JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genética

ברזולוציה גבוהה ההיתוך PCR עבור המשלים קולטן 1 אורך פולימורפיזם גנוטיפינג: כלי חדשני למחלת אלצהיימר הערכת רגישות גנים

Published: July 18, 2017
doi:
10.3791/56012
, , , ,
1Department of Immunology,Reims University Hospitals, Robert Debré Hospital, 2Faculty of Medicine, LRN EA 4682,University of Reims Champagne-Ardenne, 3Department of Internal Medicine and Geriatrics,Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 4Faculty of Medicine, EA 3797,University of Reims Champagne-Ardenne

Summary

כאן אנו מתארים שיטה חדשנית לקביעת פולימורפיזם אורך קולטן 1 (CR1) אורך לשימוש עבור מספר יישומים, במיוחד הערכה של רגישות למחלות כגון אלצהיימר (AD). שיטה זו יכולה להיות שימושית כדי להבין טוב יותר את התפקיד של isoforms CR1 ב פתוגנזה של AD.

Abstract

קולטן משלים 1 (CR1), גליקופרוטאין טרנסממברני הממלא תפקיד מרכזי במערכת החיסונית המולדת, מתבטא בסוגי תאים רבים, אך בעיקר על תאי דם אדומים (RBCs). כקולטן עבור הרכיבים המשלימים C3b ו- C4b, CR1 מסדיר את ההפעלה של מפל המשלים ומקדם את phagocytosis של מכלולים החיסונית ואת פסולת הסלולר, כמו גם פפטיד עמילואיד ביתא (Aβ) במחלת אלצהיימר (AD). מספר מחקרים אישרו את הקשר בין פולימורפיזם של נוקליאוטידים יחיד (SNP) לבין AD-variation (CNV) בגן CR1 . כאן, אנו מתארים שיטה חדשנית לקביעת פולימורפיזם אורך של קולטן CR1. הקולטן כולל שלושה תחומים, הנקראים חוזרות הומולוגיות ארוכות (LHR) – LHR-A, LHR-C ו- LHR-D ו- n, LHR-B, כאשר n הוא מספר שלם בין 0 ל -3. של פריימרים ספציפיים, החומר הגנטי משמש כדי להגביר את השבר הראשון של LHR-B תחום (thE varant amplicon B) ו שבר שני של LHR-C תחום (amplicon קבוע). משתנה amplicon B ואת ההבדלים amplicon קבוע להציג 5 נוקליאוטידים מחוץ לאזורים הכלאה של primers אמר. המספרים של amplicons משתנה B של amplicons משתנה הוא להסיק באמצעות כלי כמותי (ברזולוציה גבוהה ההיתוך (HRM) עקומות), ואת היחס של amplicon B משתנה כדי amplicon קבוע משתנה על פי פולימורפיזם אורך CR1. שיטה זו מספקת מספר יתרונות על פני השיטה פנוטיפ הקנונית, שכן היא אינה דורשת חומר טרי הוא זול יותר, מהיר יותר, ולכן ישים לאוכלוסיות גדולות יותר. לכן, השימוש בשיטה זו צריך להיות מועיל כדי להבין טוב יותר את התפקיד של isoforms CR1 הפתוגנזה של מחלות כגון AD.

Introduction

AD, הגורם השכיח ביותר של דמנציה, משפיע על יותר מ -30 מיליון אנשים ברחבי העולם והיא בעיה בריאותית גדולה 1 . מבחינה קלינית, AD מאופיין בהפרעות נוירו-קוגניטיביות המובילות לאובדן מתקדם של אוטונומיה 2 . AD מאופיין על ידי שני סימפטומים נוירופתולוגי, כלומר, הפיקדונות עמילואיד נוסף הסלולר נוירופיברילרי תאיים 3 .

באופן מסורתי, על פי הגיל של תחילת המחלה, AD מסווג לשתי צורות. ראשית היא התחלה מוקדמת AD (EOAD), שבה הופעת מתרחשת לרוב לפני גיל 65; זה טופס חשבונות עבור פחות מ 5% מקרים AD. זוהי צורה נדירה, אוטוזומלית-דומיננטית של AD, אשר גורמת למוטציות חודרות במלואן או בחלבון המוביל (עמילואיד ) 4 , presenilin 1 ( PSEN1 ) 5 , או presenilin 2 ( PSEN2 )> 6 גנים. שנית, הצורה הנפוצה יותר של המחלה (> 90% מהמקרים AD) נקראת "ספוראידית" (ADD) (ADD) (LOAD), והיא מתרחשת לרוב אצל אנשים בני 65 ומעלה. זה נובע גורמי סיכון גנטיים וסביבתיים מרובים 7. ב LOAD, 4 אלל של הגן apolipoprotein E ( APOE ) הוא גורם הסיכון הגנטי העיקרי 8 , 9 . יתר על כן, יותר מ 20 לוקוסים גן זוהו על ידי מחקרים העמותה הגנום כולו (GWAS) כקשורים עם הסיכון של מחלת אלצהיימר, אשר אחד מהם הינו המרכיב המשלים (3B / 4 ב) קולטן 1 (CR1) גן 10, הממוקם על כרומוזום 1q32 באשכול של חלבונים הקשורים משלימים. הגן CR1 מקודד את חלבון סוג 1 (CR1) חלבון, רכיב של הרגולטור הפעילות המשלים.

CR1 (קולטן C3b / C4b, CD35), גליקופרוטאין טרנסממברני של קירובEly 200 kDa 11 , נקשר ל- C3b, C4b, C3bi, C1q, לקטין (ML), ומיקרופי ficolin המשלימים 12 . הפונקציה הביולוגית של CR1 משתנה עם סוגי התא שבו הוא בא לידי ביטוי. בבני אדם, 90% מכלל CR1 במחזור נמצא תאי דם אדומים (RBCs) 13 . בהווה על פני RBCs, CR1 נקשר מיקרואורגניזמים C3b או C4b-opsonized או מתחמי החיסון, להקל על פינוי שלהם מהמחזור. קומפלקסים הקשורים CR1 מועברים למעשה phagocytes כאשר RBCs לעבור את הכבד ואת הטחול 11 , 14 . על ידי הגבלת התצהיר של C3b ו C4b, CR1 עלול למנוע הפעלה משלימה מוגזמת. לכן, הביטוי של CR1 על RBCs נחשב מרכיב חיוני בהגנה על רקמות, כגון מערכת העצבים המוחית, נגד בתצהיר החיסונית המורכבת ואת המחלות הנובעות. CR1 על RBCs ידוע גםלשחק תפקיד חשוב בזיהום פתוגני 15 , 16 . בנוסף, CR1, כגורם מפתח בחסינות מולדת, מעורב בהסדרת מפל המשלים ובתחבורה ובהסרה של מתחמי החיסון. CR1 מפעילה את הפעילות על ידי מחברים של C3b ו- C4b וניתוקים קלאסיים ואלטרנטיביים (ניתוק של C2a ממכלול C4b2a וניתוק של C3b ממכלול C3bB). בתור גורם cofactor של גורם פרוטאז serine פלזמה אני (FI), CR1 מעכב את המסלולים המשלימים הקלאסית והאלטרנטיבית על ידי הגדלת המחשוף של C4b ו C3b ידי FI, נכס המכונה פעילות cofactor (CA), ועל ידי עיכוב לולאה הגברה C3 , בתורו למנוע הפעלה משלימה נוספת. רוג 'רס ועמיתיו לספק ראיות כי פפטיד Aβ יכול לקשור ולהפעיל את המסלול המשלים בהעדר נוגדנים 17 ולהציע כי פפטיד Aβ הוא clאוזן מן המחזור באמצעות דבקות תלויית משלים CR1 לידי ביטוי על RBCs 18 .

CR1 מציג שלושה סוגים של פולימורפיזם: פולימורפיזם מבניים או באורך, פולימורפיזם בצפיפות, וקצוות דם של קבוצות פולימורפיזם 11 , 19 . הפולימורפיזם המבני קשור לשינוי במספר החוזרים ההומולוגיים הארוכים (LHRs) ובכך מגדיר ארבעה איזופורמים. למעשה, התחום החוץ-תאי של החלבון CR1 מורכב מסדרה של יחידות חוזרות, הנקראות חוזרות חוזרות ונשנות (SCR) או חוזרות בקרה משלימות (CCP). SCRs אלה הודגמו משלימה deoxyribonucleic חומצה (cDNA) קידוד CR1. SCRs מסודרים קבוצות טנדם של שבעה, המכונה LHRs. CR1 מסודר לארבעה LHRs, המיועדים כמו LHR-A, -B, -C, ו- D, הנובעים שכפול של יחידה 7 SCR 19 , 20 ,21 .

על פי סדר הגדילה של תדירות, אלה איזופורמים CR1 שנקבעו על ידי כתם המערבי (WB) הם CR1 * 1 (A / F) (הגירה מהירה על ג'ל אלקטרופורזה), CR1 * 2 (B / S) (הגירה איטית על ג'ל אלקטרופורזה), CR1 * 3 (C / F`) ו- CR1 * 4 (D). שני האיזופורים הנפוצים ביותר, CR1 * (A / F) ו- CR1 * 2 (B / S), מורכבים מארבעה וחמישה LHR, בהתאמה, ואילו CR1 * 3 (C / F`) ו- CR1 * 4 (D ) מורכבים 3 ו 6 LHRs, בהתאמה. האיזופור הנפוץ ביותר (CR1 * 1), המורכב מ -30 SCR, מכיל שלושה אתרי מחייב C4b (SCRs 1-3, 8-10, 15-17) ושני אתרי מחייב C3b (SCRs 8-10 ו 15-17) , בעוד SCRs 22-28 לאגד C1q, ficolins, ו MBL 12 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 . לפיכך, CR1 * 2 מכיל אתר נוסף C3b / C4b מחייב להשוותD ל CR1 * 1. איור 1 ממחיש את המבנים, המינוחים והמשקל המולקולרי של ארבעת האיזופורמים השונים של CR1.

פולימורפיזם צפיפות מתאים פנוטיפ יציב המייצג את רמת הביטוי המכונן של CR1 על RBCs. אצל נבדקים בריאים קווקזי, הוכח כי מספר מולקולות CR1 לכל RBC יכול להשתנות לפי עד פי עשרה (הנעים בין 150 ל 1200 מולקולות לכל תא) 26. RBCs של פנוטיפ Helgeson יש צפיפות CR1 נמוך מאוד, אשר הוצגה להיות נמוך מ -150 מולקולות לכל תא 27 , 28 . צפיפות CR1 על פני כדוריות הדם האדומות קשורה גנטית עם מערכת biallelic אוטוזומלית codominant על הגן CR1, בקורלציה עם פולימורפיזם אורך קטע הגבלה הין dIII (RFLP) 29. מוטציה חד-פעמית באינטרון 27 של הגן CR1, בין האקסונים המקודדים את השניSCR ב LHR-D, תוצאות הדור של פולימורפית Hin DIII האתר בתוך אזור זה 30 . שברי גנומית הין dIII של 7.4 ו 6.9 kDa לזהות אללים הקשורים גבוה (אלל H) או נמוך (אלל L) צפיפות CR1 על פני כדוריות דם אדומים, בהתאמה. עם זאת, לא נמצא קורלציה בין צפיפות CR1 על RBCs ו פולימורפיזמים Hin DIII בכמה אוכלוסיות מערב אפריקה 31 , 32 . הסדרת צפיפות CR1 קישור מנגנון פולימורפיזם ללא קידוד הין dIII נותרת עלומה. בין מספר polyorphisms, Q981H ב SCR16 ו P1786R ב SCR28 דווחו להיות מקושרים את צפיפות CR1 על RBCs 30 , 33 .

הפולימרפיזם של Knops (KN), על פי המינוח הבינלאומי, הוא מערכת הדם ה -22 שממוקמת באיגוד הבינלאומי של עירוי דם. הוא מכיל 9 speci antigenicFcities לידי ביטוי על ידי CR1 על RBCs, כולל שלושה זוגות אנטיגנים אנטיגנטי, KN1 / KN2, KN3 / KN6, ו KN4 / KN7, כמו גם 3 אנטיגנים מבודדים, KN5, KN8, KN9. אנטיגנים מסוג KN1, KN3, KN4 ו- KN5 הם אנטיגנים בתדירות גבוהה של מערכת ה- KN ( כלומר, מתבטאים ביותר מ -99% מכלל האוכלוסייה). עם זאת, תפקידו של פולימורפיזם זה ב AD נשאר לקבוע 13 .

הפרוטוקול המתואר בעבודה זו נועד לקבוע את CR1 אורך polyorphism genotypes מעורב רגישות למספר מחלות, כגון AD, זאבת אדמנתית מערכתית, ומלריה. השיטה שלנו עבור CR1 אורך פולימורפיזם קביעת מנצל את מספר LHR-Bs המהווים את האיזופורמים CR1 ואת ההבדלים ברצף בין LHR-B ו- LHR-C ( איור 2 ).

Protocol

הפרוטוקול לאיסוף דם אנושי נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה האזורית (CPP Est II), ומספר הפרוטוקול הוא 2011-A00594-37. הערה: הפרוטוקול הבא מתאר את הטיפול בדם אדם. פעל לפי הנחיות מוסדיות תוך סילוק חומר ביולוגי. ציוד בטיחות מעבדה, כגון מעילים וכפפות מעבדה, יש ללבוש. תרשים זרימה המתאר את הפרוטוקול מוצג באיור 3 . 1. דם ונוזל הגוף דנ"א מיצוי פיפט 20 μL של proteinase K (15 מיקרוגרם / μL) לתוך החלק התחתון של צינור 1.5 מ"ל. הוסף 200 μL של המדגם לצינור 1.5 מ"ל. השתמש עד 200 μL של דם שלם, פלזמה, בסרום, מעיל באפי, או נוזלי גוף, או עד 5 x 10 6 לימפוציטים μL 200 של PBS. הוסף 200 μL של חיץ תמוגה המדגם. מערבבים על ידי הדופק vortexing במשך 15 s. לדגור על 56 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות באמבט מים. צנטריפוגה קצרה צינור 1.5 מ"ל להסיר את טיפות מבפנים המכסה. הוסף 200 μL של אתנול (96-100%) למדגם לערבב שוב על ידי הדופק vortexing במשך 15 שניות. לאחר ערבוב, צנטריפוגה קצרה צינור 1.5 מ"ל להסיר את טיפות מבפנים המכסה. בזהירות להחיל את התערובת מ צעד 1.6 אל עמוד הממברנה (בצינור 2 מ"ל אוסף). מבלי להרטיב את השפה, לסגור את הכובע צנטריפוגה ב XG 6000 במשך 1 דקות. מניחים את עמוד הממברנה בצינור נקי 2-מ"ל איסוף להשליך את הצינור המכיל את התסנין. בזהירות לפתוח את הממברנה הממברנה ולהוסיף 500 μL של חיץ לשטוף 1 מבלי להרטיב את השפה. סגור את מכסה צנטריפוגה ב XG 6000 במשך 1 דקות. מניחים את עמוד הממברנה בצינור נקי 2 מ"ל איסוף להשליך את הצינור המכיל את התסנין. בזהירות לפתוח את עמוד הממברנה ולהוסיף 500 μL של חיץ לשטוף 2 ללא הרטבת הרים. סגור את מכסה צנטריפוגות במלוא המהירות (20,000 xg) במשך 3 דקות. מניחים את עמוד הממברנה בצינור חדש 2 מ"ל איסוף להשליך את צינור איסוף עם תסנין. צנטריפוגה ב XG 20,000 דקות 1. מניחים את עמוד הממברנה צינור נקי 1.5 מ"ל וזורקים את צינור איסוף המכיל את התסנין. בזהירות לפתוח את עמוד הממברנה ולהוסיף 200 μL של מים מזוקקים. לדגור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות ולאחר מכן צנטריפוגה ב XG 6000 במשך 1 דקות. המשך לקביעת שלב ריכוז ה- DNA או להקפיא דגימות DNA ב -20 מעלות צלזיוס 2. קביעת ריכוז ה- DNA הערה: ראה איור 4 . לחץ על 1 כדי לבחור מצב DNA על ספקטרופוטומטר. בחר אורך נתיב 5 מ"מ באמצעות החצים שמאלה וימינה. בחר גורם דילול של 1 באמצעות החצים שמאלה וימינה. בחר את היחידה (μg / mL) באמצעות thחצים ימינה ושמאלה. בחר גורם של 50 באמצעות החצים שמאלה וימינה. לחץ על אישור . פיפט 10 μL של מים מזוקקים לתוך קובט. שים את קובט בספקטרופוטומטר. לחץ על הלחצן OA / 100% T. פיפטה 10 μL של מדגם DNA (1/4 דילול במים מזוקקים) לתוך קובט. שים את קובט בספקטרופוטומטר. לחץ על הלחצן הירוק (קריאה / הפעלה). הערה הריכוז. להקפיא את דגימת DNA ב -20 מעלות צלזיוס. 3. HRM-PCR פרוטוקול להפשיר דגימות DNA. לדלל את דגימות DNA ב 1.5 צינורות מ"ל עם מים כדי להתאים אותם ריכוז של 10 ng / μL הערה: הנפח הכולל של ה- DNA מדולל צריך להיות בין 2 μL ו 10 μL. להפשיר את פתרונות תחל. לדלל את פתרונות תחל צינורות 1.5 מ"ל עם מים כדי להתאים אותם ריכוז זהה של 6 מיקרומטר. הערה: רצפי הפריימר ותנאי התגובה מסופקים ב – Tמסוגל 1. טבלה 1: Primers ופרמטרים המשמשים ניתוח ההיתוך ברזולוציה גבוהה. להפשיר את פתרונות ערכת HRM-PCR ומערבבים היטב על ידי vortexing כדי להבטיח את ההתאוששות של כל התוכן. בקצרה ספין את שלוש בקבוקונים המכילים את התערובת האנזימטית עם צבע מחייב DNA, MgCl 2 , ו מים microcentrifuge לפני פתיחתם. אחסן אותם בטמפרטורת החדר. בצינור 1.5 מ"ל בטמפרטורת החדר, להכין את תערובת ה- PCR עבור תגובה אחת 20 μL על ידי הוספת הרכיבים הבאים בסדר המפורט להלן: 10 μL של תערובת אנזימטית עם צבע מחייב DNA; 2 μL של 25 מ"מ MgCl 2 ; 1 μL של פריימר 1, 6 מיקרומטר (ריכוז סופי: 300 ננומטר); 1 μL של תחל 2, 6 מיקרומטר (ריכוז סופי: 300NM); ו 5 μL של מים. הערה: כדי להכין את תמהיל ה- PCR במשך יותר מתגובה אחת, הכפל את הכרכים מעל מספר התגובות שיש להפעיל, בתוספת תגובה נוספת אחת. מערבבים בזהירות על ידי vortexing. פיפ 19 μL של תערובת PCR, מוכן מעל, לתוך כל טוב של צלחת multiwell לבן. הוסף 1 μL של ריכוז מתואמת דנ"א תבנית, מוכן בשלב 3.1. הערה: לקבלת תגובות בקרה, הפעל תמיד שליטה שלילית עם הדגימות. כדי להכין שליטה שלילית, להחליף את הדנ"א תבנית עם מים. חותם את צלחת multiwell לבן עם נייר איטום. מניחים את צלחת multiwell לבן בצנטריפוגה ולאזן אותו עם משקל נגד מתאים ( כלומר, צלחת multiwell אחרת). צנטריפוגה דקות 1 ב 1500 xg ב צנטריפוגה דלי רגיל הנדנדה המכיל רוטור צלחות multiwell עם מתאמים מתאימים. טען את הצלחת multiwell לבן לתוך מכשיר HRM-PCR. הפעל את תוכנית HRM-PCR עם התנאים הבאים PCR: Denaturation: 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות; 1 מחזור. הגברה: 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 62 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, ו- 72 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות; 47 מחזורים. עקומת ההיתוך: 95 ° C; שיעור הרמפה: 0.02 ° C / s; 25 רכישות לפי C; 1 מחזור. קירור: 40 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; הרמפה 2.2 ° C / s; 1 מחזור. 4. HRM ניתוח כדי לקבוע את CR1 אורך פולימורפיזם הערה: המתודולוגיה המתוארת ( איור 5 ) היא ספציפית לתוכנה שלנו (ראה טבלה של חומרים ), למרות שניתן להשתמש בחבילות תוכנה אחרות. פתח גן סריקה התוכנה לבצע את אורך CR1 אורך פולימורפיזם סריקה ניתוח. פתח את הניסוי המכיל את תוכנית הגברה ואת תוכנית עקומת ההיתוך. לחץ על עורך לדוגמה בסרגל המודול ולאחר מכן בחר את Sזרימת עבודה . להגדיר את המאפיינים של דגימות ( כלומר, שם, שליטה לא ידועה או שלילית). לחץ על ניתוח בסרגל המודול . ברשימה ' צור ניתוח חדש' , בחר ' סריקת גנים'. לחץ על הכרטיסייה נרמליזציה כדי לנרמל את עקומות ההיתוך. לחץ על הכרטיסייה טמפרטורה שינוי לאפס את ציר הטמפרטורה (ציר x) של עקומות ההיתוך. הערה: התרשים התחתון מראה עקומות נמס, הן מנורמל והן טמפרטורות. לחץ על הלחצן חשב כדי לנתח את התוצאות ולקבוע את הקיבוץ. לחץ על הכרטיסייה העלילה ההבדל באזור תרשימים כדי להציג את עקומות ההיתוך מנורמל והשתנה ואת ההבדל מנורמל טמפרטורה משתנה .

Representative Results

איור 6 מציג את phenotyping של פולימורפיזם אורך CR1 ידי WB. איור 6 B ו C מציג את הקימורים המתקבלים במהלך ניתוח HRM-PCR, המאפשר קביעת של פולימורפיזם אורך CR1. ניתוח של עקומות היתוך באמצעות התוכנה לאחר ההיתוך ברזולוציה גבוהה של amplicons נגזר PCR מן הדנ"א הגנומי של נושאים עם איזופורמים CR1 שונים מייצרת עקומות להפלות נושאים על פי פנוטיפים הביטוי שלהם CR1 allotypic. איור 6 B מציג את מצב ההצגה הראשון, הנקרא "עקומות התעלה מנורמלות ומורדות", ואילו איור 6 C מציג מצב שני של המצגת, הנקרא "הפרש מנורמל וטמפרטורה משתנה". <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> הפרופילים של עקומות מופצים על פי הקבוצות שמייצגות את פנוטיפים מוצג באיור 6 א: (CR1 * 3, CR1 * 1); (CR1 * 1, CR1 * 2); CR1 * 1; CR1 * 2; ו (CR1 * 2, CR1 * 4). זה מאפשר genotyping של פולימורפיזם אורך CR1 באמצעות שיטה זו ביולוגיה מולקולרית חדשה. איור 1: ייצוג סכמטי של המבנה ואת פולימורפיזם של קולטן השלמה 1 חלבון. כל חוזר קצר לחזור (SCR) או משלים חלבון שליטה (CCP) מיוצג על ידי מעגל. SCRs מקובצים לתוך מבנים חוזרים על סדר גבוה בשם LHRs. מן תחום תאיים לקרום התא, LHRs הם: LHR-A, -B, -C, -D, ו- S (LHR משלימים או נוספים). באיזופורם CR1 הנפוץ ביותר(CR1 * 1), C3b / ריקבון מואץ פעילות (DAA) אתר מחייב ממוקם LHR-A (SCRs 1-3, עיגולים ירוקים), C3b / C4b / cofactor פעילות (CA) אתר מחייב ממוקם 3 NR מסופי SCR של LHR-B (SCRs 8-10, עיגולים אדומים) ו LHR-C (SCRs 15-17, עיגולים סגולים), ואת האתר מחייב עבור C1q / MBL ו ficolin נמצא LHR-D (SCRs 22-28, עיגולים כחולים). המבנים ההומולוגיים צבועים זהים. האיזופורם CR1 * 2 (S) מציג LHR נוסף (LHR-S) ולכן מכיל אתר מחייב נוסף C3b / C4b. קדה, קילודלטון. NRC, תנאים לא מופחתים. RC, מצומצם התנאים. TM, תחום טרנסממברני. נתון זה הותאם מ- Brouwers et al. 36 באישור קבוצת ההוצאה לאור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" class="xfigimg" src= "/files/ftp_upload/56012/56012fig2.jpg" /> איור 2 : ייצוג סכמטי של מבנה איזופורם CR1 עם רצף amplicon עמדות שהושגו על ידי HRM-PCR. כל תיבה מייצגת SCR. SCRs מקובצים לתוך LHRs: LHR-A, -B, -C ו- D. המבנים ההומולוגיים צבועים זהים. CR1 * 2 ו CR1 * 4 isoformform להציג LHRs נוספים (LHR-B) ולכן מכילים אזור amplicon נוסף (amplicon B, באדום). CR1 * 3 חסר LHR-B ומכיל פחות amplicon אזור (חסר amplicon B). הבדלים נוקליאוטידים בין amplicon B (196 bp) לבין amplicon קבוע (197 bp) מתוארים באדום וכחול, בהתאמה. הבדלים ביחס: (amplicon B, ב amplicon אדום / infariant, בכחול) בין כל איזופורם CR1 נקבעים על ידי HRM-PCR, המאפשר genotyping. CN3 ו- CN3re רצפים תחל מודגשים. TM, תחום טרנסממברני. CYT, זנב cytoplasmic.Pg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 3: תרשים זרימה של הפרוטוקול עבור genotyping CR1 אורך פולימורפיזם מדגימות דם האדם. איסוף דגימת DNA האדם. לחלץ את ה- DNA כדי להשיג דגימת דם DNA. לקבוע את ריכוז ה- DNA לדלל כדי לקבל את ריכוז ה- DNA ב 10 ng / μL. השתמש HRM-PCR להשיג את הגנוטיפ CR1 אורך פולימורפיזם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 4 : צילומי מסך של ספקטרופוטומטר אותנו כדי לקבוע את ריכוז ה- DNA. לחץ על 1 ( A ) כדי לבחור מצב DNA על ספקטרופוטומטר. בחר אורך נתיב 5 מ"מ ( B ) באמצעות החצים שמאלה וימינה ( C ). בחר את היחידה (μg / mL) ( D ) באמצעות החצים שמאלה וימינה ( C ). בחר גורם דילול 1 ( E ) באמצעות החצים שמאלה וימינה ( C ). בחר גורם של 50 ( F ) באמצעות החצים שמאלה וימינה. לחץ על אישור ( G ). פיפט 10 μL של מים מזוקקים לתוך קובט. שים את קובט בספקטרופוטומטר ( H ). לחץ על הלחצן OA / 100% T ( I ). פיפטה 10 μL של מדגם DNA (1/4 דילול במים מזוקקים) לתוך קובט. שים את קובט בספקטרופוטומטר ( K ). לחץ על הלחצן הירוק (קריאה / הפעלה) ( L ). הערה הריכוז ( M ).Es / ftp_upload / 56012 / 56012fig4large.jpg "target =" _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 5: צילומי מסך של הממשק הגרפי של התוכנה המשמש בשלב 4 של הפרוטוקול. ( א ) לפתוח את התוכנה סריקה הגן. ( ב ) הגברה תוכנית תוכנית עקומת ההיתוך. ( ג ) לחץ על עורך לדוגמה בסרגל מודול . ( D ) בחר באפשרות סריקה . ( ה ) להגדיר את המאפיינים של הדגימות. ( F ) לחץ על ניתוח בסרגל מודול . ( G ) לחץ על הכרטיסייה נרמליזציה כדי לנרמל את עקומות ההיתוך. ( H ) לחץ על הכרטיסייה טמפרטורה שינוי להראות את עקומות ההיתוך כי שניהםמנורמל וטמפרטורה- shifted. ( I ) לחץ על כפתור חשב כדי לנתח את התוצאות ולקבוע את הקיבוץ. ( J ) לחץ על הכרטיסייה העלילה ההבדל כדי להציג את עקומות ההיתוך מנורמל והשתנה ואת ההבדל מנורמל טמפרטורה משתנה . ( K ) קיבוץ צבעוני של דגימות לפי גנוטיפים אורך CR1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 6: Phenotyping של פולימורפיזם אורך CR1 שנצפתה WB ואת עקומות פרופיל המקביל שלהם שהושגו על ידי HRM-PCR. ( א ) Phenotyping של פולימורפיזם אורך CR1 באמצעות WB. ( ב </stRong>) ו ( ג ) Genotyping של פולימורפיזמים אורך CR1 באמצעות ניתוח HRM-PCR. ניתוח עקומת HRM של amplicons PCR המתקבל הדנ"א הגנומי של נושאים הצגת isoforms CR1 שונים הובילה לזיהוי של פרופילים עקומה ספציפיים: (CR1 * 3, CR1 * 1) (סגול); (CR1 * 1, CR1 * 2) (כחול); CR1 * 1 (ירוק); CR1 * 2 (אדום); ו (CR1 * 2, CR1 * 4) (אפור). אלה תואמים את אלים CR1 אורך פולימורפיזם. כפי שמוצג על ידי שני המצבים של המצגת – "עקומות ההיתוך מנורמל והשתנה" (B) ו "" הפרשנות מנורמל ו – temped הפרש "(ג) – פרופילים עקומה מופצים על פי (CR1 * 3, CR1 * 1) ; (CR1 * 1, CR1 * 2); CR1 * 1; CR1 * 2; ו (CR1 * 2, CR1 * 4) קבוצות. נתון זה הותאם מחמודי ואח '. 38 ברשותו של אלסבייר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה נגישה נרחב ללמוד פולימורפיזם CR1 אורך. טכניקות ביולוגיה מולקולרית עבור הגברה או הכלאה המגזרית מעולם לא היו מסוגלים לתת תוצאות משביעות רצון המאפשרים קביעת של פולימורפיזמים CR1 אורך כל האנשים. זה בגלל המבנה החוזר של הגן CR1 ( כלומר, SCRs חוזרות מאוד של CR1). שיטת הביולוגיה המולקולרית המתוארת כאן מנצלת את ההתפלגות הכמותית של LHR-B במולקולת CR1. מולקולת CR1 כוללת תחומים של LHR-B, כאשר n הוא מספר בין 0 ל -3, ורק תחום LHR-C אחד, כמתואר ואיור באיור 2 . זיהוי תחום כמותי מאפשר לך להפלות באופן מושלם תחום אחד נוסף או חסר.

מן החומר הגנטי המופק, קטע DNA הראשון מ LHR-B הוא מוגבר על ידי PCR באמצעות זוג יחיד של primers ספציפיים, represenTing גרסה אופיינית של LHR-B בשם "varant amplicon B." קטע DNA נוסף, הנקרא "amplicon קבוע" השייכים LHR-C, הוא גם הגביר. זה קטע הדנ"א השני הוא שבר של LHR-C, אבל עוד שבר קבוע של LHR-A או D יכול לשמש גם.

שני שברי ה- DNA, amplicon B משתנה ואת amplicon קבוע, מוגברים על ידי אותם primers ולהציג חמישה הבדלים רצפים נוקליאוטידים. מאפיין זה מאפשר את הצעד הבא כדי לקבוע את מספר amplicon B וריאנט B ואת מספר amplicons קבועים באמצעות כלי ביולוגיה מולקולרית כמותית, HRM, אשר הותאם למטרה זו. היחס בין מספר amplicon B לבין amplicon קבוע (יחס: amplicon B / amplicon קבוע) משתנה בהתאם לאורך של מולקולת CR1. ואכן, CR1 * 4 מציג 3 יחידות amplicon B ל 1 amplicon קבוע, CR1 * 2 מציג 2 יחידות amplicon B ל 1 amplicon קבוע, CR1 * 1 מציג 1 amplicon B ל 1 amplicon קבוע, CR1 * 3 מציג 0 יחידות amplicon B ל 1 amplicon קבוע ( איור 2 ). לפיכך, שיטה זו HRM-PCR מאפשר genotyping של פולימורפיזם אורך CR1.

עם זאת, בתחילת המחקר, טכניקה זו דורשת שימוש במקורות התייחסות אשר פנוטיפי CR1 כבר ידוע ( כלומר, הוקמה בעבר על ידי WB) על מנת להיות מסוגל להקים את genotyping של CR1 על פי פרופיל התייחסות של עקומות שהושגו על ידי HRM-PCR. שני סוגים של ייצוג, כלומר, "מנורמל והשתנה ההתעלות curves" ו "" מנורמל ו temp- הפרש מגרש "זמינים. הם מציגים קבוצות נפרדות של פרופילים עקומה צבעוני לפי polotyping CR1 אורך polyorypism שהושג על ידי WB ( איור 6 ). מהצעד "מנורמל ומוסך הקימורים", השיטה שלנו מאפשרת להפלות את הE קבוצות נפרדות של עקומות המתאים האיזופורמים של CR1, מקובצים לפי צבע. עם זאת, "מנורמל ו Temp השתנה המגרש ההבדל", אשר מתאים ייצוג מתמטי שונה, מאפשר הדמיה קלה יותר של קבוצות נפרדות של עקומות. למרות התוכנה של היצרן נעשה שימוש שגרתי במחקר זה, תוכנות אחרות (כגון UANALYSE) יכול לשמש תוכנית החילוץ נתונים עבור ניתוח עקומה.

עד כה, הטכניקה ניתוח WB היא הטכניקה המקורית המאפשרת זיהוי של פוליפורפיזמים שונים CR1 אורך ברמה של החלבון. עם זאת, טכניקה זו יש מספר חסרונות. בפרט, ניתוח חלבון על ידי WB יכול להיעשות רק לאחר מיצוי של קרום התא. כתוצאה מכך, זה מורכב מאוד זמן רב. יתר על כן, טכניקה זו דורשת קבלת דגימת דם טרי בתנאים מתאימים בתחילת ההליך להשיג מיל שימושימיליונים. להיפך, HRM-PCR מבוצע על DNA מאפשר להשתמש אפילו כתמי דם יבש או דגימות לאחר אחסון לטווח ארוך. HMR-PCR דורש מכשיר DNA מיוחד להמיס, או מכשיר ייעודי או Thermocycler HMR קיבולת עם תוכנת HRM. זיהוי SNP תלוי במספר גורמים: i) SNPs הכלולים שברי PCR גדולים יותר קשה לזהות מאשר SNPs אותו שברי PCR קטנים; ii) SNPs השייכים כיתות III ו- IV הם יותר קשה לזהות מאלה של כיתות א 'וב' 34; ו- iii) SNPs הנמצאים בצמוד לסימטריה בסיסית של השכן הקרוב ביותר ( למשל, 5-G (C / C) C-3 ') לא ניתן למיין על ידי ההיתוך, ללא קשר לכוח הרזולוציה של פלטפורמת ה- HMR. זה עשוי להיות שימושי כדי לבדוק את שברי PCR החזוי המכיל את SNP של עניין עם התוכנה uMELT 35 כדי להעריך את תוקפו של assay. לבסוף, HMR-PCR היא שיטה אנלוגית, כלומר הדמיון של הימור עקומות ההימורWeen הפניה ותבנית לא בהכרח לרמוז כי רצף התבנית זהה ההתייחסות, כמו רצף התבנית עשוי להיות שונה מן ההפניה אבל שווה ערך תרמודינמית. עם זאת, מגבלות אלה אינן חלות על השיטה המתוארת כאן, אשר מבוססת על ההיתוך של תערובת של amplicons שונים זה מזה במונחים של 5 רצפים נוקליאוטידים.

בנוסף, הטכניקה המתוארת כאן, בהתבסס על ניתוח של HRM, יש יתרונות רבים. ראשית, פולימורפיזם אורך CR1 נקבעים מהר יותר, שכן התוצאות מתקבלים על 2 שעות פעם את החילוץ של החומר הגנטי בוצעה. לעומת זאת, טכניקות ביוכימיות מסורתיות המבוססות על ניתוח חלבון WB דורשות צעדים ארוכים יחסית: אלקטרופורזה של תמציות קרום התא באמצעות ג'ל אקרילאמיד, צעד להעביר חלבונים ל nitrocellulose או polyvinylidene פלואוריד (PVDF) קרום, צעד כדי לזהות את איסופורמים שלמולקולה CR1 על ידי immunochemiluminescence. שנית, הטכניקה HRM-PCR יש גם את היתרון של לא להיות יקר מדי, וזה חשוב במיוחד עבור שיטה עשויה להיות מיושמת על אנשים רבים ( כלומר, largescale) כדי לקבוע את הרגישות שלהם לפתח פתולוגיות כגון מחלת אלצהיימר, זאבת, או מלריה.

לאחרונה, אנו ואחרים הראו כי איזופורם CR1 * 2, אשר מכיל אחד נוסף C3b / C4b האתר מחייב, היה קשור לספירה 36, 37, 38. במחקר שפורסם בעבר, פולימורפיזם אורך CR1 ברמת הגן והחלבון היו עקביים ב 98.9% מהנבדקים 38 . התוצאות המתקבלות בעת השוואת פולימורפיזם אורך שקיבלו HRM-PCR עם אלו שהושגו על ידי WB תואמו לנבדקים עם פרופיל גנוטיפ CR1 * 1, CR1 * 2 שנקבע על ידי HRM (גן)לחיצה רק על האיזופור CR1 * 1 על פני השטח של כדורית הדם על פי WB (חלבון). במחקר שלנו, היעדר ביטוי CR1 * 2 isoform (אנשים הנושאים אלל שקט) היה לשחזור כאשר WB בוצעה עם זמן חשיפה ארוכה יותר יכול להיות מוסבר על ידי קיומו של אלל CR1 שקטה (CR1 * 2), המתואר בספרות של הלג'סון 39 . עם זאת, נדרשים מחקרים נוספים על אוכלוסיות גדולות יותר כדי לתמוך בהשערה זו.

יש לציין כי SNPs פרטיים (SNPs מתרחשים רק בקבוצה משפחתית קטנה או אפילו באדם בודד) הובילו לפרופילים של עקומות שונות שיש לפענח באמצעות קביעת פנוטיפ התייחסות (WB), אך לא ניתן לבלבל ביניהם עם הפרופיל הקנוני כדי להימנע כל פרשנות מוטעית של גנוטיפ CR1 אורך פולימורפיזם.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לכל חברי ה- Plateforme Régionale de Biologie Innovante, צוות המחלקה לאימונולוגיה וצוות המחלקה לרפואה פנימית וגריאטריה, שתרמו לייעול ואישור הפרוטוקול. עבודה זו מומנה על ידי בתי החולים של אוניברסיטת ריימס (מספר מענק AOL11UF9156). אנו מודים גם פיונה אקרנוט (EA3920, בית החולים האוניברסיטאי בסנסון, צרפת) על סיוע העריכה.

Materials

Lab coat protection
SensiCareIce powder-free Nitrile Exam gloves Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA 486802 sample protection
Eppendorf Reference 2 pipette, 0,5-10µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000024 sample pipetting
Eppendorf Reference 2 pipette, 20-100µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000059 sample pipetting
Eppendorf Reference 2 pipette, 100-1000µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000083 sample pipetting
TipOne 10µL Graduated, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1121-3810 sample pipetting
TipOne 1-100µL bevelled, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1120-1840 sample pipetting
ART 1000E Barrier Tip Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 2079E sample pipetting
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 0030120086 mix
Vortex-Genie 2 Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA SI-0236 mix
QIAamp DNA Mini Kit (250) Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France 51306 DNA Extraction
Buffer AL Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France 19075 Lysis buffer
QIAamp Mini Spin Column Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France 1011706 DNA binding
Buffer AW1 Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France 19081 Wash buffer
Buffer AW2 Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France 19072 Wash buffer
Biowave DNA spectrophotometer Biochrom Ltd, Cambridge CB4 OFJ, England 80-3004-70 DNA concentration 
Mikro 200 centrifuge Hettich Zentrifugen, D-78532, Germany 0002020-02-00 centrifugation
Eppendorf Combitips advanced, 1.0 mL, Eppendorf Biopur Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 0030089642 distribution
Multipette E3 Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4987000010 distribution
Light Cycler 480 multiwell plate 96, white Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany 04729692001 reaction place
Light Cycler 480 sealing foil Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany 04429757001 coverage
Heraeus Megafuge 11R centrifuge Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 75004412 centrifugation
LightCycler 480 Instrument II, 96-well Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany 05015278001 high resolution melting polymerase chain reaction
LightCycler 480 High Resolution Melting Master Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany 04909631001 reaction reagents
light cycler 480 SW 1.5.1 software Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany software used for HRM PCR CR1 polymorphism data analysis
CN3 primer: 5'ggccttagacttctcctgc 3' Eurogentec Biologics Division, B- 4102 Seraing, Belgium reaction reagent
CN3re primer: 5'gttgacaaattggcggcttcg 3' Eurogentec Biologics Division, B- 4102 Seraing, Belgium reaction reagent
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Prince, M., et al. World Alzheimer Report 2015, The Global Impact of Dementia: An analysis of prevalence, incidence, cost and trends. Alzheimer’s Disease International. , (2015).
  2. McKhann, G. M., et al. The diagnosis of dementia due to Alzheimer’s disease: recommendations from the National Institute on Aging-Alzheimer’s Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer’s disease. Alzheimers Dement. 7 (3), 263-269 (2011).
  3. Serrano-Pozo, A., Frosch, M. P., Masliah, E., Hyman, B. T. Neuropathological alterations in Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), 006189 (2011).
  4. Goate, A., et al. Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial Alzheimer’s disease. Nature. 349 (6311), 704-706 (1991).
  5. Sherrington, R., et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer’s disease. Nature. 375 (6534), 754-760 (1995).
  6. Levy-Lahad, E., et al. A familial Alzheimer’s disease locus on chromosome 1. Science. 269 (5226), 970-973 (1995).
  7. Mayeux, R., Stern, Y. Epidemiology of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (8), (2012).
  8. Corder, E. H., et al. Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer’s disease in late onset families. Science. 261 (5123), 921-923 (1993).
  9. Yu, J. T., Tan, L., Hardy, J. Apolipoprotein E in Alzheimer’s disease: an update. Annu Rev Neurosci. 37, 79-100 (2014).
  10. Lambert, J. C., et al. Genome-wide association study identifies variants at CLU and CR1 associated with Alzheimer’s disease. Nat Genet. 41 (10), 1094-1099 (2009).
  11. Liu, D., Niu, Z. X. The structure, genetic polymorphisms, expression and biological functions of complement receptor type 1 (CR1/CD35). Immunopharmacol Immunotoxicol. 31 (4), 524-535 (2009).
  12. Jacquet, M., et al. Deciphering complement receptor type 1 interactions with recognition proteins of the lectin complement pathway. J Immunol. 190 (7), 3721-3731 (2013).
  13. Pham, B. N., et al. Analysis of complement receptor type 1 expression on red blood cells in negative phenotypes of the Knops blood group system, according to CR1 gene allotype polymorphisms. Transfusion. 50 (7), 1435-1443 (2010).
  14. Cosio, F. G., Shen, X. P., Birmingham, D. J., Van Aman, M., Hebert, L. A. Evaluation of the mechanisms responsible for the reduction in erythrocyte complement receptors when immune complexes form in vivo in primates. J Immunol. 145 (12), 4198-4206 (1990).
  15. Krych-Goldberg, M., Moulds, J. M., Atkinson, J. P. Human complement receptor type 1 (CR1) binds to a major malarial adhesin. Trends Mol Med. 8 (11), 531-537 (2002).
  16. Cohen, J. H., Geffriaud, C., Caudwell, V., Kazatchkine, M. D. Genetic analysis of CR1 (the C3b complement receptor, CD35) expression on erythrocytes of HIV-infected individuals. Aids. 3 (6), 397-399 (1989).
  17. Rogers, J., et al. Complement activation by beta-amyloid in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (21), 10016-10020 (1992).
  18. Rogers, J., et al. Peripheral clearance of amyloid beta peptide by complement C3-dependent adherence to erythrocytes. Neurobiol Aging. 27 (12), 1733-1739 (2006).
  19. Krych-Goldberg, M., Atkinson, J. P. Structure-function relationships of complement receptor type 1. Immunol Rev. 180, 112-122 (2001).
  20. Klickstein, L. B., et al. Human C3b/C4b receptor (CR1). Demonstration of long homologous repeating domains that are composed of the short consensus repeats characteristics of C3/C4 binding proteins. J Exp Med. 165 (4), 1095-1112 (1987).
  21. Hourcade, D., Miesner, D. R., Atkinson, J. P., Holers, V. M. Identification of an alternative polyadenylation site in the human C3b/C4b receptor (complement receptor type 1) transcriptional unit and prediction of a secreted form of complement receptor type 1. J Exp Med. 168 (4), 1255-1270 (1988).
  22. Krych, M., Hourcade, D., Atkinson, J. P. Sites within the complement C3b/C4b receptor important for the specificity of ligand binding. Proc Natl Acad Sci USA. 88 (10), 4353-4357 (1991).
  23. Krych-Goldberg, M., et al. Decay accelerating activity of complement receptor type 1 (CD35). Two active sites are required for dissociating C5 convertases. J Biol Chem. 274 (44), 31160-31168 (1999).
  24. Klickstein, L. B., Barbashov, S. F., Liu, T., Jack, R. M., Nicholson-Weller, A. Complement receptor type 1 (CR1, CD35) is a receptor for C1q. Immunity. 7 (3), 345-355 (1997).
  25. Ghiran, I., et al. Complement receptor 1/CD35 is a receptor for mannan-binding lectin. J Exp Med. 192 (12), 1797-1808 (2000).
  26. Cornillet, P., Philbert, F., Kazatchkine, M. D., Cohen, J. H. Genomic determination of the CR1 (CD35) density polymorphism on erythrocytes using polymerase chain reaction amplification and HindIII restriction enzyme digestion. J Immunol Methods. 136 (2), 193-197 (1991).
  27. Moulds, J. M., Nickells, M. W., Moulds, J. J., Brown, M. C., Atkinson, J. P. The C3b/C4b receptor is recognized by the Knops, McCoy, Swain-langley, and York blood group antisera. J Exp Med. 173 (5), 1159-1163 (1991).
  28. Moulds, J. M., Moulds, J. J., Brown, M., Atkinson, J. P. Antiglobulin testing for CR1-related (Knops/McCoy/Swain-Langley/York) blood group antigens: negative and weak reactions are caused by variable expression of CR1. Vox Sang. 62 (4), 230-235 (1992).
  29. Wilson, J. G., et al. Identification of a restriction fragment length polymorphism by a CR1 cDNA that correlates with the number of CR1 on erythrocytes. J Exp Med. 164 (1), 50-59 (1986).
  30. Wong, W. W., et al. Structure of the human CR1 gene. Molecular basis of the structural and quantitative polymorphisms and identification of a new CR1-like allele. J Exp Med. 169 (3), 847-863 (1989).
  31. Herrera, A. H., Xiang, L., Martin, S. G., Lewis, J., Wilson, J. G. Analysis of complement receptor type 1 (CR1) expression on erythrocytes and of CR1 allelic markers in Caucasian and African American populations. Clin Immunol Immunopathol. 87 (2), 176-183 (1998).
  32. Rowe, J. A., et al. Erythrocyte CR1 expression level does not correlate with a HindIII restriction fragment length polymorphism in Africans; implications for studies on malaria susceptibility. Genes Immun. 3 (8), 497-500 (2002).
  33. Birmingham, D. J., et al. A polymorphism in the type one complement receptor (CR1) involves an additional cysteine within the C3b/C4b binding domain that inhibits ligand binding. Mol Immunol. 44 (14), 3510-3516 (2007).
  34. Venter, J. C., et al. The sequence of the human genome. Science. 291 (5507), 1304-1351 (2001).
  35. Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).
  36. Brouwers, N., et al. Alzheimer risk associated with a copy number variation in the complement receptor 1 increasing C3b/C4b binding sites. Mol Psychiatry. 17 (2), 223-233 (2012).
  37. Hazrati, L. N., et al. Genetic association of CR1 with Alzheimer’s disease: a tentative disease mechanism. Neurobiol Aging. 33 (12), 2945-2949 (2012).
  38. Mahmoudi, R., et al. Alzheimer’s disease is associated with low density of the long CR1 isoform. Neurobiol. Aging. 36, 1712-1765 (2015).
  39. Helgeson, M., Swanson, J., Polesky, H. F. Knops-Helgeson (Kna), a high-frequency erythrocyte antigen. Transfusion. 10 (3), 137-138 (1970).

Tags

Complement Receptor 1 Length PolymorphismHigh-resolution Melting PCRAlzheimer’s DiseaseGenotypingNeurociênciaDNA ExtractionProteinase KLysis BufferEthanolMembrane Column

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Kisserli, A., Tabary, T., Cohen, J. H. M., Duret, V., Mahmoudi, R. High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer’s Disease Gene Susceptibility Assessment. J. Vis. Exp. (125), e56012, doi:10.3791/56012 (2017).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image