Summary

Hemoglobinopathies 환자에 대 한 조 혈 줄기 세포 이식 후 잔여 기증자 Erythroid 조상 세포의 검출

Published: September 06, 2017
doi:

Summary

기증자에서 파생 된 셀의 정량화는 engraftment hemoglobinopathies 환자에 줄기 세포 이식 후 모니터링 해야 합니다. 교류 cytometry 기반 셀 정렬, 식민지 대형 분석 결과, 및 짧은 탠덤 반복 확산을 평가 하는 데 사용할 수 있습니다의 후속 분석 및 erythroid 구획에 창시자의 차별화의 조합입니다.

Abstract

불완전 한 chimerism의 존재는 환자 thalassemia 메이저에 대 한 골 수 이식 또는 낫 세포 질병의 큰 비율에 기록 됩니다. 이 관찰으로 후속 치료 immunomodulation 전략 임상 결과 향상 시킬 수 있는 엄청난 의미를 갖는다. 통상, 짧은 탠덤 반복의 중 합 효소 연쇄 반응에 기초를 둔 분석 혈액 세포 기증자 파생 된 chimerism를 식별 하는 데 사용 됩니다. 그러나,이 메서드는 nucleated 세포에 제한 이며 천연된 단 세포 계보를 구분할 수 없습니다. 우리는 짧은 탠덤 반복 조 혈 조상 cytometric 정렬 셀 흐름의 분석을 적용 하 고이 짧은 탠덤 반복 선택 된 버스트 형성 단위-erythroid 식민지에서에서 얻은 두 뼈에서 수집 된의 분석에 비해 수입니다. 이 방법으로 우리는 서로 다른 확산 및 erythroid 구획에 기증자 세포의 수 있습니다. 이 기술은 설정 줄기 세포 이식에서 chimerism의 전류 모니터링 완료 수 이며 따라서 적용된 미래에 임상 연구, 줄기 세포 연구 그리고 유전자 치료 실험의 디자인 수 있습니다.

Introduction

수용자 조 혈 줄기 세포 이식 (HSCT)은 매우 손상에 대 한 90%의 질병-무료 생존 율을 달성 조 혈 시스템의 선천적인된 유전 질환의 다양 한 사용 가능한 유일한 치료 접근 및 생활 제한 환자1. 이 중요 한 치료 도구의 효능 중의 독성을 제한 하 여 최적화 된-이후의 regimens2, 이식 하지만 또한 개입 안정적인 이식 기능을 유지 하기 위한, 여는 정량의 가까운 모니터링 하 여 기증자 파생 셀3,,45.

완전 한 chimerism (CC) chimerism (MC) 혼합은 용어에 있을 때 기증자와 받는 사람 파생 셀 동시에 다양 한 반면 기증자 파생 된 세포에 의해 lymphohematopoietic 구획의 전체 교체를 의미 하는 일반적으로 비율입니다. 분할 chimerism (SC) 혼합된 chimerism erythroid 구획에서와 같은 단일 셀 계보에서 관찰의 동시 사용을 나타냅니다. 질병 재발 및 기증자 림프 구 혼합 또는 면역의 감소 등 시작 이후 immunomodulatory 전략 취약 환자를 식별할 수 있습니다 그것으로 chimerism 상태 HSCT 다음의 신속한 결정이 중요, 치료6.

HSCT 후 engraftment를 모니터링 하기 위한 여러 가지 방법이 개발 되었습니다. 면역 글로불린의 Isotyping 및 세포 유전학 분석 가난한 감도 있고 다형성7,8감지 하는 그들의 능력에서 제한 됩니다. 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)의 소개 chimerism HSCT, 후 모니터링에서 감도 향상 시킬 수 있습니다 하지만 섹스 불일치 이식9로 제한 됩니다. 현재, 연쇄 반응 (PCR) chimerism를 검색 하는 데 사용 가장 광범위 한 방법 이며 변수 번호 탠덤 반복 (VNTRs)의 전통적인 agarose-아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법에 따라 또는 짧은 탠덤 반복 (STRs). 일상적으로 사용 양이 많은 PCR는 HSCT 다음 잔여 기증자 세포의 아주 작은 비율을 감지 수 있습니다. 지금까지 연구의 주요 한계는 MC 탐지 nucleated 세포 보다는 성숙 적혈구의 존재로 거의 독점적으로 제한, 즉 그 환자에 대 한 기능적으로 중요 한 영향을 받는 hemoglobinopathies 세포. 환자에서 다른 혈액 그룹, 그것은 cytofluorometric 분석은 단일 클론 항 체는 적혈구 항 원 ABO와 C, c, D, E 및 e10 으로 이동 하 여 적혈구에서 chimerism를 식별할 수 있게 기억할 만한 가치가 , 11. erythroid 계보에서 chimerism 평가의 서로 다른, 하지만 매우 재미 있는 의미는 흐름 cytometric clonogenic 분석 실험, 배양에 의해 erythroid 창시자 및 다양 한 erythroid 조상 종류의 정렬의 조합 다음 STR12의 분석. 이 방법은 erythroid 구획에서 기증자와 받는 사람 chimerism의 상대 비율을 정할 수 이며 골 수 이식 유지 전략에 활용 될 수 있습니다.

Protocol

1. 절연의 조 혈 골 수 세포 다중 매개 변수 형광 활성화 된 세포 분류에 의해 샘플 얼룩이 지는 프로세스를 시작 하기 전에, 다음 항목 수집 필요가 준비: 12 x 75 m m 흐름 관 얼룩 세포 단의 준비에 대 한 그라데이션 미디어 (GM), 50 mL 원뿔 튜브 셀 얼룩 버퍼: 인산 염 (PBS) + 3% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 버퍼링 펫 FC 블록 및 항 체 (CD34 APC, CD3…

Representative Results

FACS 셀 정렬 lymphohematopoietic 창시자의 분리 우리 여기에서 다운스트림 STR 분석에 필요한 세포 인구를 정렬 결과 보여 줍니다. 골 수 세포 V450 활용 된 안티-CD45, FITC 활용 된 안티-CD36와 APC 활용 된 안티-CD34 얼룩이 있었다. 관심의 인구는 megakaryocyte erythroid 창시자 (MEP), nucleated 세포 적혈구의 개발에 대 한 책임 이다. 이…

Discussion

현재 연구의 목적은 hemoglobinopathies 치료 분석 기증자/받는 사람 chimerism erythroid 창시자 HSCT 환자에서 다음에 대 한 관객에 게 두 가지 방법의 조합을 제공 하는: 1.) 형광 활성화 된 세포 분류 조상 조 혈 모 세포 골 수 샘플 짧은 탠덤 반복 및 2의 분석에 의해 다음에.) 콜로 니 형성 단위 성장, 골 수 세포의 다양 한 시 조 형식에 식민지의 분류 다음 짧은 탠덤 반복의 분석. 이 방법의 참신 개별 식민지?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 Kinderkrebshilfe의 무지개 Südtirol에 의해 지원 되었다.

Materials

Ficoll-Paque GE Healthcare GE17-1440-02  Remove RBC
50 mL conical tubes Falcon 14-432-22 Sample preparation
12 x 75 mm flow tubes Falcon 352002 FACS sorting
Phosphate buffered saline Gibco 10010023 PBS
Fetal calf serum Invitrogen Inc. 16000-044 FCS (heat-inactivated)
CD34 APC BD Bioscience 561209 FACS-Ab
CD36 FITC BD Bioscience 555454 FACS-Ab
CD45 V450 BD Bioscience 642275 FACS-Ab
Trypan blue Gibco 15250061
Hemocytometer Invitrogen Inc. C10227 Automatic cell counting
Hank’s Balanced Salt Solution Gibco 14025092 Suspension buffer in FACS analysis
HEPES Gibco 15630080 Component of suspension buffer
FcR BD Bioscience 564220 Block FCR
FACS Aria I BD Bioscience 23-11539-00 FACS Sorter
Recombinant  human erythropoietin Affimetrix eBioscience 14-8992-80 EPO
Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium Gibco 12440053 IMDM
L-Glutamine Invitrogen 25030-081 Component of Culture Medium
CD34+ magnetic beads Milteny Biotech 130-046-702 CD34+ purification
Recombinant  human G-CSF Gibco PHC2031 CFU-Assay
Recombinant  human SCF Gibco CTP2113 CFU-Assay
Recombinant  human GM-CSF Gibco PHC2015 CFU-Assay
Recombinant  human IL-3 BD Bioscience 554604 CFU-Assay
Recombinant  human IL-6 BD Bioscience 550071 CFU-Assay
Methocult H4434 Medium Stemcell Technologies 4444 CFU-Assay
QiAmp DNA Blood extraction kit Qiagen 51306 DNA Isolation
Nanodrop ND-1000 spectra photometer Thermo Scientific ND 1000 DNA Quantification
DNAase free H2O Thermo Scientific FEREN0521 DNA Preparation
AmplTaq Gold DNA Polymerase Applied Bioscience N8080240 PCR
Eppendorf mastercycler gradient Eppendorf 6321000019 PCR 
Hi-Di Formamid Applied Bioscience 4311320 PCR
GeneScan 500 ROX Size Standard Applied Bioscience 4310361 PCR
3130 Genetic Analyzer Applied Bioscience 313001R PCR

Referências

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Citar este artigo
Crazzolara, R., Kropshofer, G., Steurer, M., Sopper, S., Schwinger, W. Detection of Residual Donor Erythroid Progenitor Cells after Hematopoietic Stem Cell Transplantation for Patients with Hemoglobinopathies. J. Vis. Exp. (127), e56002, doi:10.3791/56002 (2017).

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