Formålet med metoden RBR-ID er at identificere roman RNA-bindende proteiner (RBPs) og kortlægge deres RNA-bindende regioner (RBRs) med peptid-niveau beslutning at lette udformningen af RNA-bindende mutanter og undersøgelse af biologiske og biokemiske funktioner af protein-RNA interaktioner.

RNA er enestående blandt biomolekyler, da det kan både fungere som en budbringer, der bærer genetisk information og også fold i komplekse tredimensionale strukturer med biokemiske funktioner mere beslægtet med dem af proteiner^1,2. En voksende mængde af beviser tyder på, at noncoding RNA’er (klarlægning) spiller vigtige roller i forskellige gen regulerende og epigenetiske veje^3,4,5 , og typisk disse regulerende funktioner er medieret i koncert med proteiner, der interagerer med en given RNA. Af særlig relevans, var et sæt af interagerende proteiner for nylig udpeget for det intenst undersøgt lange ncRNA (lncRNA) Xist, at give værdifuld indsigt i, hvordan denne lncRNA medierer x-kromosom Inaktiveringen i kvindelige celler^{6,7 ,8}. Navnlig, flere af disse Xist-interagere proteiner indeholder ikke nogen kanoniske RNA-bindende domæner⁹, og derfor deres RNA-bindende aktivitet kunne ikke forudset i siliciummangan baseret på deres primære sekvens alene. I betragtning af, at tusindvis af lncRNAs er udtrykt i en given celle¹⁰, er det rimeligt at antage, at mange af dem kan handle via interaktioner med endnu at blive opdaget RNA-bindende proteiner (RBPs). En eksperimentel strategi til at identificere disse roman RBPs vil derfor i høj grad lette opgave at dissekere den biologiske funktion af klarlægning.

Tidligere forsøg på at identificere RBPs empirisk har påberåbt sig polyA + RNA udvalg koblet til massespektrometri (MS)^{11,12,13,14,15}. Selv om disse forsøg tilføjes listen over formodede RBPs mange proteiner, ved design kunne de kun registrere proteiner bundet til polyadenylated udskrifter. De fleste små RNA’er og mange lncRNAs er imidlertid ikke polyadenylated. ^{16 , 17} og deres interagerende proteiner ville sandsynligvis have været savnet i disse eksperimenter. En nylig undersøgelse anvendes maskinen læring på protein-protein interactome databaser at identificere proteiner, der co renset med flere kendte RBPs og viste, at disse tilbagevendende RBP partnere var mere tilbøjelige til at besidde RNA-bindende aktiviteter¹⁸. Men denne tilgang afhængig mining eksisterende store interaktion databaser og kan kun identificere proteiner, der kan være co renset i ikke-denatureringen betingelser med kendte RBPs, dermed udelukke fra analyse uopløselige, membran-indlejret og knappe proteiner.

Identifikation af et protein som en Bonafide RBP ofte ikke automatisk giver oplysninger om de biologiske og/eller biokemiske funktion af protein-RNA interaktion. For at løse dette punkt, er det typisk ønskeligt at identificere de protein domæne og aminosyre rester involveret i samspillet, således at specifikke mutanter kan være designet til at teste funktionen af RNA bindende i forbindelse med hver roman RBP^{19, 20}. tidligere indsats af vores gruppe og andre har brugt rekombinante protein fragmenter og sletning mutanter for at identificere RNA bindende regioner (RBRs)^19,20,21,22; men sådanne tilgange er arbejdskrævende og uforenelig med høj overførselshastighed analyser. For nylig beskrev en undersøgelse en eksperimentel strategi for at kortlægge RNA-bindende aktiviteter i en høj overførselshastighed mode ved hjælp af massespektrometri²³; men denne fremgangsmåde påberåbt sig en dobbelt polyA + RNA udvalg, og således foretaget de samme begrænsninger som RBP identifikation metoder beskrevet ovenfor.

Vi udviklet en teknik, kaldet RNA bindende region identifikation (RBR-ID), som udnytter protein-RNA photocrosslinking og kvantitativ massespektrometri til at identificere proteiner og protein regioner interagere med RNA i levende celler uden at gøre antagelse om RNA polyadenylation status, herunder således RBPs bundet til polyA-RNA’er²⁴. Desuden, denne metode afhængig udelukkende af crosslinking og har ingen krav på protein opløselighed eller tilgængelighed og er således egnet til at knytte RNA-bindende aktiviteter inden for membraner (f.eks. den nukleare kuvert) eller () tungtopløselige rum f.eks. den nukleare matrix). Vi beskriver de eksperimenterende trin for at udføre RBR-ID for kerner af musen embryonale stamceller (mESCs) men med mindre ændringer denne protokol skal være egnet til en lang række celletyper, forudsat at de effektivt kan optage 4SU fra kulturen medium.