Summary

Определение остаточного доноров эритроидных клеток-предшественников после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у пациентов с Hemoglobinopathies

Published: September 06, 2017
doi:

Summary

Количественная оценка полученных доноров клеток требуется контролировать приживления после трансплантации стволовых клеток у пациентов с hemoglobinopathies. Сочетание сортировки потока на основе цитометрии клеток, колонии формирования assay и последующий анализ короткие тандемные повторы могут быть использованы для оценки масштабов распространения и дифференциации прародителей в отсеке эритроидные.

Abstract

В значительной части пациентов после трансплантации костного мозга для талассемии основных или серповидно-клеточной анемии отмечается наличие неполной химеризма. Это замечание имеет огромные последствия, поскольку последующие терапевтических иммуномодуляция стратегии может улучшить клинические исходы. Условно полимеразная цепная реакция-анализ короткие тандемные повторы используется для идентификации химеризма в клетках крови доноров производные. Однако этот метод ограничен ядерных клеток и не могут различать между диссоциированных одноклеточных линий. Мы прикладной анализ короткие тандемные повторы течь гранулярных сортировка гемопоэтических предшественников клетки и сравнить это с анализом короткие тандемные повторы, полученные из выбранных взрыв формирование подразделения – эритроидных колоний, оба собранные из костей костного мозга. С помощью этого метода мы в состоянии продемонстрировать различные пролиферации и дифференцировки клеток донора в отсеке эритроидные. Эта техника имеет право завершить текущий мониторинг химеризма в трансплантации стволовых клеток Установка и таким образом может быть прикладной в будущем клинических исследований, исследования стволовых клеток и дизайн испытаний генной терапии.

Introduction

Трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) является доступны только лечебный подход для различных врожденные генетические заболевания кроветворной системы, достижения безрецидивной выживаемости более чем 90% иначе сильно скомпрометирован и жизнь ограниченной пациентов1. Эффективность этого важного инструмента терапевтических оптимизирована путем ограничения токсичности пред- и после трансплантации схемы2, но также на мероприятия, направленные на поддержание стабильных трансплантата функция, которая количественно путем тщательного наблюдения за клетки донора производным3,4,5.

В общем полный химеризма (CC) подразумевает полная замена отсека lymphohematopoietic клетками донора производные, тогда как термин смешанные химеризма (MC) используется для доноров и получателей, полученных клетки одновременно присутствуют в различных пропорции. Сплит химеризма (SC) обозначает сосуществование смешанных химеризма наблюдается в одноклеточных линий, таких как эритроидные отсека. Оперативное определение статуса химеризма ТГСК имеет решающее значение, как это может помочь определить восприимчивы рецидивов заболевания и инициировать последующих иммуномодулирующих стратегии, такие как доноров лимфоцитов инфузии или сокращение иммунодепрессивных больных 6лечения.

Несколько методов были разработаны для мониторинга приживления после ТГСК. Isotyping иммуноглобулины и анализ цитогенетика имеют плохое чувствительность и ограничены в их способность обнаруживать полиморфизм,78. Введения флуоресцентных в situ гибридизация (рыба) может повысить чувствительность в химеризма мониторинга после ТГСК, но ограничивается секс несоответствие аллотрансплантантов9. В настоящее время является наиболее распространенным методом, используемым для обнаружения химеризма полимеразной цепной реакции (ПЦР) и основывается на электрофорез геля агарозы обычных-акриламид переменное число повторов тандем (VNTRs) или короткие тандемные повторы (СПО). Обычно используются количественного PCR способен обнаружить крайне небольшая доля остаточных доноров клеток после ТГСК. Основным ограничением исследований пока, что MC обнаружения ограничивается почти исключительно наличием ядерных клеток, а не зрелых эритроцитов, а именно клеток, что являются функционально важно для пациентов, пострадавших от hemoglobinopathies. У больных с различными группами крови стоит вспомнить, что cytofluorometric анализ способен идентифицировать химеризма в красных кровяных клетках путем использования моноклональных антител к антигенам эритроцитов ABO и C, c, D, E и e-10 , 11. разные, но очень интересные средства оценки химеризма эритроидные линии является сочетание потока гранулярных сортировки эритроидные предшественники и выбор различных типов эритроидные предшественники путем культивирования в колониеобразования анализов, После анализа12ул. Этот подход имеет возможность количественно относительные пропорции химеризма доноров и получателей помощи в отсеке эритроидные и могут быть использованы в стратегии для поддержания костного трансплантата.

Protocol

1. изоляции кроветворных клеток костного мозга путем активации Многопараметрический флуоресценции сортировки клеток образец пятная перед началом процесса, следующие пункты должны быть собраны и готовы: градиент СМИ для подготовки мононуклеарных клеток (GM), 50 м?…

Representative Results

Разделение lymphohematopoietic прародителями путем сортировки клеток СУИМ Мы здесь продемонстрировать результаты от сортировки необходимые клеточных популяций течению STR анализа. Клетки костного мозга окрашивали конъюгированных V450…

Discussion

Целью настоящего исследования является предоставить аудитории сочетание двух подходов для анализа химеризма доноров/получателей помощи в эритроидные предшественники после ТГСК больных лечение hemoglobinopathies: 1.) сортировки активирован флуоресценции клеток прародитель гемопоэтических к…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Regenbogen подчиняется Kinderkrebshilfe.

Materials

Ficoll-Paque GE Healthcare GE17-1440-02  Remove RBC
50 mL conical tubes Falcon 14-432-22 Sample preparation
12 x 75 mm flow tubes Falcon 352002 FACS sorting
Phosphate buffered saline Gibco 10010023 PBS
Fetal calf serum Invitrogen Inc. 16000-044 FCS (heat-inactivated)
CD34 APC BD Bioscience 561209 FACS-Ab
CD36 FITC BD Bioscience 555454 FACS-Ab
CD45 V450 BD Bioscience 642275 FACS-Ab
Trypan blue Gibco 15250061
Hemocytometer Invitrogen Inc. C10227 Automatic cell counting
Hank’s Balanced Salt Solution Gibco 14025092 Suspension buffer in FACS analysis
HEPES Gibco 15630080 Component of suspension buffer
FcR BD Bioscience 564220 Block FCR
FACS Aria I BD Bioscience 23-11539-00 FACS Sorter
Recombinant  human erythropoietin Affimetrix eBioscience 14-8992-80 EPO
Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium Gibco 12440053 IMDM
L-Glutamine Invitrogen 25030-081 Component of Culture Medium
CD34+ magnetic beads Milteny Biotech 130-046-702 CD34+ purification
Recombinant  human G-CSF Gibco PHC2031 CFU-Assay
Recombinant  human SCF Gibco CTP2113 CFU-Assay
Recombinant  human GM-CSF Gibco PHC2015 CFU-Assay
Recombinant  human IL-3 BD Bioscience 554604 CFU-Assay
Recombinant  human IL-6 BD Bioscience 550071 CFU-Assay
Methocult H4434 Medium Stemcell Technologies 4444 CFU-Assay
QiAmp DNA Blood extraction kit Qiagen 51306 DNA Isolation
Nanodrop ND-1000 spectra photometer Thermo Scientific ND 1000 DNA Quantification
DNAase free H2O Thermo Scientific FEREN0521 DNA Preparation
AmplTaq Gold DNA Polymerase Applied Bioscience N8080240 PCR
Eppendorf mastercycler gradient Eppendorf 6321000019 PCR 
Hi-Di Formamid Applied Bioscience 4311320 PCR
GeneScan 500 ROX Size Standard Applied Bioscience 4310361 PCR
3130 Genetic Analyzer Applied Bioscience 313001R PCR

Referências

  1. Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
  2. Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia and sickle cell anemia. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a011825 (2012).
  3. Andreani, M., Testi, M., Lucarelli, G. Mixed chimerism in haemoglobinopathies: from risk of graft rejection to immune tolerance. Tissue Antigens. 83, 137-146 (2014).
  4. Andreani, M., et al. Persistence of mixed chimerism in patients transplanted for the treatment of thalassemia. Blood. 87, 3494-3499 (1996).
  5. Andreani, M., et al. Long-term survival of ex-thalassemic patients with persistent mixed chimerism after bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 25, 401-404 (2000).
  6. Kumar, A. J., et al. Pilot study of prophylactic ex vivo costimulated donor leukocyte infusion after reduced-intensity conditioned allogeneic stem cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 19, 1094-1101 (2013).
  7. Lawler, S. D., Harris, H., Millar, J., Barrett, A., Powles, R. L. Cytogenetic follow-up studies of recipients of T-cell depleted allogeneic bone marrow. Br J Haematol. 65, 143-150 (1987).
  8. McCann, S. R., Crampe, M., Molloy, K., Lawler, M. Hemopoietic chimerism following stem cell transplantation. Transfus Apher Sci. 32, 55-61 (2005).
  9. Dewald, G., et al. A multicenter investigation with interphase fluorescence in situ hybridization using X- and Y-chromosome probes. Am J Med Genet. 76, 318-326 (1998).
  10. Andreani, M., et al. Quantitatively different red cell/nucleated cell chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease. Haematologica. 96, 128-133 (2011).
  11. Andreani, M., Testi, M., Battarra, M., Lucarelli, G. Split chimerism between nucleated and red blood cells after bone marrow transplantation for haemoglobinopathies. Chimerism. 2, 21-22 (2011).
  12. Kropshofer, G., Sopper, S., Steurer, M., Schwinger, W., Crazzolara, R. Successful management of mixed chimerism after bone marrow transplant in beta-thalassemia major. Am J Hematol. 91, E357-E358 (2016).
  13. Kimpton, C. P., et al. Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci. PCR Methods Appl. 3, 13-22 (1993).
  14. Centis, F., et al. The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with beta-thalassemia major. Blood. 96, 3624-3629 (2000).
  15. Miccio, A., et al. In vivo selection of genetically modified erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta-thalassemia. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 10547-10552 (2008).

Play Video

Citar este artigo
Crazzolara, R., Kropshofer, G., Steurer, M., Sopper, S., Schwinger, W. Detection of Residual Donor Erythroid Progenitor Cells after Hematopoietic Stem Cell Transplantation for Patients with Hemoglobinopathies. J. Vis. Exp. (127), e56002, doi:10.3791/56002 (2017).

View Video