Applicazione di morsetto di patch automatico guidato per immagini per lo studio dei neuroni in fettine di cervello

La tecnica della pinzetta patch è stata sviluppata da Neher e Sakmann negli anni '70 per studiare i canali ionici delle membrane eccitabili ¹ . Da allora, il bloccaggio della patch è stato applicato allo studio di molti soggetti diversi a livello cellulare, sinaptico e a livello di circuito sia in vitro che in vivo, in diversi tipi di cellule, inclusi neuroni, cardiomiociti, oociti Xenopus e liposomi artificiali ² . Questo processo prevede la corretta identificazione e il targeting di una cella di interesse, il controllo di micromanipulatore intricato per spostare la pipetta patch in prossimità della cella, l'applicazione di una pressione positiva e negativa alla pipetta nel momento giusto per stabilire una patch gigasea stretta, E un break-in per stabilire una configurazione di patch di cellule intere. Il bloccaggio delle patch viene tipicamente eseguito manualmente e richiede un'estesa formazione per il master. Anche per un ricercatore esperto con la patchMorsetto, il tasso di successo è relativamente basso. Più recentemente, sono stati fatti diversi tentativi per automatizzare gli esperimenti di patch-clamp. Due strategie principali si sono evolute per realizzare l'automazione: aumentando le apparecchiature standard di bloccaggio delle patch per fornire il controllo automatico del processo di patching e la progettazione di nuove attrezzature e tecniche dal punto di vista fondamentale. L'ex strategia è adattabile all'hardware esistente e può essere utilizzata in una varietà di applicazioni di morsetti di patch, tra cui in vivo patch morsetto patch ^{3 , 4 , 5} in vitro di patch patch di cervelli acuti, colture organotipiche di fetta e neuroni dissocati coltivati ⁶ . Permette l'interrogazione di circuiti locali complessi utilizzando simultaneamente più micromanipulatori ⁷ . Il metodo di patch pianistico è un esempio della nuova strategia di sviluppo, che può raggiungere l'elevato throughput simultaneo pMorsetto di cellule in sospensione per scopi di screening dei farmaci ⁸ . Tuttavia, il metodo di patch planare non è applicabile a tutti i tipi di cellule, in particolare i neuroni con lunghi processi o circuiti intatti che contengono collegamenti estesi. Questo limita la sua applicazione alla mappatura dei circuiti intricati del sistema nervoso, che è un vantaggio fondamentale della tecnologia tradizionale patch clamp.

Abbiamo sviluppato un sistema che automatizza il processo di morsetto di patch in vitro incrementando l'hardware standard di patch clamp. Il nostro sistema, Autopatcher IG, fornisce la calibrazione automatica delle pipette, l'identificazione del bersaglio a fluorescenza, il controllo automatico del movimento delle pipette, la patch automatica delle cellule intere e la registrazione dei dati. Il sistema può acquisire automaticamente più immagini di fette del cervello a diverse profondità; Analizzarli usando la visione del computer; E estrarre informazioni, incluse le coordinate delle cellule etichettate con fluorescenza. Queste informazioni possono essere alloraUtilizzati per mirare e bloccare automaticamente le celle di interesse. Il software è scritto in Python – un linguaggio di programmazione gratuito e aperto – utilizzando diverse librerie a sorgenti aperte. Ciò assicura la sua accessibilità ad altri ricercatori e migliora la riproducibilità e il rigore degli esperimenti di elettrofisiologia. Il sistema ha un design modulare, in modo tale che gli hardware aggiuntivi possano essere facilmente interfacciati con l'attuale sistema dimostrato qui.