Studi del Virus di riossidazione A in un modello murino di infezione
Summary
Influenza A virus (IAVs) è importanti patogeni respiratori umani. Per capire la patogenicità di IAVs e per eseguire test preclinici di approcci vaccinali romanzo, modelli animali che imita la fisiologia umana sono necessari. Qui, descriviamo le tecniche per valutare IAV patogenesi, le risposte umorali e l’efficacia del vaccino utilizzando un modello murino di infezione.
Abstract
Virus dell’influenza causano oltre 500.000 decessi in tutto il mondo1 e sono associati con un costo annuo di 12 miliardi USD negli Stati Uniti da solo considerando diretti medici e le spese di ospedalizzazione e lavoro assenteismo2. Modelli animali sono cruciali per l’Influenza A virus (IAV) studi per valutare patogenesi virale, interazioni ospite-patogeno, le risposte immunitarie e l’efficacia del vaccino attuale e/o romanzo si avvicina così come farmaci antivirali. I topi sono un modello animale piccolo vantaggioso perché il loro sistema immunitario è evolutivamente simile a quello trovato in esseri umani, sono disponibili dai fornitori commerciali come soggetti geneticamente identici, esistono ceppi multipli che possono essere sfruttate per valutare la base genetica delle infezioni, e sono relativamente poco costosi e facili da manipolare. Ricapitolando l’infezione in esseri umani tramite le vie aeree IAV, topi sono anestetizzati prima prima dell’inoculazione intranasale con infettive IAVs sotto biosicurezza corretto contenimento. Dopo l’infezione, la patogenesi di IAVs viene determinata monitorando quotidianamente la morbosità (perdita di peso corporeo) e tasso di mortalità (sopravvivenza). Inoltre, patogenesi virale possono anche essere valutati valutando la replicazione del virus nel tratto respiratorio inferiore (polmoni) dei topi infettati o superiore (mucosa nasale). Le risposte umorali dopo l’infezione IAV possono essere rapidamente valutate da sanguinamento non-invasivo e rilevazione dell’anticorpo secondario le analisi volte a rilevare la presenza del totale o neutralizzando gli anticorpi. Qui, descriviamo i metodi comuni utilizzati per infettare i topi per via nasale (n) con IAV e valutare la patogenesi, le risposte immunitarie umorali e l’efficacia di protezione.
Introduction
IAVs sono virus capsulati classificati nella famiglia Orthomyxoviridae 3. Essi contengono otto molecole di RNA singolo filamento con polarità negativa3. In esseri umani, IAVs causare epidemie stagionali e occasionali pandemie di conseguenza importante quando nuovi virus vengono introdotti in popolazione umana4. Inoltre, IAVs stagionale sono altamente e velocemente trasmessi tra gli esseri umani producono un’elevata perdita economica in tutto il mondo ogni anno2,5. IAV sintomi includono tosse, congestione nasale, febbre, malessere, cefalea, anoressia e mialgia, ma il virus è in grado di produrre una malattia più severa in pazienti immunocompromised6. Infatti, l’organizzazione mondiale della sanità (OMS) calcola che il virus dell’influenza stagionale causare 300.000-500.000 decessi in tutto il mondo ogni anno1. Ci sono solo due classi di farmaci attualmente approvati dalla Food and Drug Administration (FDA) per la profilassi dell’influenza e trattamento in esseri umani: gli inibitori della neuraminidasi (NA) (ad es., oseltamivir) e bloccanti del canale ionico M2 (ad es., amantadina); Tuttavia, l’emergere di varianti di virus resistenti ai farmaci è una crescente preoccupazione. Vaccinazione, pertanto, rimane la migliore opzione medica per proteggere l’uomo contro le infezioni IAVs. Ad oggi, tre tipi di influenza sono disponibili vaccini autorizzati dalla FDA per uso umano: i vaccini di proteina ricombinante virale emoagglutinina (HA), inattivati vaccini contro l’influenza (IIV) e live-ha attenuato l’influenza vaccini (LAIV)5, 7. i tre vaccini sono progettati per indurre la risposta immunitaria adattativa contro la proteina virale HA, l’obiettivo principale di neutralizzazione degli anticorpi contro IAVs.
Un modello del mouse convalidato per studiare IAV infezione in vivo
Modelli animali sono stati utilizzati per studiare, tra gli altri, IAV patogenesi8,9,10,11, fattori virali che contribuiscono alla malattia12 e/o trasmissione virale13 ,14, e per testare l’efficacia di nuovi vaccini o antivirali farmaci9,10,15. Topi (Mus musculus) sono il più estesamente usato modello animale per la ricerca IAV per diversi motivi: 1) il sistema immunitario è evolutivamente simile a quella presente negli esseri umani; 2) basso costo, tra cui acquisto animali, alloggiamento e riproduzione; 3) di piccola dimensione per facilmente manipolare e memorizzare; 4) variabilità di host minimo per ottenere risposte omogenee e risultati; 5) una grande conoscenza della biologia di topi, tra cui la sequenza del genoma; 6) molti disponibile biologia molecolare e/o reagenti di immunologia; 7) disponibili topi knock out (KO) per studiare il contributo di una proteina di host specificato sull’infezione virale; e, 8) più ceppi di topi che possono essere sfruttate per valutare la base genetica delle infezioni.
Ci sono diversi ceppi di topi attualmente disponibili per studiare IAV in vivo. Età, stato immunitario, sesso, ceppo genetico di sfondo e il mouse così come vie di infezione, dose e ceppi virali di tutti influenzano l’esito dell’infezione IAV in topi. I ceppi del mouse più comuni usati nella ricerca IAV sono C57BL/6, BALB/C e, più recentemente, DBA.2 topi dato che sono più suscettibili alla malattia IAV che le due ex ceppi16,17,18, 19 , 20. cosa importante, la risposta immunitaria anche può essere diversa a seconda del mouse ceppo18,19,20. Così, è molto importante recuperare tutte le informazioni disponibili circa il mouse e lo sforzo IAV per scegliere l’opzione migliore per l’esperimento deve essere effettuata.
Anche se il mouse è un buon modello animale di infezione per gli studi in vivo con IAV, hanno diverse limitazioni, che devono essere considerati nel disegno sperimentale. Per esempio, una limitazione importante dell’utilizzo di topi per studi in vivo è che IAVs non trasmettono fra i topi. Così, per la trasmissione di studi, più accettati modelli animali (ad es., furetti o porcellini d’India) sono usati16,17,21. Inoltre, ci sono molte differenze tra le manifestazioni di IAV in topi e gli esseri umani. Diversamente dagli esseri umani, i topi non sviluppano febbre dopo l’infezione IAV; al contrario essi presentano con ipotermia16,17. Nei topi, replica di IAV è concentrata nelle basse vie respiratorie (polmoni) piuttosto che le vie aeree superiori. Così, virulenza di IAV nei topi non è sempre correlato a quello visto negli esseri umani. Complessivamente, perché i vantaggi superano gli svantaggi limitati, mouse rappresenta il primo modello animale utilizzato per valutare la patogenesi virale dell’influenza, l’immunogenicità e l’efficacia negli studi di vaccini e farmaci antivirali. Inoltre, non sarebbe eticamente accettabile per condurre studi con IAV utilizzando modelli animali di grandi dimensioni senza prova precedente in un piccolo modello animale di infezione IAV. In questo manoscritto, descriveremo come infettare i topi per via nasale (i.n.) con IAV, come monitorare la gravità e il decorso dell’infezione virale e come effettuare gli esperimenti necessari per valutare le risposte immunitarie umorali e l’efficacia di protezione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modello del topo di IAV è ampiamente usato per in vivo gli studi di efficacia di patogenesi, immunogenicità e protezione IAV. Le piccole dimensioni dei topi li rende facili da manipolare e memorizzare rispetto agli altri modelli animali come furetti o porcellini d’India. Inoltre, la facilità in termini di costo di animale, alloggiamento e riproduzione permettono loro uso nelle prove di vaccinazione pre-clinici in cui sono necessarie grandi quantità di animali. In particolare, dal momento che i topi sono stat…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ricerca sul virus dell’influenza in laboratorio LM-S è parzialmente finanziata dal The New York Influenza Center of Excellence (NYICE), un membro dei NIAID centri di eccellenza per la ricerca sull’Influenza e sorveglianza (CEIRS). Ringraziamo Wendy Bates per il suo sostegno nelle correzioni del manoscritto.
Materials
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells | ATCC | CCL-34 | |
| Six- to eight-week-old female C57BL/6 mice | National Cancer Institute (NCI) | 01XBE | |
| Turckey red blod cells | Biolink Inc | Store at 4°C | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4°C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20°C |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100X | Corning | 30-009-CI | Store at -20°C |
| Penicillin/Streptomycin (PS) 100X | Corning | 30-00-CI | Store at -20°C |
| Bovin Albumin solution (BA) | Sigma-Aldrich | A7409 | Store at 4°C |
| Bovin Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4°C |
| Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | Store at -20°C |
| Neutral Buffered Formalin 10% | EMD | 65346-85 | Store at RT |
| Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at RT |
| Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 | ATTC | H16-L10-4R5 | Store at -20°C |
| Polyclonal rabbit anti-mouse immunoglobulins/FITC | Dako | F0261 | Store at 4°C |
| ECL Anti-mouse IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody | GE Healthcare | LNA931V/AG | Store at 4°C |
| TMB substrate set | BioLegend | 421101 | Store at 4°C |
| Vmax Kinetic plate reader | Molecular Devices | ||
| Dounce Tissue Grinders | Thomas Scientific | 7722-7 | |
| Receptor destroying enzyme, RDE (II) | Denka Seiken Co. | 370013 | Store at -20°C |
| Crystal Violet | Fisher Scienctific | C581-100 | Store at RT |
| 96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| Cell Culture dishes 100mm | Greiner Bio-one | 664-160 | |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | Thermo Fisher Scienctific | 269620 | |
| Nunc 96-Well Polystyrene Conical Bottom MicroWell Plates | Thermo Fisher Scienctific | 249570 | |
| Puralub Vet Ointment | Dechra | 9N-76855 | |
| Fluorescent microscope | Olympus | Olympus IX81 |
Referências
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