PCR de fusion haute résolution pour le complément du récepteur 1 Polymorphisme de longueur Le génotypage: un outil novateur pour l'évaluation de la sensibilité des gènes de la maladie d'Alzheimer
Summary
Ici, nous décrivons une méthode innovante pour déterminer les polymorphismes de la longueur du récepteur 1 (CR1) pour une utilisation dans plusieurs applications, en particulier l'évaluation de la sensibilité à des maladies telles que la maladie d'Alzheimer (AD). Cette méthode pourrait être utile pour mieux comprendre le rôle des isoformes CR1 dans la pathogenèse de l'AD.
Abstract
Le récepteur de complément 1 (CR1), une glycoprotéine transmembranaire qui joue un rôle clé dans le système immunitaire inné, est exprimé sur de nombreux types cellulaires, mais surtout sur les globules rouges (globules rouges). En tant que récepteur pour les composants du complément C3b et C4b, le CR1 régule l'activation de la cascade du complément et favorise la phagocytose des complexes immuns et des débris cellulaires, ainsi que le peptide amyloïde-bêta (Aβ) dans la maladie d'Alzheimer (AD). Plusieurs études ont confirmé des polymorphismes de nucléotide unique (SNP) associés à AD, ainsi qu'une variation de nombre de copies (CNV) dans le gène CR1 . Ici, nous décrivons une méthode innovante pour déterminer le polymorphisme de longueur du récepteur CR1. Le récepteur comprend trois domaines, appelés longues répétitions homologues (LHR) -LHR-A, LHR-C et LHR-D-et un domaine n, LHR-B, où n est un nombre entier compris entre 0 et 3. En utilisant une seule paire D'amorces spécifiques, le matériel génétique est utilisé pour amplifier un premier fragment du domaine LHR-B (thE variant l'amplicon B) et un second fragment du domaine LHR-C (l'amplicon invariant). Le variant amplicon B et l'amplicon invariant affichent des différences à cinq nucléotides en dehors des zones d'hybridation desdites amorces. Le nombre d'amplicons variant B et d'amplicons invariants est déduit à l'aide d'un outil quantitatif (courbes de fusion à haute résolution (HRM)), et le rapport du variant amplicon B à l'amplicon invariant diffère selon le polymorphisme de longueur CR1. Cette méthode présente plusieurs avantages par rapport à la méthode du phénotype canonique, car elle ne nécessite pas de matière fraîche et est moins coûteuse, plus rapide et donc applicable à des populations plus importantes. Ainsi, l'utilisation de cette méthode devrait être utile pour mieux comprendre le rôle des isoformes CR1 dans la pathogenèse de maladies telles que l'AD.
Introduction
L'AD, la cause la plus fréquente de démence, touche plus de 30 millions de personnes à travers le monde et constitue un problème majeur de santé publique 1 . Cliniquement, l'AD se caractérise par des troubles neurocognitifs conduisant à une perte progressive d'autonomie 2 . L'AD se caractérise par deux caractéristiques neuropathologiques, à savoir les dépôts amyloïdes extra-cellulaires et les enchevêtrements neurofibrillaires intracellulaires 3 .
Traditionnellement, selon l'âge d'apparition de la maladie, AD est classé sous deux formes. D'abord, l'apparition anticipée de l'AD (EOAD), où l'apparition survient le plus souvent avant l'âge de 65 ans; Ce formulaire représente moins de 5% des cas d'AD. C'est une forme rare, autosomique de l'AD, qui entraîne des mutations totalement pénétrantes dans la protéine précurseur amyloïde ( APP) 4 , la préséniline 1 ( PSEN1 ) 5 ou la préséniline 2 ( PSEN2 )> 6 gènes. Deuxièmement, la forme la plus fréquente de la maladie (> 90% des cas de MA) est appelée «AD sporadique» tardive (LOAD) et apparait le plus souvent chez les personnes de 65 ans et plus. Il résulte de multiples facteurs de risque génétiques et environnementaux 7 . Dans LOAD, l'allèle 4 du gène apolipoprotéine E ( APOE ) est le principal facteur de risque génétique 8 , 9 . En outre, plus de 20 loci de gènes ont été identifiés par des études d'association à l'échelle du génome (GWAS) comme étant associées au risque d'AD, dont le gène 10 du récepteur 1 ( CR1 ) du composant complément (3b / 4b), situé sur Chromosome 1q32 dans un groupe de protéines liées au complément. Le gène CR1 code pour la protéine du récepteur du complément 1 (CR1), une composante des régulateurs de l'activité du complément.
CR1 (le récepteur C3b / C4b, CD35), une glycoprotéine transmembranaire de approximationEly 200 kDa 11 , se lie au C3b, C4b, C3bi, C1q, la lectine de liaison au mannan (MBL) et les protéines du complément ficolin 12 . La fonction biologique de CR1 varie avec les types de cellules dans lesquels il est exprimé. Chez l'homme, 90% du CR1 circulant total se retrouve dans les globules rouges (RBC) 13 . Présent à la surface des globules rouges, le CR1 se lie aux microorganismes opsonisés C3b ou C4b ou aux complexes immuns, ce qui facilite leur clairance de la circulation. Les complexes liés à CR1 sont en effet transférés vers des phagocytes lorsque les globules rouges traversent le foie et la rate 11 , 14 . En limitant le dépôt de C3b et C4b, CR1 pourrait empêcher une activation excessive du complément. Par conséquent, l'expression de CR1 sur les globules rouges est considérée comme un élément essentiel dans la protection des tissus, tels que le système nerveux cérébral, contre le dépôt du complexe immunitaire et les maladies qui en résultent. Le CR1 sur les globules rouges est également connu pourJouent un rôle important dans l'infection pathogène 15 , 16 . En outre, CR1, en tant qu'acteur clé en immunité innée, participe à la régulation de la cascade du complément et au transport et à l'élimination des complexes immuns. Le CR1 exerce cette activité en liant les fragments C3b et C4b et en dissociant les convertases classiques et alternatives (dissociation de C2a du complexe C4b2a et dissociation de C3b du complexe C3bBb). En tant que cofacteur du facteur de serine protease plasmatique I (FI), le CR1 inhibe les voies de complément classiques et alternatives en augmentant le clivage de C4b et C3b par FI, une propriété connue sous le nom d'activité de cofacteur (CA) et en inhibant la boucle d'amplification C3 , À son tour, empêchant une nouvelle activation du complément. Rogers et ses collègues prouvent que le peptide Aß peut se lier et activer la voie du complément en l'absence d'anticorps 17 et suggérer que le peptide Aß est clSortit de la circulation par adhérence dépendante du complément au CR1 exprimé sur les globules rouges 18 .
Le CR1 présente trois types de polymorphismes: polymorphismes structurels ou de longueurs, polymorphismes de densité et polymorphismes du groupe sanguin Knops 11 , 19 . Le polymorphisme structurel est lié à une variation du nombre de répétitions homologues longues (LHR) et définit ainsi quatre isoformes. En fait, le domaine extracellulaire de la protéine CR1 est composé d'une série d'unités récurrentes, appelées répétitions de consensus courtes (SCR) ou répétitions de contrôle du complément (CCP). Ces SCR ont été démontrés à partir de l'acide désoxyribonucléique complémentaire (ADNc) codant CR1. Les SCR sont organisés en groupes en tandem de sept, appelés LHR. CR1 est disposé en quatre LHR, désignés par LHR-A, -B, -C et -D, découlant de la duplication d'une unité sept-SCR 19 , 20 ,21 .
Dans l'ordre croissant de fréquence, ces isoformes CR1 déterminées par Western Blot (WB) sont CR1 * 1 (A / F) (migration rapide sur électrophorèse sur gel), CR1 * 2 (B / S) (migration lente sur électrophorèse sur gel), CR1 * 3 (C / F`) et CR1 * 4 (D). Les deux isoformes les plus courantes, CR1 * 1 (A / F) et CR1 * 2 (B / S) sont composées de quatre et cinq LHR, respectivement, alors que CR1 * 3 (C / F`) et CR1 * 4 (D ) Sont composés de 3 et 6 LHR, respectivement. L'isoforme la plus commune (CR1 * 1), composée de 30 SCR, contient trois sites de liaison C4b (SCR 1-3, 8-10 et 15-17) et deux sites de liaison C3b (SCR 8-10 et 15-17) , Tandis que les SCR 22-28 lient C1q, ficolins et MBL 12 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 . Ainsi, CR1 * 2 contient un site de liaison C3b / C4b supplémentaire comparéD à CR1 * 1. La figure 1 illustre les structures, les nomenclatures et les poids moléculaires des quatre isoformes différentes de CR1.
Le polymorphisme de densité correspond à un phénotype stable qui représente le niveau d'expression constitutive de CR1 sur les globules rouges. Chez les sujets sages en bonne santé, il a été démontré que le nombre de molécules CR1 par RBC peut varier jusqu'à un facteur dix (variant de 150 à 1 200 molécules par cellule) 26 . Les globules rouges du phénotype de Helgeson ont une densité de CR1 très faible, ce qui était inférieur à 150 molécules par cellule 27 , 28 . La densité de CR1 sur les globules rouges est génétiquement associée à un système bialélique codominien autosomique sur le gène CR1 , corrélée avec un polymorphisme de longueur de fragment de restriction Hin dIII (RFLP) 29 . Une mutation à un seul point dans Intron 27 du gène CR1, entre les exons codant la secondeSCR dans LHR-D, entraîne la génération d'un site polymorphique Hin dIII dans cette région 30 . Les fragments Genomic Hin dIII de 7,4 et 6,9 kDa identifient les allèles associés à la densité élevée (H allèle) ou faible (L allele) CR1 sur les globules rouges, respectivement. Cependant, aucune corrélation n'a été trouvée entre la densité CR1 sur les globules rouges et les polymorphismes Hin dIII dans certaines populations de l'Afrique de l'Ouest 31 , 32 . Le mécanisme reliant la régulation de la densité CR1 à un polymorphisme Hin DIII non codant reste inconnu. Parmi plusieurs polymorphismes, Q981H dans SCR16 et P1786R dans SCR28 ont été signalés comme étant liés à la densité CR1 sur les globules rouges 30 , 33 .
Le polymorphisme Knops (KN), selon la nomenclature internationale, est le 22ème système de groupe sanguin à indexer par la Société internationale de transfusion sanguine. Il contient 9 spécimens antigéniquesLes expressions exprimées par le CR1 sur les globules rouges, y compris trois paires antigéniques antithétiques, KN1 / KN2, KN3 / KN6 et KN4 / KN7, ainsi que 3 antigènes isolés, KN5, KN8, KN9. Les antigènes KN1, KN3, KN4 et KN5 sont des antigènes à haute fréquence du système KN ( c'est-à-dire exprimés dans plus de 99% de la population générale). Cependant, le rôle de ce polymorphisme dans AD reste à déterminer 13 .
Le protocole décrit dans ce travail a été conçu pour déterminer les génotypes de polymorphisme de longueur CR1 impliqués dans la susceptibilité à plusieurs maladies, telles que AD, lupus érythémateux systémique et paludisme. Notre méthode pour la détermination du polymorphisme de longueur CR1 profite du nombre de LHR-Bs comprenant les isoformes CR1 et des différences de séquence entre LHR-B et LHR-C ( Figure 2 ).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous décrivons une méthodologie largement accessible pour étudier les polymorphismes de longueur CR1. Les techniques de biologie moléculaire pour l'amplification ou l'hybridation segmentaire n'ont jamais été en mesure de donner des résultats satisfaisants permettant la détermination de polymorphismes de longueur CR1 chez tous les individus. Ceci est dû à la structure répétitive du gène CR1 ( c.-à-d. Les SCR hautement répétitifs de CR1). La méthode de biologie moléculaire décrite ici exploite la distribution quantitative de LHR-B dans la molécule CR1. La molécule CR1 comprend n domaines LHR-B, où n est un nombre compris entre 0 et 3, et un seul domaine LHR-C, comme décrit et illustré à la figure 2 . La détection quantitative de domaine B permet de discriminer parfaitement un domaine B ou autre.
Du matériel génétique extrait, un premier fragment d'ADN de LHR-B est amplifié par PCR en utilisant une seule paire d'amorces spécifiques, représentantUne variante caractéristique de LHR-B appelée "variante amplicon B." Un deuxième fragment d'ADN, appelé "amplicon invariant" et appartenant à LHR-C, est également amplifié. Ce second fragment d'ADN est un fragment de LHR-C, mais un autre fragment invariant de LHR-A ou -D pourrait également être utilisé.
Les deux fragments d'ADN, le variant de l'amplicon B et l'amplicon invariant sont amplifiés par les mêmes amorces et présentent cinq différences dans les séquences nucléotidiques. Cette caractéristique permet dans l'étape suivante de déterminer le nombre de variantes d'amplicon B et le nombre d'amplicons invariables en utilisant un outil de biologie moléculaire quantitative, HRM, qui a été adapté à cet effet. Le rapport entre le nombre d'amplicon B et l'amplicon invariant (rapport: amplicon B / amplicon invariant) varie en fonction de la longueur de la molécule CR1. En effet, CR1 * 4 affiche 3 unités B d'amplicon à 1 amplicon invariant, CR1 * 2 affiche 2 unités B d'amplicon à 1 amplicon invariant, CR1 * 1 affiche 1 amplicon B à 1 amplicon invariant et CR1 * 3 affiche 0 unités amplicon B à 1 amplicon invariant ( Figure 2 ). Ainsi, cette méthode HRM-PCR permet le génotypage du polymorphisme de longueur CR1.
Néanmoins, au début de l'étude, cette technique nécessite l'utilisation de sujets de référence dont les phénotypes CR1 sont déjà connus ( c.-à-d. Préalablement établis par WB) afin de pouvoir établir le génotypage de CR1 selon le profil de référence des courbes obtenues Par HRM-PCR. Deux types de représentation, à savoir "Courbes de fusion normalisées et décalées" et "Tracé de différence normalisé et temporisé", sont disponibles. Ils présentent des groupes distincts de profils de courbes colorés selon le phénotypage du polymorphisme de longueur CR1 obtenu par WB ( Figure 6 ). À partir de l'étape "Courbes de fusion normalisées et décalées", notre méthode permet de discriminerE groupes distincts de courbes correspondant aux isoformes de CR1, groupées par couleur. Cependant, le «Plot de différence temporel et différencié temporairement», qui correspond à une représentation mathématique différente, permet une visualisation plus simple des différents groupes de courbes. Bien que le logiciel du fabricant ait été utilisé habituellement dans cette étude, d'autres logiciels (tels que uANALYSE) pourraient être utilisés comme programme d'extraction de données pour l'analyse des courbes.
À ce jour, la technique d'analyse WB est la technique originale qui permet d'identifier les différents polymorphismes de longueur CR1 au niveau de la protéine. Cependant, cette technique présente un certain nombre d'inconvénients. En particulier, l'analyse des protéines par WB ne peut être effectuée qu'après l'extraction des membranes cellulaires. En conséquence, il est complexe et prend beaucoup de temps. En outre, cette technique nécessite l'obtention d'un échantillon de sang frais dans des conditions appropriées au début de la procédure pour obtenir des réponses utilesUlts. Au contraire, la HRM-PCR réalisée sur l'ADN permet d'utiliser même des taches de sang sec ou des échantillons après un stockage à long terme. HMR-PCR nécessite un instrument spécialisé en fusion d'ADN, soit un instrument dédié, soit un thermocycleur à capacité HMR avec un logiciel HRM. La détection de SNP dépend de plusieurs facteurs: i) Les SNP inclus dans les grands fragments de PCR sont plus difficiles à détecter que les mêmes SNP dans les petits fragments de PCR; Ii) Les SNP appartenant aux classes III et IV sont plus difficiles à détecter que ceux des classes I et II 34 ; Et iii) les SNP qui sont flanqués par la symétrie de base de voisinage le plus proche ( par exemple, 5'-G (G / C) C-3 ') ne peuvent pas être triés par fusion, quelle que soit la puissance de résolution de la plate-forme HMR. Il peut être utile de tester les fragments de PCR prévus contenant le SNP d'intérêt avec le logiciel uMELT 35 pour évaluer la validité de l'analyse. Enfin, HMR-PCR est une méthode analogique, ce qui signifie que la similitude des courbes de fusion parieUne référence et un modèle n'impliquent pas nécessairement que la séquence du modèle soit identique à la référence, car la séquence du modèle peut être différente de la référence mais équivalente thermodynamiquement. Cependant, ces limitations ne s'appliquent pas à la méthode décrite ici, qui est basée sur la fusion d'un mélange d'amplicons qui diffèrent en termes de 5 séquences nucléotidiques.
En outre, la technique décrite ici, basée sur l'analyse de HRM, présente de nombreux avantages. Tout d'abord, les polymorphismes de longueur CR1 sont déterminés plus rapidement, puisque les résultats sont obtenus en environ 2 h une fois que l'extraction du matériel génétique a été réalisée. À l'inverse, les techniques biochimiques traditionnelles basées sur l'analyse de la protéine WB nécessitent des étapes relativement longues: l'électrophorèse des extraits de membrane cellulaire à travers un gel d'acrylamide, une étape pour transférer les protéines à une membrane de nitrocellulose ou de fluorure de polyvinylidène (PVDF) et une étape pour identifier les Isoformes de laMolécule CR1 par immunochemiluminescence. Deuxièmement, la technique HRM-PCR a également l'avantage de ne pas être trop coûteuse, ce qui est particulièrement important pour une méthode susceptible d'être appliquée à de nombreux individus ( c'est-à-dire à grande échelle) pour déterminer leur susceptibilité au développement de pathologies telles que la maladie d'Alzheimer, Le lupus ou le paludisme.
Récemment, nous et d'autres ont montré que l'isoforme CR1 * 2, qui contient un site de liaison C3b / C4b supplémentaire, était associée à la norme AD 36 , 37 , 38 . Dans notre étude publiée précédemment, les polymorphismes de longueur CR1 au niveau du gène et de la protéine étaient cohérents dans 98,9% des sujets 38 . Les résultats discordants obtenus lors de la comparaison des polymorphismes de longueur obtenus par HRM-PCR avec ceux obtenus par WB correspondaient à des sujets ayant un profil de génotype (CR1 * 1, CR1 * 2) déterminé par HRM (gene) mais exEn appuyant uniquement sur l'isoforme CR1 * 1 à la surface de l'érythrocyte selon WB (protéine). Dans notre étude, le manque d'expression de l'isoforme CR1 * 2 (individus portant un allèle silencieux) était reproductible lorsque la WB a été réalisée avec un temps d'exposition plus long et s'explique par l'existence d'un allèle CR1 silencieux (CR1 * 2), décrit Dans la littérature par Helgeson 39 . Néanmoins, d'autres études sur les populations plus importantes sont nécessaires pour étayer cette hypothèse.
Il convient de noter que les SNP privés (SNPs qui se produisent uniquement dans un petit groupe familial ou même dans un seul individu) ont conduit à des profils de courbes distincts qui doivent être déchiffrés en utilisant la détermination de phénotype de référence (WB) mais qui ne peuvent pas être confondus avec le profil canonique pour éviter Toute interprétation erronée du génotype de polymorphisme à longueur CR1.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions tous les membres de la Plateforme Régionale de Biologie Innovante, le personnel du Département d'Immunologie et le personnel du Département de médecine interne et de gériatrie, qui ont contribué à l'optimisation et à la validation du protocole. Ce travail a été financé par les hôpitaux universitaires de Reims (numéro de subvention AOL11UF9156). Nous remercions également Fiona Ecarnot (EA3920, Hôpital universitaire de Besançon, France) pour une assistance éditoriale.
Materials
| Lab coat | protection | ||
| SensiCareIce powder-free Nitrile Exam gloves | Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA | 486802 | sample protection |
| Eppendorf Reference 2 pipette, 0,5-10µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000024 | sample pipetting |
| Eppendorf Reference 2 pipette, 20-100µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000059 | sample pipetting |
| Eppendorf Reference 2 pipette, 100-1000µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000083 | sample pipetting |
| TipOne 10µL Graduated, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1121-3810 | sample pipetting |
| TipOne 1-100µL bevelled, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1120-1840 | sample pipetting |
| ART 1000E Barrier Tip | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 2079E | sample pipetting |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 0030120086 | mix |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA | SI-0236 | mix |
| QIAamp DNA Mini Kit (250) | Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France | 51306 | DNA Extraction |
| Buffer AL | Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France | 19075 | Lysis buffer |
| QIAamp Mini Spin Column | Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France | 1011706 | DNA binding |
| Buffer AW1 | Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France | 19081 | Wash buffer |
| Buffer AW2 | Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France | 19072 | Wash buffer |
| Biowave DNA spectrophotometer | Biochrom Ltd, Cambridge CB4 OFJ, England | 80-3004-70 | DNA concentration |
| Mikro 200 centrifuge | Hettich Zentrifugen, D-78532, Germany | 0002020-02-00 | centrifugation |
| Eppendorf Combitips advanced, 1.0 mL, Eppendorf Biopur | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 0030089642 | distribution |
| Multipette E3 | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4987000010 | distribution |
| Light Cycler 480 multiwell plate 96, white | Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany | 04729692001 | reaction place |
| Light Cycler 480 sealing foil | Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany | 04429757001 | coverage |
| Heraeus Megafuge 11R centrifuge | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 75004412 | centrifugation |
| LightCycler 480 Instrument II, 96-well | Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany | 05015278001 | high resolution melting polymerase chain reaction |
| LightCycler 480 High Resolution Melting Master | Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany | 04909631001 | reaction reagents |
| light cycler 480 SW 1.5.1 software | Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany | software used for HRM PCR CR1 polymorphism data analysis | |
| CN3 primer: 5'ggccttagacttctcctgc 3' | Eurogentec Biologics Division, B- 4102 Seraing, Belgium | reaction reagent | |
| CN3re primer: 5'gttgacaaattggcggcttcg 3' | Eurogentec Biologics Division, B- 4102 Seraing, Belgium | reaction reagent |
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