحييد فيروسات الإنفلونزا أ ساعد إلى حد كبير تطوير عدة الإنفلونزا العالمي لقاح المرشحين9،،من1011، 13،،من 1214. توضيح بصمة مستضدي من ماب يكشف عن المحددات الهيكلية لتحييد ويسمح بأسلوب مدروس نحو تصميم اللقاح. ومع ذلك، واقعي ولا فعالة من حيث التكلفة لمختبرات هيكلياً يميز لوحات واسعة من مابس عن طريق البلورات بالأشعة السينية أو المجهر الإلكتروني cryo بغية تعيين [ابيتوبس] على مستضد الفيروسية15، 16 , 17 , 18.
علم البلورات بالأشعة السينية أو المجهر الإلكتروني البرد يتطلب معدات غالية الثمن والتقنيات المتخصصة، ويحتمل أن تكون كمية واسعة من الوقت لتوليد البيانات. هو نهج بديلة وأسرع باستخدام الجيل السريع السكان الفيروسية المتنوعة عن طريق الحمض النووي الريبي عرضه للخطأ–تعتمد على الحمض النووي الريبي بوليميراز لتوليد طفرات الهروب لتحديد [ابيتوبس] مابس19،20، 21،،من2223. لا يتطلب أي معدات خاصة أو تقنية توليد المتغيرات الهروب ويمكن تنفيذها مع الكواشف المخبرية التقليدية والمعدات.
هنا، يمكننا وصف أسلوب يسمح لرسم خرائط للبقايا الحرجة اللازمة لربط ماب التي تعترف بالإنفلونزا هكتار.
Protocol
تنبيه: هناك عدد من فيروسات الإنفلونزا المنتشر في السكان (مثلاً، H1، H3) هي مسببات فئة المستوى 2 السلامة البيولوجية التي يجب أن تعالج بعناية ومعدات الحماية الشخصية المناسبة. التعامل مع الفيروسات يجب أن يوافق “مجلس المراجعة المؤسسية”. وأقر البروتوكول التالي “مجلس المراجعة المؤسسية” في جبل سيناء. ملاحظة: يمكن عموما تصنيف الأجسام المضادة ها الخاصة التي تمنع النسخ المتماثل الفيروسية في ط) تلك التي تربط المعني أو المجاورة لموقع مستقبلات ملزم على قمة الرأس كروي والثاني) تلك التي تربط القاصي الربط مستقبلات المجال، والتي تشمل الجانب الأفقي كروي الرأس ومنطقة ساق ها. الأجسام المضادة التي تستهدف الموقع ملزم مستقبلات منع الاستعانة بزخارف الحامض اللعابي على سطح الخلايا المستهدفة، ويمكن أن تقاس باستخدام مقايسة تثبيط (مرحبا) هيماجلوتينيشن. الأجسام المضادة التي هي مرحبا–السلبية، مثل الأجسام المضادة ساق محددة، يمكن أن لا تزال تمنع النسخ المتماثل الفيروسية، ولكن لا يمكن تقييم استخدام فحوصات تحييد. 1. “تصنيف الأجسام المضادة استناداً إلى تحييد أنشطة” ومرحبا مرحبا بالانزيم في صفيحة الخامس-أسفل 96، حسنا، إضافة 25 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x في الأعمدة من 2 إلى 12. تمييع 7B2 ماب (الخاصة بالرأس)، 6F12 (ساق على حدة) 23 وعنصر تحكم ايستب إلى 100 ميكروغرام/مل في 1 x برنامج تلفزيوني وميليلتر 50 الكوة التحضيرية جسم المخفف في العمود 1. وتشمل أيضا عنصر تحكم “ماب” لا بإضافة 50 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x ( الشكل 1A). إجراء تخفيف المسلسل إضعاف من الأجسام المضادة بنقل 25 ميليلتر من العمود 1 إلى العمود 2، وهكذا. تجاهل في آخر 25 ميليلتر من العمود 12 ( الشكل 1A). ملاحظة: تأكد من تضمين صف من أي سيطرة جسم. تمييع مخزون الفيروسات (فيروس يحتوي التعبير عن ها ونا من A/كاليفورنيا/04/09 مع الأجزاء الداخلية من A/Puerto ريكو/8/34) إلى هيماجلوتينيشن 8 وحدات/25 ميليلتر تضعف الفيروس الأسهم. إضافة 25 ميليلتر من مخزون الفيروس المخفف (8 هيماجلوتينيشن) لكل بئر (الصفوف A إلى G)- ملاحظة: يجب أن يكون المخلوط جسم والفيروس وحدة تخزين نهائي من 50 ميليلتر بتركيز نهائي ابتداء من 50 ميكروغرام/مل. إينكوباتي اللوحة في درجة حرارة الغرفة (RT) عن 45 دقيقة للصف الخلفي-المعايرة (ح)، إضافة 50 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x على الآبار H2 إلى H12. إضافة 100 ميليلتر من 8 hemagglutination وحدات/25 ميليلتر جيدا H1. متسلسل تمييع شقين بنقل 50 ميليلتر من H1 إلى H2، وهلم جرا. تجاهل في آخر 50 ميليلتر من H12 جيدا. وأخيراً، إضافة 50 ميليلتر من 0.5% الدجاج خلايا الدم الحمراء (RBC) لجميع الآبار من الخامس-أسفل لوحة 96-جيدا- ملاحظة: يجب أن يكون العينات ماب في مقايسة وحدة تخزين نهائي من 100 ميليلتر: ماب (25 ميليلتر)، الفيروس (25 ميليلتر) وربك (50 ميليلتر). ينبغي أن تحتوي على وحدة التخزين النهائي لعنصر التحكم “ماب” لا 25 ميليلتر من 1 × برنامج تلفزيوني، 25 ميليلتر من الفيروسات و 50 ميليلتر من ربك. إينكوباتي لوحة عند 4 درجة مئوية حاء – 1 بصريا قراءة اللوحات للنشاط مرحبا. إذا كان هناك قراءات إيجابية لجسم معين، انتقل إلى الخطوة 2.1 لإنشاء متغيرات الهروب. إذا كانت الجسم سالب مرحبا، تابع أدناه الخطوة 1.2 لتقييم إذا كان جسم تحييد نشاط الإنزيم ثقافة خلية. ملاحظة: يشار قراءات إيجابية من ماب النشطة مرحبا بيليه ربك أحمر داكن في وسط بئر ( الشكل 1B ؛ 7B2) التي ستشكل قطره المسيل للدموع عندما تعقد الخامس-أسفل لوحة 96-جيدا بزاوية 45 درجة. وستشكل قراءات سلبية لا بيليه ربك أحمر داكن في البئر ( الشكل 1B ؛ 6F12 ولا ماب). لا سيشكل عنصر التحكم ايستب أيضا بيليه ربك أحمر داكن وتبدو متطابقة لجسم ساق على حدة أو 6F12 أو الإنسان والمحيط الحيوي لا تسيطر عليها العينة ( الشكل 1B) 23- درياقي بالانزيم خلايا لوحة مدين داربي الكلاب الكلي (مدك) في كثافة من 2 × 10 4 خلايا/بئر في ثقافة الأنسجة تعامل لوحة 96-جيدا واحتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO 2 لح 17 إلى 19 . ملاحظة: الخلايا يمكن أيضا أن يسمح لتنضم إلى أسفل البئر للحد ني ح 4 قبل الاستخدام. في لوحة 96-بئر منفصلة، نفذ سبعة 3-fold تخفيف المسلسل من ماب البشرية 4 د 05 5، CR9114 17 أو ايستب مفتش مراقبة، في تركيز ابتداء من 200 ميكروغرام/مل في 1 × الحد الأدنى الأساسية المتوسطة (MEM) تستكمل مع توسيل فينيلالانيل ثاني ميثيل كيتون (تبكك)-معاملة التربسين (1 ميكروغرام/مل) ( الشكل 2). ملاحظة: ينبغي أن يتضمن الصف A ميليلتر 75 من جسم المخفف (ابتداء من تركيز 200 ميكروغرام/مل). متسلسل تمييع (3-fold) إلى أسفل اللوحة بنقل 25 ميليلتر من الصف أ إلى “ب الصف”، وهلم جرا. يجب أن تحتوي الصفوف A إلى ح وحدة تخزين نهائي من 50 ميليلتر. ليست هناك حاجة لتغيير نصائح بين التحويلات تمييع. يضعف مخزون فيروس (فيروس انغماد الإعراب عن ها ونا من A/شانغهاي/1/13 مع الجزء الداخلي من A/Puerto ريكو/8/34) إلى 100 من زراعة الأنسجة 50% الجرعة المعدية (تسيد 50)/50 ميليلتر في 1 x MEM تستكمل مع معاملة تبكك التربسين (1 ميكروغرام/مل) 24. إضافة 50 ميليلتر/جيدا من الفيروس المخفف للتحضيرات جسم (الخطوة 1.2.2). إضافة 50 ميليلتر من 1 X MEM لآبار مراقبة الخلية مصابة. احتضان الخلائط أضداد الفيروس في حاضنة 37 درجة مئوية (مع 5% CO 2) حاء 1 ملاحظة: يجب أن يكون الخلائط الفيروس أضداد إجمالي حجم 100 ميليلتر: 50 ميليلتر من جسم تمييع (الخطوة 1.1.2) و 50 ميليلتر من الفيروسات التي تحتوي على 100 تسيد 50 (الخطوة 1.2.3). نضح وسائط الإعلام في الآبار، وإضافة ميليلتر 100 أسرة من الخلائط أضداد الفيروس إلى الآبار المقابلة. ملاحظة: التطلع ويتم ذلك باستخدام محول المضخة 8-قناة يعلق على فراغ. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام بئر 8 أو 12 الأقنية صغيرة ماصة نضح يدوياً. يتم تطلع جميع أثناء إزالة العدوى أو يغسل من أعلى تركيز لجسم إلى أدنى، دون الحاجة إلى تغيير نصائح. أغسل أحادي الطبقة مع 200 ميليلتر من 1 x PBS. نضح 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x (كما هو الحال في الخطوة 1.2.5). تكرار الغسيل مرة أخرى ليصبح مجموع يغسل اثنين. تصيب أحادي الطبقة الخلايا مدك بإضافة 100 أسرة ميليلتر/البئر المخاليط جسم مضاد الفيروسات (من الخطوة 1.2.4) أحادي الطبقة وتصيب/احتضان عند 37 درجة مئوية (مع 5% CO 2) حاء – 1 أثناء العدوى، في لوحة 96-بئر منفصلة، إعداد مجموعة أخرى من تخفيف الأجسام المضادة. إضافة 150 ميليلتر من 100 ميكروغرام/مل من جسم كل منهما في صف ألف و 100 ميليلتر من س 1 MEM تكملها مع معاملة تبكك التربسين (1 ميكروغرام/مل) في “الصفوف ب” إجراء H. 3-fold تخفيف نقل 50 ميليلتر من الصف A إلى B صف ، وهكذا دواليك، وصولاً إلى تجاهل الصف H. ميليلتر آخر 50 من “الصف ه.” الحجم الإجمالي لكل جيدا يجب أن يساوي 100 ميليلتر. جانبا. ملاحظة: هي تضعف الأجسام المضادة في x 1 MEM تستكمل مع معاملة تبكك التربسين (1 ميكروغرام/مل). نضح العدوى الفيروس أضداد من أحادي الطبقة في خطوة 1.2.7 وتجديد مع 100 أسرة ميليلتر/البئر لتمييع جسم مناسبة إعدادها في الخطوة 1.2.8- ملاحظة: إذا كان الوارد أيضا كما ينبغي أن يتضمن تركيز الضد نهائي من 100 ميكروغرام/مل خلال العدوى (الخطوة 1.2.7)، ثم وسائل الإعلام تجديد تركيز الأجسام المضادة نهائية من 100 ميكروغرام/مل (الخطوة 1.2.8)- إينكوباتي على 24 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية (مع 5% CO 2)- نضح الوسائط من لوحات 96-جيدا وتغسل ثلاث مرات مع 200 ميليلتر/جيدا لبرنامج تلفزيوني س 1- إصلاح الخلايا مع 100 ميليلتر الباردة الأسيتون 80% ح 1 في-20 درجة مئوية. ملاحظة: هو تمييع الحل الأسيتون 80% في المقطر مزدوجة (دد) ح 2 س (مثلاً، 80 مل من الأسيتون 100% بالإضافة إلى 20 مل ddH 2 0). يمكن برود الحل الأسيتون 80% على الجليد قبل الاستخدام. تغسل الخلايا من برنامج تلفزيوني X 1 200 ميليلتر/جيدا ثلاث مرات- كتلة اللوحات مع 200 ميليلتر/جيدا من الحليب 5% المخفف في برنامج تلفزيوني X 1 واحتضان لوحات على RT حاء – 1 إضافة 100 ميليلتر من بيوتينيلاتيد المضادة الإنفلونزا جسم الابتدائي البروتين النووي (NP) المخفف 1:2,000 في 1 × PBS/1% ألبومين المصل البقري (BSA) واحتضان لوحات في RT 1 h. ملاحظة: للبحث عن فيروسات الإنفلونزا ب، جسم NP المضادة خاصة بفيروس إنفلونزا ب يجب استخدام. يغسل اللوحات مع برنامج تلفزيوني 1 x ثلاث مرات. إضافة 100 ميليلتر من فجل الحصان streptavidin البيروكسيديز (HRP) جسم المتقارنة المخفف 1:3,000 في 1 × PBS/1% جيش صرب البوسنة، واحتضان اللوحات على RT حاء – 1 يغسل اللوحات مع 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x ثلاث مرات. إضافة كاشف الركازة HRP في 100 ميليلتر/بئر واحتضانها في الظلام في الرايت ملاحظة: ينبغي أن يكون الأمثل وقت الحضانة قبل إضافة المخزن المؤقت إيقاف الحمضية (أدناه). وبصفة عامة، من 15 إلى 30 دقيقة كافية. إخماد رد فعل مع 50 ميليلتر/بئر 5 M HCl. تنبيه: 5M HCl هو كاشف أكالة العالية التي يمكن أن تسبب الضرر للعيون والجلد والأغشية المخاطية. وينبغي أن يتم إضافة هذا الكاشف تحت غطاء تنفيس مع معدات الحماية الشخصية المناسبة. قراءة اللوحات في 492 نانومتر وطرح الآبار الخلفية (الخلايا مصابة). حساب النسبة المئوية تثبيط بالصيغة التالية: إذا كان جسم مضاد لتحييد نشاط (وأي نشاط مرحبا)، انتقل إلى الخطوة 2، 2- ملاحظة: سوف تفتقر إلى الأجسام المضادة التي تفتقر إلى النشاط في المختبر تحييد نشاط مرحبا. 2. جيل من “الهروب من المتغيرات المسخ” ملاحظة: يتم تحليل تحييد الأجسام المضادة التي أو انعدام النشاط مرحبا كذلك مع البروتوكولات المحددة المبينة أدناه. 1 البروتوكول: مرحبا–الإيجابية/تحييد-إيجابية الأجسام المضادة ( الشكل 3A ) إعداد مخزون فيروس من 10 البلاك 6 تشكيل وحدات/المليلتر (بفو/mL) في برنامج تلفزيوني 1 x في وحدة تخزين 400 ميليلتر. يعد تخفيف أربعة من الأجسام المضادة فائدة في زيادة تركيزات (مثلاً، 0، 0.5، 0.05 و 0.005 ملغ/مل) في س 1 برنامج تلفزيوني في حجم 100 ميليلتر لتمييع. ملاحظة: دائماً يجب أن تكون باساجيد في نفس الوقت، وفي حالة عدم وجود جسم البرية من نوع الفيروس. تسلسل هذه الفيروسات باساجيد سوف يساعد في التمييز بين التكيف مع الخلية ظروف الثقافة والهروب من الطفرات. ميكس 100 ميليلتر من 10 6 بفو/مل فيروسات مع 100 ميليلتر لتمييع كل جسم أو 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 س. إينكوباتي ح 1 في حاضنة 37 درجة مئوية (مع 5% CO 2). الدوامة بإيجاز. ضخ 200 ميليلتر من كل خليط في بيض الدجاج امبريوناتيد (SPF) الممرض محددة مجاناً- احتضان البيض في 37 درجة مئوية (دون CO 2) عن 40-44 ه. التضحية بالبيض امبريوناتيد المصابين بالفيروس التي تفرخ في 4 درجات مئوية لمدة أدناها 6 ه. الحصاد السائل الانتويك من البيض، كما هو موضح سابقا 24 ، 25- تنفيذ المقايسة هيماجلوتينيشن، كما هو موضح أعلاه 24 ، 26. إذا لم يكن لديك كافة الاستعدادات السوائل الانتويك hemagglutination التتر، كرر من الخطوة 2 مع تخفيف جسم تتراوح بين 0.005 ملغ/مل 0.00005 mg/mL. ملاحظة: قد تشبع تركيز جسم إيجابية مرحبا تحييد جميع جزيئات الفيروس الحالي. ولذلك، قد يكون من الضروري خفض كمية الأجسام المضادة موجودة في باساجينج. تأكيد المتغيرات الهروب عن طريق إجراء مرحبا الاعتداء 24 (الخطوة 1، 1)- ملاحظة: كتلة الأجسام المضادة النشطة مرحبا الاشتباك هكتار من زخارف الحامض اللعابي في الخلايا الهدف. ولذلك تفقد فيروس حضور جسم المشابهة لها القدرة على أجلوتيناتي كرات الدم الحمراء (وجود بيليه ربك). نظرياً، المتغيرات الهروب من الأجسام المضادة النشطة مرحبا لا يزال يمكن ربط زخارف الحامض اللعابي حتى في وجود جسم المشابهة لها وهكذا يمكن أجلوتيناتي كرات الدم الحمراء (لا ربك بيليه). إذا ما زالت قابلة للكشف مرحبا الضد مصلحة، كرر البروتوكول من الخطوة 2.1.2 مع انطلاق أعلى تركيز للجسم. 2 البروتوكول: مرحبا-السلبية/تحييد-الإيجابية الأجسام المضادة ( الشكل 3B ) ملاحظة: بغية توليد المتغيرات الهروب ضد تحييد الأجسام المضادة التي تفتقر إلى مرحبا النشاط، يجب أن يكون باساجيد الفيروس حضور مقادير متزايدة من الأجسام المضادة. الخلايا “مدك لوحة” في لوحة 6-جيدا في كثافة 1 × 10 6 خلايا/حسنا واحتضانها للحد ني ح 4 في حاضنة 37 درجة مئوية (مع 5% CO 2)- يضعف مخزون الفيروس إلى 10 6 بفو/مل أو الفيروس من المقطع السابق في 1 × MEM مع معاملة تبكك التربسين (1 ميكروغرام/مل) في وحدة تخزين 500 ميليلتر. إعداد إضعاف واحد من الأجسام المضادة (0.02 مغ/مل لمرور الأصلي أو أعلى بالنسبة لكل بعد الممرات) في 1 × MEM مع التربسين تبكك تعامل في وحدة تخزين 250 ميليلتر. ميكس 250 ميليلتر من الفيروس المخفف مع 250 ميليلتر من جسم المخفف (+ جسم) أو 250 ميليلتر من 1 × MEM (لا مراقبة الأجسام المضادة)- احتضان الفيروس أضداد الخليط لمدة 30 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية (مع 5% CO 2)- أسبيراتي وسائل الإعلام استخدام زجاج باستور “الماصة؛” وتغسل أحادي الطبقة الخلايا مع 1 مل من 1 X PBS. إضافة 500 ميليلتر من الخلائط في الآبار واحتضان في حاضنة 37 درجة مئوية (مع 5% CO 2) حاء – 1 بعد ح 1، تكملة الآبار مع 2 مل 1 × MEM مع معاملة تبكك التربسين (1 ميكروغرام/مل). التحقق من الخلايا في الإصابة بعد انتهاء ح 48 عن علامات من تأثير سيتوباثيك (CPE) في المجهر أو القيام فحص هيماجلوتيناتيون للكشف عن النمو الفيروسي 26- إذا كان هناك إجمالي CPE في الثقافات وتستكمل مع الأجسام المضادة، حصاد المادة طافية في البرد-أنابيب متعددة، والتسمية مع مرور عدد ومخزن في-80 درجة مئوية. حفظ 100 ميليلتر من المادة طافية لتصيب من أحادي الطبقة طازجة من مدكس مع 2 مل س 1 MEM تستكمل مع تبكك-التربسين والأجسام المضادة. تذكر أن تقوم بتضمين عنصر تحكم جسم لا لكل مرور. ملاحظة: زيادة تركيز الجسم من شقين (أو وفقا لتقدير الباحث) في المقطع التالي (كل يومين). بزيادة تركيز الضد في كل مرور المتعاقبة حتى نمو الفيروس لا تزال قابلة للتطبيق حتى بتركيز نهائي من 0.6 ملغ/مل من الأجسام المضادة. تجميد قارورة متعددة من المادة طافية كل ممر وتخزينها في-80 درجة مئوية. ملاحظة: عنصر التحكم لا جسم أمر حاسم في التحقق من نمو الفيروس من إصدار واحد إلى آخر. إذا لم يكن هناك CPE الإجمالي في جسم لا عنصر التحكم، ولكن لا CPE في + مجموعة الأجسام المضادة، وهذا يدل على أن تركز الجسم مرتفع جداً وقد ولدت لا متغيرات الهروب. إذا كان هناك إجمالي CPE في عنصر التحكم لا جسم، ولكن فقط معتدلة CPE في + مجموعة الأجسام المضادة، وهذا يدل على وجود متغيرات الهروب المحتملة. في المقطع التالي، زيادة حجم المرور إلى 200 ميليلتر من المادة طافية والحفاظ على تركيز الأجسام المضادة لزيادة احتمال توليد المتغيرات الهروب. 3. عزل “المتغيرات الهروب من خلال تنقية البلاك” الخلايا “مدكك لوحة” في لوحة 6-جيدا في كثافة 1 × 10 6 خلايا/حسنا واحتضانها للحد ني ح 4 في حاضنة 37 درجة مئوية (مع 5% CO 2)- تمييع الأضداد في 1 × MEM مع التربسين تبكك المعالجة بدءاً من 300 ميكروغرام/مل في حجم 250 ميليلتر وتخلط مع 250 ميليلتر المقابلة الهروب متحولة فيروس. ينبغي أيضا أن فيروس باساجيد في حالة عدم وجود جسم اللوحة تنقيته. نضح وسائط الإعلام من الخلايا وتغسل مع برنامج تلفزيوني 1 x ثلاث مرات وإضافة ميليلتر 500 أسرة من خليط الفيروس أضداد (الخطوة 3، 2)- احتضان لوحات لح 1 في حاضنة 37 درجة مئوية (مع 5% CO 2) مع التأكد من الصخور ذهابا وإيابا كل 10 دقيقة لمنع جفاف أحادي الطبقة. نضح الخلائط أضداد الفيروس وتجديد الآبار مع تراكب أجار الوسائط التي تحتوي على المبالغ المقابلة للأجسام المضادة (300 ميكروغرام/مل؛ الخطوة 3.2)- احتضان لوحة ح 40-44 في حاضنة 37 درجة مئوية (مع 5% CO 2)- دائرة لويحات تظهر علامة زرقاء أو سوداء لون لتسهيل انتقاء اللوحة. الهروب لويحات اختيار أربعة لكل تركيبة جسم الفيروس متحولة، فضلا عن الفيروسات البرية من نوع التي تم باساجيد في خلايا مدك أو البيض في حالة عدم وجود جسم. ريسوسبيند على اللوحة في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 س. ميليلتر 100 أسرة البلاك الهروب المنقي متحولة الفيروس بحقن بيض الدجاج امبريوناتيد منتدى جنوب المحيط الهادئ 10-يوم القديمة. احتضان البيض ح 40-44 في حاضنة 37 درجة مئوية (دون 5% CO 2)- القيام فحص هيماجلوتينيشن لتأكيد وجود الفيروس (الخطوة 1، 1)- 4. استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسية واختلاف تسلسل التحليل من ها استخراج الجيش الملكي النيبالي الفيروسية من 200 ميليلتر الهروب الفيروس الطور السائل الانتويك مع حل مونو طورية isothiocyanate الفينول وغوانيدين. تنبيه: هو الفينول كاشف سائل متقلبة التي يمكن أن يسبب السعال، وضيق في التنفس واعتدال تهيج الجلد بالاتصال- تضخيم الجزء هكتار من الجيش الملكي النيبالي الفيروسية باستخدام المنتسخة العكسية والإشعال الخاصة بالجينات للأنفلونزا A ها الجزء 27- ملاحظة: تضخيم الإشعال العالمي لفيروسات الإنفلونزا ب المبينة في الجدول 2 هكتار في كلا (~ 1,800 bp) والجمعية الوطنية (~ 1,500 bp) 28- حل المنتج RT-PCR في 1% [اغروس] هلام وقطع الفرقة الحجم بشكل صحيح (~ 1,800 bp). هلام استخراج المنتج PCR باستخدام إجراء تنقية السليكا-غشاء على أساس وكدنا ترسل للتسلسل- تحديد بقايا الأحماض الأمينية المطلوبة للعثور على بدائل الهروب المفترضة والملزمة جسم بالتفريق بين الطفرات باساجيد البرية من نوع الفيروس بسبب التكيف مع ثقافة الخلية أو التحديد المناعي. استنساخ PCR المنتج المتضمن في البرية من النوع أو الهرب البديل هكتار إلى ناقل تعبير بكاجس (NotI ونهيي). يمكن تقييم ملزمة الجسم إلى متغير الهروب هكتار مع أحد الخيارين (أو كليهما) المبين أدناه- 5. جسم “ملزمة تحليلات للهروب من المتغيرات” الخلايا 293T لوحة من الفلورة في كثافة من 2 × 10 4 خلايا/بئر في صفيحة 96-جيدا واحتضانها في الحاضنات 37 درجة مئوية (مع 5% CO 2) ح 24. ترانسفيكت الخلايا مع 0.10 ميكروغرام/بئر والبلازميدات بكاجس ترميز المسخ الهروب هكتار، والفيروسات باساجيد هكتار، وها البرية من نوع (أونباساجيد) مع الاستخدام لكاشف تعداء. احتضان لوحات 96-جيدا ح 48 في حاضنة 37 درجة مئوية (مع 5% CO 2)- الإصلاح مع 100 ميليلتر من بارافورمالدهيد 0.5% لمدة 15 دقيقة في الرايت تنبيه: هو بارافورمالدهيد كاشف سائل متقلبة التي يمكن أن يسبب السعال، وضيق في التنفس واعتدال تهيج الجلد حسب جهة الاتصال. قد عين كمسرطن محتمل للإنسان. وينبغي أن يتم إضافة الكاشف في غطاء كيميائية تنفيس. الغسيل مع برنامج تلفزيوني 1 × ثلاث مرات. كتلة مع الحليب 5% في برنامج تلفزيوني 1 x ح 1 في الرايت أغسل مع برنامج تلفزيوني 1 x ثلاث مرات. احتضان مع 5 ميكروغرام/مل من الأجسام المضادة التي تهم ح 1 في الرايت إينكوباتي مع 100 ميليلتر من جسم الثانوي (488 أليكسا المضادة الإنسان أو المضادة الماوس) في إضعاف 1:2,000 في 1 × PBS/1% جيش صرب البوسنة ح 1 في RT في الظلام- أغسل مع برنامج تلفزيوني 1 x ثلاث مرات. مراقبة الخلايا على مجهر فلوري لتلطيخ إيجابية أو سلبية- Fluorescence تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) لوحة 293T الخلايا في كثافة من 2 × 10 5 خلايا/بئر في لوحة 6-جيدا واحتضان في 37 درجة مئوية (مع 5% CO 2) ل 24 h. ترانسفيكت الخلايا مع 0.50 ميكروغرام/جيدا مع البلازميدات بكاجس ترميز المسخ الهروب هكتار، والفيروسات فقط باساجيد هكتار، وها البرية من نوع باستخدام كاشف تعداء. احتضان لوحات 6-جيدا ل 48 ساعة عند 37 درجة مئوية (مع 5% CO 2)- بعد 48 ساعة، نضح وسائط الاستنبات وتغسل مع برنامج تلفزيوني 1 x مرتين بلطف (التأكد من أحادي الطبقة دون عائق). حصاد الخلايا transfected 293T مع 500 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية (1 × مصل العجل الجنين PBS/2%)- ملاحظة: يجب أن يكون المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية مبردة مسبقاً في درجة 4 مئوية قبل الاستخدام. الطرد المركزي الخلايا 293T المقطوع في 300 غرام x لمدة 5 دقائق في 4 ° C. نضح المخزن المؤقت نظام مراقبة الأصول الميدانية، وريسوسبيند مع 200 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت الذي يحتوي على مابس للفائدة (تركيز النهائية من 1 إلى 5 ميكروغرام/مل). احتضان على RT ل 20 دقيقة الطرد المركزي الخلايا في 300 غرام x لمدة 5 دقائق في 4 ° C. يغسل مرتين مع 500 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية. نضح بعناية مع كوب ماصة باستور بشأن عدم الإزعاج بيليه. ريسوسبيند مع 200 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت الذي يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية مترافق إلى أليكسا 488 (تمييع النهائي من 1:1، 000). احتضان في الظلام في 4 درجات مئوية عن 20 دقيقة الطرد المركزي الخلايا في 300 غرام لمدة 5 دقائق في 4 ° C. يغسل مرتين مع 500 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية ونضح بعناية في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي- ريسوسبيند في 500 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية وتقييم الربط من مابس و/أو [بولكلونل] سيرا إلى خلايا transfected مع ها بنظام مراقبة الأصول الميدانية- ملاحظة: تذكر أن تقوم بتضمين عنصر تحكم الأمصال ماب/[بولكلونل] لا، فضلا عن نموذج أونترانسفيكتيد في التجربة-
Representative Results
وقد استخدمنا سابقا تباينات من هذا الأسلوب لإنشاء متغيرات الهروب إلى مابس البشرية ومورين التي يسببها اللقاح المضاد لفيروس الإنفلونزا الموسمية، والتلقيح H7N9، أو متسلسلة المؤتلف الحمض النووي/هكتار البروتين التطعيم4،5 ،،من67. كما هو موضح أعلاه، اتسمت أضداد أولاً في استخدام فحوصات مرحبا ودرياقي لإبلاغنا بأي بروتوكول محدد الاستمرار بالتالي4،5. الأجسام المضادة د 07-5 03، 07-5F01، 07-5 ز 01، 07-4B03، 07-4E02 و 07-4 د 05 وجد لها مرحبا وتحييد أنشطة مكافحة فيروس إنفلونزا الطيور H7N9 (A/شانغهاي/1/2013) (الجدول 1)، وهكذا كانت تستخدم بروتوكول 1 (الخطوة 2، 1). مابس مع تحييد هذا الافتقار إلى النشاط مرحبا، مثل 41-5E04، 045-051310-2B06، 042-100809-2F04 و S6-B01 (الجدول 1)، استخدمت البروتوكول 2 (الخطوة 2، 2) لإنشاء متغيرات الهروب. وكشفت الخرائط متحولة الهروب العديد من الأجسام المضادة التي تعترف البقايا الحرجة في مواقع متميزة على الفيروسية هكتار4،5 (الشكل 4). بينما غالبية الأجسام المضادة إيجابية مرحبا قد هربا من مخلفات المسخ قرب مواقع مستضدي تم الإبلاغ عنها سابقا من “إتش 7 هكتار”، الأجسام المضادة سالب مرحبا ولدت طفرات الإفلات مع الطفرات في ساق المنطقة4،5 . جسم مضاد مرحبا النشاط النشاط نات 07-5 د 03 + + 07–5F01 + + 07-5 ز 01 + + 07–4B03 + + 07–4E02 + + 07-4 د 05 + + 41-5E04 – + 045-051310-2B06 – + 042-100809-2F04 – + S6-B01 – + الجدول 1: جدول النشاط مرحبا وتحييد الأجسام المضادة. عشرة مابس محددة H7 المعزولة من الأفراد الملقحين بلقاح H7N9 تجريبية للمعرض مختلفة في المختبر الأنشطة المضادة للفيروسات5. التمهيدي إلى الأمام (5 ‘إلى 3’) عكس التمهيدي (5 ‘إلى 3’) شروط ثيرموسيلسير عياف تاتكجتكتكاججاجكاااجكاججج أتاتكجتكتكجتاتاجتاجااكاججتجتتت 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، 94 درجة مئوية لدورات دقيقة/5 2 من 94 درجة مئوية 20 ق، 50 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 68 درجة مئوية ل 3 دقيقة 30 ثانية، تليها دورات 40 من 94 درجة مئوية 20 ثانية، 58 درجة مئوية لمدة 30 s ، و 68 درجة مئوية ل 3 دقيقة 30 ثانية مع وقت تمديد نهائي في 68 درجة مئوية لمدة 10 دقائق إيبف جججججاجكاجاجكاجاجك ككججتاتاجتاجتاكاجاجك 45 درجة مئوية 60 دقيقة, 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة, 94 درجة مئوية لدورات دقيقة/5 2 من 94 درجة مئوية 20 s, 40 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 68 درجة مئوية ل 3 دقيقة 30 ثانية، تليها دورات 40 من 94 درجة مئوية 20 s ، 58 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 68 درجة مئوية ل 3 دقيقة 30 ثانية مع وقت تمديد نهائي في 68 درجة مئوية لمدة 10 دقائق الجدول 2: الإشعال فيروس الإنفلونزا العالمي. أزواج التمهيدي لتضخيم شرائح هكتار الإنفلونزا أ27 وب28 الفيروسات وظروف كل منها ثيرموسيكلير. رقم 1: مرحبا بالانزيم. (A) A التخطيطي لإعداد مقايسة مرحبا لاختبار نشاط اثنين من الماوس الخاصة H1 مابس 7B2 (الخاصة بالرأس) و 6F12 (ساق-خاصة) باستخدام صفيحة الخامس-أسفل 96-جيدا، و (ب) مثال عن نتائج مقايسة مرحبا23. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- رقم 2: تحليل درياقي. تخطيطي لإعداد مقايسة درياقي لاختبار النشاط هما مابس البشرية 05 45 و CR911417. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 3: جيل طفرات الإفلات. سوف تعتمد على نشاط درياقي عرضت من قبل الجسم ومرحبا المنهجية المقترحة. تحييد الأجسام المضادة إيجابية مرحبا توليد طفرات الهروب ضد (A) قد تتطلب فقرة واحدة في البيض، بينما (ب) تحييد سالب مرحبا الأجسام المضادة قد تنطوي على فقرات متعددة مع زيادة كميات الأضداد في زراعة الأنسجة في الخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 4: مثال على خريطة حانمه لرواية إنفلونزا الطيور H7N9 هكتار التي تم إنشاؤها مع المتغيرات متحولة الهروب. الأجسام المضادة التي يسببها اللقاح المعزولة من الأفراد تطعيم مع مرشح إنفلونزا H7N9 لقاح استخدمت لإنشاء متغيرات متحولة الهروب. كل بقايا المشار إليه في الحمراء ويمثل موقع الأحماض الأمينية الهامة اللازمة لكفاءة ربط ماب. وكانت بيانات مقتبسة من هنري دوناند et al.، 20154. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
على الرغم من أن غالبية المخلفات المحددة عن طريق طفرات الهروب كانت دقيقة، واحدة من المحاذير الرئيسية لهذا النهج أن الطفرات من المتغيرات الهروب قد لا يتم تعيين بالضرورة داخل البصمة الجزيئية للأجسام المضادة التي يحددها التحليل الهيكلي. هذا سبب قدرة طفرة في رواسب معينة تؤدي إلى تغيير conformational القاصي إلى موقع بقايا تحور، مماثل لتأثير اللوستيريك. قيد آخر أنه لا يمكن تنفيذ هذه المنهجية لتحييد الأجسام المضادة؛ الأجسام المضادة التي تفتقر في المختبر الضغط الانتقائي لا تؤدي إلى الهروب من طفرات. ومع ذلك، يمكن التغلب على هذا القيد باستخدام لوحة المتغيرات الهروب المتولدة عن الأجسام المضادة لتحييد تتسم سابقا. تان et al. تستخدم متغير هروب من ماب تحييد الفيروس H7N9 على خريطة حانمه من جسم غير تحييد7.
ومع ذلك، توضيح [ابيتوبس] من الأجسام المضادة من خلال توليد المتغيرات الهروب يوفر بديلاً مجديا للفحص المجهري علم البلورات والبرد-إلكترون، سواء التي تتطلب استثمارات واسعة من المعدات. البدائل الأخرى لتحديد منطقة ربط الحد الأدنى من مابس استخدام ألانين المسح الضوئي أو الببتيد طفرات المسح الضوئي/الاقتطاع. ألانين مسح الطفرات قد تتطلب قدرا كبيرا من العمل في توليد عدد كبير من المتغيرات أثناء فحص29، بينما المسح الببتيد يقتصر على خطي [ابيتوبس]30. الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول لا يتطلب أي معدات خاصة أو تقنية، وفي الواقع، يجعل استخدام الموجودة في المختبر تحييد فحوصات تعديلها لإنشاء متغيرات الهروب من الأجسام المضادة التي تهم.
البروتوكول المتعلق بتوليد المتغيرات الهروب التي تتطلب فقرات متعددة (مثلاً، الأجسام المضادة الخاصة بساق) يعتمد اعتماداً كبيرا على انطلاق تركيز الأجسام المضادة في المرور 0. فمن الأفضل أن يخطئ على جانب من الحذر وتبدأ في سجل إلى نصف سجل أقل من نصف تركيز المثبطة القصوى لجسم ويسمح بنمو الفيروس قوية. ويمكن التكهن الباحث أن ثقافة فيروس عيار عالية حضور الضغط المنخفض المناعية اختلاف الوراثي كبير في السكان الفيروسية. يمكن تحديد المتغيرات الهروب لطريق تدريجيا زيادة تركيز الأجسام المضادة في المقاطع التالية. في حال أن ينخفض نمو الفيروسات، يمكن زيادة كمية المادة طافية الفيروسية في المقطع التالي مع المحافظة على نفس القدر من تركيز الأجسام المضادة في المقطع السابق.
ويهدف معظم لقاحات الإنفلونزا العالمي للحصول على رد جسم قوية نحو منطقة ساق ها. تحليل المتغيرات الهروب إلى الأجسام المضادة الخاصة بساق مهمان في تحديد العلاقة بين اللياقة فيروس الإنفلونزا والضغط المناعية. من المثير للاهتمام، الهروب متحولة الفيروسات الناتجة عن مابس الخاصة بساق كانت الموهنة كل في فيفو في مورين LD50 دراسات4. وتوفر هذه الدراسات حجة قوية للأنظمة الأساسية المستندة إلى ساق التطعيم. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد طفرات الهروب إلى غيرها من المركبات المضادة للفيروسات، مثل مثبطات جزيء صغير. وأخيراً، هذه المنهجية لا يقتصر على فيروس الإنفلونزا glycoproteins السطحية، ولكن يمكن أيضا أن تطبق على نطاق واسع لتحديد [ابيتوبس] من أخرى glycoproteins الفيروسية.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا المشروع في الجزء مع الأموال الفيدرالية من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية، والمعاهد الوطنية للصحة، وزارة الصحة والخدمات الإنسانية، تحت سيرس العقد HHSN272201400008C (كيه)؛ المعاهد الوطنية للصحة U19AI109946-01 (كيه)؛ و P01AI097092-04S1 (P.E.L.).
Materials
| Falcon 96-well clear flat bottom TC-treated culture microplate with Lid | Corning, Inc. | 353072 | Assay plate use for the microneutralization assay |
| Falcon 96-well clear V-bottom plate | Corning, Inc. | 353263 | Assay plate use for the hemagglutination inhibition assay |
| 1X Minimal Essential Medium (MEM) | Gibco | 11095080 | Infection medium |
| Tosyl phenylalanyl chloromethyl (TPCK)-treated trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | Cleaves immature HA0 to HA1 and HA2 |
| Biotinylated anti-NP primary antibody (IAV) | EMD Millipore | MAB8258B | An antibody that recognizes the NP protein of influenza A viruses |
| Biotinylated anti-NP primary antibody (IBV) | EMD Millipore | MAB8260B-5 | An antibody that recognizes the NP protein of influenza B viruses |
| Streptavidin-HRP antibody | EMD Millipore | 18-152 | This is used as a secondary antibody for the biotinylated anti-NP antibody |
| HRP substrate (SIGMAFAST-OPD) | Sigma-Aldrich | P9187-5SET | o-phenylenediamine dihydrochloride water soluble substrate for HRP |
| 96-well V-bottom plate | Nunc | 249662 | Assay plate used for the hemagglutination assay |
| Chicken red blood cells | Lampire Biological Laboratories | 7201403 | Used to assess the ability of influenza virus to agglutinate |
| TRIzol | Ambion | 15596026 | Extraction of RNA |
| Superscript III | Invitrogen | 12574018 | Reverse transcriptase |
| Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Isolation of amplified PCR product |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | Transfection reagent |
| Anti-human IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11013 | Fluorescent secondary antibody for human antibodies |
| Anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | Fluorescent secondary antibody for murine antibodies |
| 6-well polystyrene microplate | Corning, Inc. | 353934 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Nalgene long term storage Cryo-tubes | ThermoFisher Scientific | 5012-0020 | Freezing of viral culture supernatant |
| reassortant A/California/04/09 (H1) | Palese Laboratory | reassortant virus expressing the HA and NA of A/California/04/09 (H1N1) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) | |
| reassortant A/Shanghai/1/13 (H7) | Palese Laboratory | reassortant virus expressing the HA and NA of A/Shanghai/1/13 (H7N9) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) | |
| Bovine serum albumin solution (35%) | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| Qiagen gel extration kit | Qiagen | 28704 | Silica-membrane-based purification of DNA fragments |
Referências
- Shaw, M. L., Palese, P. . Orthomyxoviridae: the viruses and their replication. , (2013).
- Nelson, M. I., Holmes, E. C. The evolution of epidemic influenza. Nat Rev Genet. 8 (3), 196-205 (2007).
- Lauring, A. S., Andino, R. Quasispecies Theory and the Behavior of RNA Viruses. PLoS Pathog. 6 (7), e1001005 (2010).
- Henry Dunand, C. J., Leon, P. E., et al. Preexisting human antibodies neutralize recently emerged H7N9 influenza strains. J Clin Invest. 125 (3), 1255-1268 (2015).
- Dunand, C. J. H., Leon, P. E., et al. Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection. Cell Host Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).
- Tan, G. S., Lee, P. S., et al. Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin. J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).
- Tan, G. S., Leon, P. E., et al. Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection. PLoS Pathog. 12 (4), e1005578 (2016).
- Smith, K., Garman, L., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
- Steel, J., Lowen, A. C., et al. Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain. mBio. 1 (1), (2010).
- Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies. J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).
- Wang, T. T., Tan, G. S., et al. Vaccination with a synthetic peptide from the influenza virus hemagglutinin provides protection against distinct viral subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18979-18984 (2010).
- Impagliazzo, A., Milder, F., et al. A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen. Science. 349 (6254), 1301-1306 (2015).
- Krammer, F., Palese, P., Steel, J. Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin. Current Topics in Microbiology and Immunology. , (2014).
- Wohlbold, T. J., Nachbagauer, R., Margine, I., Tan, G. S., Hirsh, A., Krammer, F. Vaccination with soluble headless hemagglutinin protects mice from challenge with divergent influenza viruses. Vaccine. 33 (29), 3314-3321 (2015).
- Ekiert, D. C., Bhabha, G., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
- Ekiert, D. C., Friesen, R. H. E., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
- Dreyfus, C., Laursen, N. S., et al. Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses. Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).
- Tran, E. E. H., Podolsky, K. A., et al. Cryo-electron Microscopy Structures of Chimeric Hemagglutinin Displayed on a Universal Influenza Vaccine Candidate. mBio. 7 (2), e00257 (2016).
- Wiley, D. C., Wilson, I. A., Skehel, J. J. Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin and their involvement in antigenic variation. Nature. 289 (5796), 373-378 (1981).
- Gerhard, W., Yewdell, J., Frankel, M. E., Webster, R. Antigenic structure of influenza virus haemagglutinin defined by hybridoma antibodies. Nature. 290 (5808), 713-717 (1981).
- Jackson, D. C., Murray, J. M., White, D. O., Gerhard, W. U. Enumeration of antigenic sites of influenza virus hemagglutinin. Infect Immun. 37 (3), 912-918 (1982).
- Matsuzaki, Y., Sugawara, K., et al. Epitope Mapping of the Hemagglutinin Molecule of A/(H1N1)pdm09 Influenza Virus by Using Monoclonal Antibody Escape Mutants. J Virol. 88 (21), 12364-12373 (2014).
- Tan, G. S., Krammer, F., Eggink, D., Kongchanagul, A., Moran, T. M., Palese, P. A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo. J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).
- Geneva: World Health Organization. . WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance. , (2002).
- Brauer, R., Chen, P. Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J Vis Exp. (97), e52421 (2015).
- Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA. J Vis Exp. (42), e2057 (2010).
- Hoffmann, E., Stech, J., Guan, Y., Webster, R. G. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses. ArchVirol. 146 (12), 2275-2289 (2001).
- Zhou, B., Lin, X., et al. Universal Influenza B Virus Genomic Amplification Facilitates Sequencing, Diagnostics, and Reverse Genetics. J Clin Microbiol. 52 (5), 1330-1337 (2014).
- Sidhu, S. S., Kossiakoff, A. A. Exploring and designing protein function with restricted diversity. Curr Opin Chem Biol. 11, 347-354 (2007).
- Chen, C. -. W., Chang, C. -. Y. Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope. J Vis Exp. (121), e55417 (2017).
Citar este artigo
Leon, P. E., Wohlbold, T. J., He, W., Bailey, M. J., Henry, C. J., Wilson, P. C., Krammer, F., Tan, G. S. Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies. J. Vis. Exp. (126), e56067, doi:10.3791/56067 (2017).