JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genética

Иммунопреципитация хроматина (ChIP) в линиях Т-клеток мыши

Published: June 17, 2017
doi:
10.3791/55907
, ,
1Institute of Biochemistry,University of Giessen

Summary

В этой работе описывается протокол иммунопреципитации хроматина (ChIP) с использованием зрелой мышиной линии Т-клеток. Этот протокол подходит для исследования распределения конкретных меток гистонов на конкретных сайтах-промоторах или в геноме.

Abstract

Сигнальные пути регулируют программы экспрессии генов посредством модуляции структуры хроматина на разных уровнях, таких как посттрансляционные модификации (ПТМ) хвостов гистонов, обмен каноническими гистонами с вариантами гистонов и выселение нуклеосом. Такое регулирование требует связывания чувствительных к сигналу факторов транскрипции (ТФ), которые набирают хроматин-модифицирующие ферменты в регулятивных элементах, определяемых как усилители. Понимание того, как сигнальные каскады регулируют активность энхансера, требует всестороннего анализа связывания TF, ферментов, модифицирующих хроматин, и заполнения специфических гистоновых меток и вариантов гистонов. Анализы иммунопреципитации хроматина (ChIP) используют высокоспецифичные антитела к иммунопреципитации специфических комплексов белка / ДНК. Последующий анализ очищенной ДНК позволяет идентифицировать область, занятую белком, распознаваемым антителом. Эта работа описывает протокол для эффективного управленияRform ChIP белков гистонов в зрелой линии Т-клеток мыши. Представленный протокол позволяет проводить анализы ChIP в разумные сроки и с высокой воспроизводимостью.

Introduction

Развитие, дифференцировка и гомеостаз зависят от конкретных программ экспрессии генов, которые устанавливаются сигнальными событиями, которые модулируют структуру хроматина и, следовательно, определяют, активирован или репрессирован конкретный ген, специфичным для клеток и времени. Во время развития Т-клеток необходимо установить специфические программы экспрессии генов, чтобы правильно определить созревание предшественников Т-клеток из двойного отрицательного (DN) в однополюсное состояние (SP), проходя через несколько промежуточных этапов 1 . Как динамическая регуляция программы экспрессии генов в процессе развития Т-клеток широко исследовалась в предыдущие годы несколькими лабораториями 2 , 3 , 4 , 5 , 6 .

В результате посттрансляционных модификаций (ПТМ) гистонов обменКанонические гистоны с вариантами гистонов, выселение нуклеосом и метилирование ДНК регулируют переключатель ON / OFF генов. Несколько групп исследовали распространение генома РММ и вариантов гистонов в геноме для определения меток, связанных с различными состояниями хроматина как в проксимальной, так и в дистальной областях регуляции 7 , 8 , 9 , 10 . Сигнализационные каскады организуют динамическую регуляцию хроматина посредством обмена положительными и отрицательными хроматин-модифицирующими ферментами (также известными как модификаторы хроматина) у конкретных энхансерных элементов. Эти модификаторы хроматина регулируют структуру хроматина и, следовательно, выход транскрипции, например, путем динамического метилирования гистонов и ацетилирования. Это имеет место в канале 11 , 12 , 13 сигнализации Notch ,14.

Динамические гистоновые ПТМ; Обмены с вариантами гистонов; И динамическое заполнение гистонов, факторов транскрипции и кофакторов может быть исследовано с помощью анализов хроматина иммунопреципитации (ChIP). Для очистки специфических ДНК-белковых комплексов используют высокоспецифичные антитела, а очищенную ДНК анализируют с помощью количественной ПЦР (qPCR); Глубокое упорядочение (ChIP-Seq); Или, реже, в настоящее время, гибридизацию с микрочипом (ChIP-ChIP).

Анализы ChIP иногда сложны из-за осложнений с лизису клеток, срезанием хроматина и / или низкой специфичностью антител. Было принято несколько стратегий для улучшения протокола, как это имеет место для NEXSON 15 . Использование охлаждающих водяных ванн позволяет избежать нагревания образцов, которые могут повредить эпитопы, присутствующие на исследуемом белке, но энергия, необходимая для сдвига образцов, рассеивается в воде.Еще одно улучшение было достигнуто при разработке сфокусированных устройств ультразвуковой диагностики, которые препятствуют диспергированию энергии. Поэтому сфокусированные ультразвуковые устройства позволяют улучшить лизис клеток и сдвиг хроматина, устраняя вызванные оператором вариации и значительно увеличивая воспроизводимость.

Эта работа описывает протокол (схематический обзор на рисунке 1 ) для эффективного выполнения ChIP белков гистонов в зрелой мышиной T-клеточной линии E2-10HA 16 , 17 . Т-клетки обычно трудно лизировать, и было обнаружено, что сдвиг их хроматина неэффективен. В этом протоколе, который использует охлаждающий сфокусированный ультразвуковой преобразователь, количество ячеек, буфер лизиса и настройка сдвига были оптимизированы для линии Т-клеток мыши E2-10HA. Этот протокол позволяет выполнять ЧИП с высокой воспроизводимостью и в разумные сроки. Фактически, это требованиеПримерно через два дня, чтобы срезать хроматин и оценить качество срезания, и три дня для проведения иммунопреципитации, переверните сшивку и очистите ДНК.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ. Все буферы и среда, используемые в этом протоколе, перечислены в таблице 1 . Дни 1 и 2 1. Сшивание клеток Перенесите мышиные Т-клетки из 6-луночного планшета в трубку объемом 50 мл и центрифугируйте в течение 5 мин при 4 ° С и ~ 271 х г. Ресуспендируют клеточный осадок в 30 мл культуральной среды клеток IMDM и подсчитывают клетки с использованием камеры Нойбауэра. Собирайте аликвоты 20 × 10 6 клеток в новые 50 мл пробирки. Добавить формальдегид (FMA) до конечной концентрации 1% непосредственно в среду для культивирования клеток и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин. Осторожно: FMA токсичен при вдыхании, поэтому работайте под вытяжным колпаком и надевайте надлежащее защитное оборудование. Кроме того, обращайтесь с отходами FMA в соответствии с правилами принимающего учреждения. Добавьте 1/8-объем 1 М глицина, pH 7,0 и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин. Гранулируют клетки центрифугированием в течение 5Мин при 4 ° С и ~ 271 хг и промыть 10 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS). Промывают клеточный осадок 1 мл PBS и переносят в 1,5 мл пробирки. 2. Лизис клеток и резка хроматина Ресуспендируют клеточный осадок в 1 мл буфера для лизиса SDS и инкубируют на льду в течение 10 мин. Перенесите каждый образец в трубку для ультразвуковой обработки и выполните сдвиг с помощью сфокусированного ультразвукового устройства в соответствии с настройками, указанными в таблице 2. После сдвига перенесите образцы в 1,5 мл пробирки и центрифугируйте в течение 10 минут при 4 ° C и ~ 18000 x g. Перенесите супернатант в новые трубки. Соберите 50 мкл для определения эффективности сдвига в соответствии со стадией 3 и защелкните замороженный лизат в жидком азоте. Храните лизат в одноразовых аликвотах при -80 ° C. 3. Определение эффективности среза Добавить 50 мкл буфера для элюирования в 50 &181; L каждого срезанного лизата и инкубировать при 65 ° С в течение ночи, со встряхиванием. Добавьте 100 мкл ТЕ-буфера и 4 мкл 10 мг / мл РНКазы А (конечная концентрация 0,2 мкг / мкл). Смешать и инкубировать в течение 2 ч при 37 ° С, сотрясая. Добавьте 2 мкл 20 мг / мл протеиназы К (0,2 мкг / мкл конечной концентрации) к каждому образцу и инкубируйте в течение 2 ч при 55 ° С при встряхивании. Перенесите каждый образец в гель-трубку, подходящую для экстракции фенол / хлороформ / изоамиловый спирт; В соответствии с инструкциями производителя. Добавить 200 мкл фенола / хлороформа / изоамилового спирта (25: 24: 1) и встряхнуть трубки. Центрифуга в течение 5 минут при 24 ° C и ~ 16 000 xg и перенос верхней фазы на новые трубки. Осторожно: фенол, хлороформ и изоамиловый спирт являются токсичными при вдыхании и коррозии; Работайте под вытяжным шкафом и надевайте надлежащее личное защитное оборудование. Кроме того, обрабатывать фенол, хлороформ и изоамиловый спиртВ соответствии с правилами принимающего учреждения. Повторите один раз. Очистите ДНК с помощью колонок очистки в соответствии с инструкцией изготовителя со следующими изменениями: Промойте мембрану дважды. После последней стирки оставляйте трубу открытой в течение 2 мин при комнатной температуре для испарения остаточного этанола. Для элюирования добавьте 50 мкл H 2 O, инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 мин, закрутите пробирку в течение 1 с для надлежащего смачивания мембраны и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 мин перед элюированием ДНК центрифугированием в течение 1 мин при 24 ° C и ~ 17 900 x g. Количественный анализ очищенной ДНК на флюорометре с использованием набора с высокой чувствительностью в соответствии с инструкциями производителя. Проанализируйте приблизительно 500 нг очищенной ДНК на 1,8% агарозном геле и приблизительно 1 нг на электрофоретической системе с использованием набора с высокой чувствительностью. ПРИМЕЧАНИЕ. Ожидаемый результатE фрагментов ДНК составляет от 200 до 500 пар оснований. Дни 3 и 4 4. Иммунопреципитация Разбавьте 1 объем срезанного лизата с 5 объемами буфера для разведения. Пречистите 30 мкл / мл белковых агарозных гранул (приготовленных согласно Приложению А ) в течение 30 мин при вращении в холодной комнате. Центрифуга при 4 ° С в течение 5 мин при ~ 750 х g. Соберите 10% входного сигнала и храните его при 4 ° C. Выровняйте необходимое количество лизата в новые пробирки (подробности см. В таблице 3 ). Добавьте необходимые антитела в каждую пробирку (см. Таблицу 3 ) и вращайте ее в течение ночи при 4 ° C. Добавить 40 мкл белковых гранул А и инкубировать в течение 1 ч при 4 ° С при вращении. Вымойте шарики 1 мл буфера с низким содержанием соли, буфера с высоким содержанием соли, буфера LiCl и буфера TE (для каждой промывки инкубируйте в течение 5 мин при 4 ° С при вращении и центрифугеВ течение 3 мин при 4 ° С и ~ 950 мкг). Подробную информацию см. В таблице 3 . Добавить 110 мкл буфера для элюирования и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре, встряхивая каждые 2 мин. Центрифугируют в течение 3 мин при 4 ° С и ~ 950 мкг и переносят 100 мкл супернатанта в новую пробирку объемом 1,5 мл. Повторите шаги 4.7-4.8 с помощью 100 мкл буфера для элюирования и объедините элюаты. Добавьте буфер элюции до 200 мкл для ввода образцов. Инкубируйте все образцы в течение ночи при 65 ° C, сотрясая. День 5 5. Очистка ДНК Добавьте 200 мкл ТЕ-буфера в каждый элюат и 8 мкл 10 мг / мл РНКазы А (конечная концентрация 0,2 мкг / мкл). Смешать и инкубировать в течение 2 ч при 37 ° С, сотрясая. Добавьте 4 мкл 20 мг / мл протеиназы К (0,2 мкг / мкл конечной концентрации) в каждый элюат и инкубируйте в течение 2 ч при 55 ° С, сотрясая. Перенесите каждый образец в гельПробирка, подходящая для экстракции фенол / хлороформ / изоамиловый спирт; В соответствии с инструкциями производителя. Добавить 400 мкл фенола / хлороформа / изоамилового спирта (25: 24: 1) и встряхнуть трубки. Центрифуга в течение 5 мин при 24 ° С и ~ 16 000 х г. Перенесите верхнюю фазу на новые трубки. Осторожно: фенол, хлороформ и изоамиловый спирт являются токсичными при вдыхании и коррозии; Работайте под вытяжным шкафом и надевайте надлежащее личное защитное оборудование. Кроме того, обрабатывайте отходы фенола, хлороформа и изоамилового спирта в соответствии с правилами принимающего учреждения. Повторите один раз. Очистите ДНК с помощью колонок очистки в соответствии с инструкциями производителя со следующими изменениями: Промойте мембрану дважды. После последней промывки оставьте трубки открытыми в течение 2 мин при комнатной температуре для испарения остаточного этанола. Для элюирования добавьте 50 мкл H 2 O, инкубируйте при комнатной температуреПовтор ют в течение 1 мин, вращают пробирки в течение 1 с дл надлежащего смачивани мембраны и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 мин перед элюированием ДНК путем центрифугировани в течение 1 мин при 24oC и ~ 17,900 & bull; g.

Representative Results

Зрелые мышиные Т-клетки подвергали анализу ChIP для исследования обогащения монометилирования метки гистоном лизина 4 на гистоне 3 (H3K4me1), триметилировании лизина 4 на гистоне 3 (H3K4me3) и ацетилировании лизина 27 на Гистона 3 (H3K27ac), а также при загрузке нуклеосом, как показано panH3 ChIP. Качество среза оценивали анализом на 1,8% агарозном геле ( фиг. 2А ) и на электрофоретической системе ( фиг. 2В ). H3K4me1 и H3K4me3 обычно используются для идентификации сайтов-энхансеров и промоторов соответственно ( фиг. 3А ). Фактически, H3K4me3 является заметным, но не исключительно обогащенным промоторами 5 , 8 , 14 . Характеристика активных энхансеров должна быть высоко обогащена для H3K4me1 и H3K27ac и плохо обогащена для H3K4me3 (<Сильный класс = «xfig»> Рисунок 3A, верхняя панель), тогда как неактивные усилители представляют низкие уровни H3K4me3 и H3K27ac, но высокие уровни H3K4me1 ( рисунок 3A , нижняя панель). Как показано на фиг.3В , ген Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase ( Gapdh ) является репрезентативным для анализа активных промоторов генов ( промотор Gapdh ). Фактически, он показывает высокие уровни H3K4me3 и H3K27ac и низкие уровни H3K4me1. На рисунке 3B Deltex1 ( Dtx1 ) представляет собой неактивные энхансеры ( усилитель Dtx1 ), поскольку он высоко обогащен H3K4me1 и плохо обогащен для H3K4me3 и H3K27ac. Джин-пустыня является репрезентативной для региона, в котором отсутствуют кодирующие гены, и обычно применяется в качестве отрицательного контроля для активных меток хроматина. Наблюдение, что H3K4me1, хорошо принятая энхансерная отметка 4 , 5 , </sup> 7 , 14 , 18 , не обогащается в Джин-пустыне, говорит о том, что в этом регионе отсутствуют энхансеры. Рисунок 1: Схематический обзор представленного протокола ChIP. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2: Контроль качества среза зрелой мышиной линии Т-клеток. ( А ). Две различные аликвоты линии Т-клеток зрелой мыши E2-10HA были сдвинуты и приблизительно 500 нг очищенной ДНК были проанализированы на 1,8% агарозном геле для оценки их сдвигаКачества. ( B ) 1 нг очищенной ДНК из образца 2 анализировали электрофорезом для оценки его качества сдвига. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3: Хроматиновые метки, которые характеризуют усилители и промоторы. ( A ) Активные энхансеры (верхняя панель) характеризуются высоким H3K4me1, низким H3K4me3 и высоким H3K27ac, тогда как неактивные энхансеры (нижняя панель) имеют высокий H3K4me1, низкий H3K4me3 и низкий H3K27ac. ( B ) Образцы, представленные на фиг. 2A , объединяли вместе и использовали для анализа ChIP по сравнению с гистоновыми метками H3K4me1, H3K4me3 и H3K27ac и заполнением гистонов, как показано PanH3 ChIP. Этот анализ показывает, чтоE промотор гена домашнего хозяйства Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase ( промотор Gapdh ) высоко обогащен для H3K4me3 и H3K27ac и слабо обогащен для H3K4me1. С другой стороны, энхансер неактивного гена Deltex1 ( усилитель Dtx1 ) сильно обогащен для H3K4me1, но плохо обогащен для H3K4me3 и H3K27ac. ChIP с использованием антитела panH3 использовали для исследования активности нуклеосом. Джин-пустыня использовалась как отрицательный контроль. Показан один представительный эксперимент. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Название буфера реактив Конечная концентрация Буфер для разбавления Натрий-додекИлсульфат (SDS) 0,01% (мас. / Об.) Triton X-100 1,1% (об. / Об.) Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), pH 8,0 1,2 мМ Трис-HCl, pH 8,1 16,7 мМ Хлорид натрия (NaCl) 167 мМ Решение DMA Диметиладипимидат (DMA) 10 мМ Забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) 1x Элюирующий буфер Додецилсульфат натрия (SDS) 1% (мас. / Об.) Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), pH 8,0 10 мМ Трис-HCl, pH 8,0 50 мМ Высокий буфер соли Додецилсульфат натрия (SDS) 0,1% (мас. / Об.) Triton X-100 1% (об. / Об.) EthylenediamiНететрауксусная кислота (ЭДТА) pH 8,0 2 мМ Трис-HCl, pH 8,1 20 мМ Хлорид натрия (NaCl) 500 мМ Среда IMDM Исключительная среда Дульбекко (IMDM) 1x Фетальная бычья сыворотка (FBS) 2% (об. / Об.) Пенициллин / стрептомицин 1x Пептон-приматон 0,3 мг / мл Человеческий раствор инсулина 4,8 мг / мл Минимальные незаменимые аминокислоты (MEM NEAA) 1x Солевой буфер LiCl Хлорид лития (LiCl) 0,25 М IGEPAL-CA630 1% (об. / Об.) Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), pH 8,0 1 мМ Трис-HCl, pH 8.1 10 мМ Низкий буфер соли Додецилсульфат натрия (SDS) 0,1% (мас. / Об.) Triton X-100 1% (об. / Об.) Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), pH 8,0 2 мМ Трис-HCl, pH 8,1 20 мМ Хлорид натрия (NaCl) 150 мМ Буфер для очистки белков A Sepharose Трис-HCl, pH 8,0 20 мМ Хлорид натрия (NaCl) 500 мМ Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), pH 8,0 2 мМ Додецилсульфат натрия (SDS) 0,1% (мас. / Об.) IGEPAL-CA630 1% (об. / Об.) Буфер для лизиса SDS Додецилсульфат натрия (SDS) 1% (мас. / Об.) EthylenediАминететрауксусная кислота (ЭДТА), рН 8,0 10 мМ Трис-HCl, pH 8,1 50 мМ TE буфер Трис-HCl, pH 8,0 10 мМ Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), pH 8,0 1 мМ Таблица 1: Список буферов и среды, используемой в этом протоколе. НА OFF Пиковая мощность 150,0 2.5 Коэффициент полезного действия 15,0 15,0 Циклы / взрыв 500 500 Количество циклов 28 <p class="jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Таблица 2: Параметры сдвига, используемые в этом протоколе . Эти условия были оптимизированы для зрелой мышиной линии Т-клеток. антитело поставщик Количество антител / иммунопреципитация Количество клеток / иммунопреципитация Условия стирки H3 Аббам (ab1791) 2,5 мг 5 x 10 6 Однажды в буфере с низкой солью, дважды в буфере с высоким содержанием соли, дважды в буфере для соли LiCl и три раза в буфере TE H3K4me1 Abcam (ab8895) 2,5 мг 5 x 10 6 Однажды в буфере с низкой солью, дважды в буфере с высоким содержанием соли, дважды в буфере для соли LiCl и три раза в буфере TE H3K4me3 Диагодекс (pAb-003-050) 2,5 мг 5 x 10 6 Однажды в буфере с низкой солью, дважды в буфере с высоким содержанием соли, дважды в буфере для соли LiCl и три раза в буфере TE H3K27ac Диагодекс (pAb-174-050) 2,5 мг 5 x 10 6 Oce в буфере с низкой солью, дважды в буфере с высокой солью, дважды в буфере для соли LiCl и три раза в буфере TE IgG Диагеноз (C15410206) Переменная * Переменная * Переменная * * В случае контроля IgG количество как антитела, так и клеток, а также этапы промывки должны отражать условия других иммунопреципитаций. Таблица 3: Антитела и условия стирки, используемые в этом исследовании. <table border="1" fo:keep-together.within-page = "1" fo: keep-with-next.within-page = "always"> Ген Передний праймер Обратный праймер зонд Gapdh промотор (0 kb) 5'-GGG TTC CTA TAA ATA CGG ACT GC-3 ' 5'-CTG GCA CTG CAC AAG AAG A-3 ' 68 Усилитель Dtx1 (+26 kb) 5'-CTC TGG GTT GTA GGG GAC AG-3 ' 5'-GCA TGG GAA CTG TGT TAC AGA A-3 ' 27 Джин-пустыня 5'-CAA TGC ATG GGT CCA GAT TT-3 ' 5'-ATT GGC ACG GAA GTA GTG CT-3 ' 94 Таблица 4: Грунты и зонды, используемые для qPCR в этом исследовании. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-страница = "всегда"> проблема причины Решение Хроматин находится под срезом, а фрагменты слишком большие. Было использовано слишком много клеток. Уменьшите количество ячеек. Стрижка слишком низкая. Увеличьте количество циклов сдвига. Увеличьте пиковую мощность сдвига, коэффициент заполнения и / или цикл / взрыв. Хроматин перерезан, а фрагменты слишком малы. Было использовано слишком мало клеток. Увеличьте количество ячеек. Сдвиг слишком высок. Уменьшите количество циклов сдвига. Уменьшите пиковое значение сдвига, коэффициент заполнения и / или цикл / всплеск. Слишком низкое восстановление по сравнению с IGG и / или отрицательный контроль (высокий фон). Недостаточно хроматина, используемого для эксперимента. Увеличьте количество хроматина. Количество антител слишком низкое. Увеличьте количество антител. Количество антител слишком велико. Уменьшите количество антител. Антитело обладает низкой специфичностью. Измените антитело. Условия стирки слишком строгие. Уменьшите количество стирки. Уменьшите жесткость стиральных буферов. Условия стирки не являются достаточно строгими. Увеличьте количество стирки. Увеличьте жесткость стиральных буферов. Слишком много ДНК пипетировали в qPCR. Уменьшите количество ДНК, пипеткой в ​​qPCR. Условия qPCR не являются оптимальными. Оптимизируйте условия qPCR. Уменьшите количество циклов. В реакции qPCR входного образца продукт или продукт не слишком низки. Недостаточно ДНК пипетировали в qPCR. Увеличьте количество ДНК, пипеткой в ​​qPCR. Условия qPCR не являются оптимальными. Оптимизируйте условия qPCR. Увеличьте количество циклов. Недостаточно хроматина, используемого для эксперимента. Увеличьте количество хроматина. Нет сигнала в положительном контроле и / или panH3 ChIP. Недостаточно хроматина, используемого для эксперимента. Увеличьте количество хроматина. Количество антител слишком низкое. Увеличьте количество антител. АнтиТело имеет низкую специфичность. Измените антитело. Элюирование является субоптимальным. Не забудьте часто вихрировать образцы для поддержания бусинок в растворе. Таблица 5: Поиск и устранение неисправностей.

Discussion

ChIP является допустимым методом для исследования того, обогащены ли белки или их ПТМ в определенных геномных областях. Результаты анализа ChIP часто сложно интерпретировать по биологическим или техническим причинам. Биологические причины многообразны и включают слабое или непрямое связывание белков с ДНК. Существуют также технические ограничения, такие как ограниченная специфичность антител и неэффективный клеточный лизис или сдвиг хроматина. Руководство по поиску и устранению неисправностей ( Таблица 5 ) может помочь читателю решить проблемы, которые могут возникнуть при анализе ChIP.

Этот протокол, используя охлаждающее сфокусированное ультразвуковое устройство, позволяет эффективно сдвигать хроматин зрелой мышиной линии Т-клеток. Основной критический шаг протокола представлен сдвигом хроматина, который всегда должен быть оптимизирован для каждого типа ячейки. Предлагается варьировать количество ячеек и количество циклов обработки ультразвуком. Кроме того, она На эффективность реакции отрицательно влияет присутствие осадка SDS в образцах, которое может образоваться при лизении клеток на льду с помощью буфера для лизиса SDS. В этом случае лучше всего инкубировать образец после лизиса при комнатной температуре в течение нескольких минут, чтобы уменьшить присутствие осадков SDS. Рекомендуется оптимизировать протокол для получения срезанных фрагментов от 200 до 500 пар оснований и всегда оценивать качество срезанных образцов перед проведением иммунопреципитации. Кроме того, время фиксации, количество антитела и / или клеток и условия стирки должны быть оптимизированы для каждого антитела.

Еще одним важным шагом в успешном выполнении процедуры ChIP является выбор антитела, поскольку антитела с низкой специфичностью значительно снижают эффективность иммунопреципитации. Ранее единая процедура проверки качества позволила оценить специфичность нескольких антител, доступных на рынке Ss = "xref"> 19. Просеивающий трубопровод был основан на дот-блоте, вестерн-блоте и ChIP, предоставляя список высококачественных реагентов, подходящих для ChIP 19 . Совсем недавно специфика нескольких коммерчески доступных антител оценивалась с использованием высокоплотных гистоновых пептидных микроматричных платформ, позволяющих создать базу данных по специфичности антител 20 . Читатель может использовать этот полезный инструмент для определения наиболее специфических антител, которые могут быть использованы для экспериментов ChIP.

Этот протокол не был протестирован для первичных Т-клеток, и в этом случае читатель должен ссылаться на другие опубликованные протоколы, которые успешно выполняют ChIP на первичных Т-клетках 3 , 4 , 21 . Примечательно, что этот протокол был успешно использован для выполнения ChIP на линии T-клеток прародителя мыши, а также на линии эндотелиальных клеток мыши.

Ove_content "> 5 x 10 6 клеток должны использоваться для каждой иммунопреципитации для анализа меток гистонов. Поскольку этот протокол также может быть подходящим, с некоторой оптимизацией, для выполнения ChIP на TF или кофакторах, лучше всего увеличить количество клеток Используемого для иммунопреципитации в этих случаях. Чтобы достичь необходимого количества клеток для каждого эксперимента, больше аликвот срезанного лизата можно объединить вместе до разбавления хроматина в буфере для разведения.

Этот протокол также можно было бы модифицировать для выполнения ChIP на эндогенных белках, которые не связываются непосредственно с ДНК. В этом случае может потребоваться предварительная фиксация белково-белковыми сшивающими агентами ( например, диметиладипимидатом, DMA) (дополнительную информацию см . В приложении B ). Успешное выполнение ChIP на кофакторах ранее выполнялось с помощью сверхэкспрессирующих белков, которые слиты с биотином. В этом случае белок очищали стрептавидином-конъюнктомБыли выполнены магнитные бусины и предварительная фиксация с помощью DMA 22 .

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарны П. Кэсе и Т. Шмидт-Вёлл за отличную техническую помощь. Эта работа была поддержана совместным исследовательским грантом TRR81 и программой Гейзенберга (BO 1639 / 5-1) DFG (Германский исследовательский фонд), Общество Макса Планка и EXC 294 во Фрайбурге и Кластер Excellence для сердечно-легочной системы (ECCPS) в Гиссене с туберкулезом

Materials

Agilent High Sensitivity D5000 Reagents Agilent Technologies 5067-5593
Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape Agilent Technologies 5067-5592
Agilent Tapestation 4200 Agilent Technologies G2991AA
Covaris S220 AFA System Covaris 500217
dimethyl adipimidate (DMA) Thermo Fisher Scientific 20660
Fetal bovine serum (FBS) Pan-Biotech 1502-P121301
Formaldehyde (FMA) Sigma-Aldrich F8775
Insulin solution human  Sigma-Aldrich I9278-5ML
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) Gibco 21980-032
Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA) Gibco 11140-035
nProtein A Sepharose 4 Fast Flow GE Healthcare 17-5280-02
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140-122
Peptone primatone Sigma-Aldrich P4963-100G
Phase Lock Gel Heavy 2 ml 5 Prime 2302830
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) Roth A156.2
Phosphate-buffered saline (PBS) GIBCO 14190-094
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade Thermo Fisher Scientific 25530049
QIAquick PCR Purification Kit (250) Qiagen 28106
Qubit 3.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33216
Qubit assay tubes Thermo Fisher Scientific Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32854
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) Thermo Fisher Scientific EN0531
Tube AFA Fiber & Cap Covaris 520081
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Rothenberg, E. V. The chromatin landscape and transcription factors in T cell programming. Trends Immunol. 35 (5), 195-204 (2014).
  2. Zhang, J. A., Mortazavi, A., Williams, B. A., Wold, B. J., Rothenberg, E. V. Dynamic transformations of genome-wide epigenetic marking and transcriptional control establish T cell identity. Cell. 149 (2), 467-482 (2012).
  3. Cauchy, P., et al. Dynamic recruitment of Ets1 to both nucleosome-occupied and -depleted enhancer regions mediates a transcriptional program switch during early T-cell differentiation. Nucl Acids Res. 44 (8), 3567-3585 (2016).
  4. Koch, F., et al. Transcription initiation platforms and GTF recruitment at tissue-specific enhancers and promoters. Nat Struct Mol Biol. 18 (8), 956-963 (2011).
  5. Pekowska, A., et al. H3K4 tri-methylation provides an epigenetic signature of active enhancers. EMBO J. 30 (20), 4198-4210 (2011).
  6. Vanhille, L., et al. High-throughput and quantitative assessment of enhancer activity in mammals by CapStarr-seq. Nat Commun. 6, 6905 (2015).
  7. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  8. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  9. Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
  10. Ostuni, R., et al. Latent enhancers activated by stimulation in differentiated cells. Cell. 152 (1-2), 157-171 (2013).
  11. Giaimo, B. D., Oswald, F., Borggrefe, T. Dynamic chromatin regulation at Notch target genes. Transcription. 8 (1), 61-66 (2017).
  12. Liefke, R., et al. Histone demethylase KDM5A is an integral part of the core Notch-RBP-J repressor complex. Genes Dev. 24 (6), 590-601 (2010).
  13. Jung, C., Mittler, G., Oswald, F., Borggrefe, T. RNA helicase Ddx5 and the noncoding RNA SRA act as coactivators in the Notch signaling pathway. Biochim Biophys Acta. 1833 (5), 1180-1189 (2013).
  14. Oswald, F., et al. A phospho-dependent mechanism involving NCoR and KMT2D controls a permissive chromatin state at Notch target genes. Nucl Acids Res. 44 (10), 4703-4720 (2016).
  15. Arrigoni, L., et al. Standardizing chromatin research: a simple and universal method for ChIP-seq. Nucl Acids Res. 44 (7), e67 (2016).
  16. Essen, D., Dullforce, P., Brocker, T., Gray, D. Cellular interactions involved in Th cell memory. J Immunol. 165 (7), 3640-3646 (2000).
  17. White, J., et al. Two better cell lines for making hybridomas expressing specific T cell receptors. J Immunol. 143 (6), 1822-1825 (1989).
  18. Ghisletti, S., et al. Identification and characterization of enhancers controlling the inflammatory gene expression program in macrophages. Immunity. 32 (3), 317-328 (2010).
  19. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
  20. Rothbart, S. B., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
  21. Fenouil, R., et al. CpG islands and GC content dictate nucleosome depletion in a transcription-independent manner at mammalian promoters. Genome Res. 22 (12), 2399-2408 (2012).
  22. Hein, K., et al. Site-specific methylation of Notch1 controls the amplitude and duration of the Notch1 response. Sci Signal. 8 (369), ra30 (2015).

Tags

Chromatin ImmunoprecipitationChIPMouse T-cell LinesHistone MarksChromatin BiologyChromatin ShearingFormaldehyde CrosslinkingGlycine QuenchingSonicationFocused UltrasonicatorLysis BufferCell PelletSupernatant

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Giaimo, B. D., Ferrante, F., Borggrefe, T. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines. J. Vis. Exp. (124), e55907, doi:10.3791/55907 (2017).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image