Quadruple Immunfärbung der olfaktorischen Glühbirne zur Visualisierung von olfaktorischen sensorischen Axon Molecular Identity Codes
Summary
Olfaktorische sensorische Neuronen exprimieren eine Vielzahl von Axon-sortierenden Molekülen, um eine korrekte neuronale Schaltung zu etablieren. Dieses Protokoll beschreibt eine immunhistochemische Färbemethode, um kombinatorische Ausdrücke von Axon-sortierenden Molekülen an den Axon-Termini von olfaktorischen sensorischen Neuronen zu visualisieren.
Abstract
Das Maus-Geruchs-System wird oft verwendet, um Mechanismen der neuronalen Schaltung Bildung wegen seiner einfachen anatomischen Struktur zu studieren. Ein olfaktorisches sensorisches Neuron (OSN) ist eine bipolare Zelle mit einem einzelnen Dendrit und einem einzigen unverzweigten Axon. Ein OSN exprimiert nur ein Olfactory Receptor (OR) Gen, OSNs, die eine gegebene Art von OR exprimieren, konvergieren ihre Axone zu einigen Sätzen von invarianten Glomeruli in der Olfactory Bulb (OB). Ein bemerkenswertes Merkmal der OSN-Projektion ist, dass die ausgedrückten ORs lehrreiche Rollen in der axonalen Projektion spielen. ODER regulieren die Expression von multiplen axon-sortierenden Molekülen und erzeugen den kombinatorischen molekularen Code von axon-sortierenden Molekülen an den OSN-Axon-Termini. Um also die molekularen Mechanismen von OR-spezifischen Axon-Guidance-Mechanismen zu verstehen, ist es wichtig, ihre Expressionsprofile an den OSN-Axon-Termini innerhalb des gleichen Glomerulus zu charakterisieren. Das Ziel dieses Artikels war es, Methoden zum Sammeln von so vielen Glomeruli wie möglich einzuführenE auf einem einzigen OB-Abschnitt und zur Durchführung von Immunfärbung mit mehreren Antikörpern. Dies würde den Vergleich und die Analyse der Expressionsmuster von axon-sortierenden Molekülen ohne Färbevariation zwischen OB-Abschnitten ermöglichen.
Introduction
Während der Entwicklung sind die Neuronen genau miteinander verbunden, um korrekte neuronale Schaltkreise zu bilden, was für die normale Hirnfunktion entscheidend ist. Da abweichende neuronale Schaltkreise im Gehirn die Ursache von psychischen Störungen wie Autismus und Schizophrenie sind, ist das Verständnis der Mechanismen der neuronalen Kreislaufbildung eine der größten Herausforderungen auf dem Gebiet der Neurowissenschaften.
Im Maus-olfaktorischen System exprimiert jedes Olfaktorische sensorische Neuron (OSN) im Olfaktorischen Epithel (OE) nur ein funktionelles Olfaktorisches Rezeptor (OR) -Gen und OSNs, die das gleiche OR exprimieren, konvergieren ihre Axone zu einem bestimmten Paar von Glomeruli an stereotypen Stellen in der Olfaktorische Glühbirne (OB) 1 , 2 . Das Maus-Geruchs-System ist ein ausgezeichnetes Modellsystem für das Studium der molekularen Mechanismen der neuronalen Schaltungsbildung, da die Forscher die ODER-Expression verwenden können, um eine spezifische s zu identifizierenUbtyp von OSNs und visualisieren die Projektionsstellen von OSN-Axonen als klare glomeruläre Strukturen. Ein bemerkenswertes Merkmal der OSN-Projektion ist, dass ORs lehrreiche Rollen bei der Projektion von OSN-Axonen zum OB 3 , 4 , 5 , 6 spielen. Genauer gesagt, nachdem OSN-Axone zu Näherungs-Zielregionen geführt wurden, werden sie in einer ODER-abhängigen Weise zu Glomerulus segregiert. Frühere Studien haben gezeigt, dass ODER-Moleküle die Expression von axon-sortierenden Molekülen steuern, die die glomeruläre Segregation regulieren 7 , 8 . Darüber hinaus deutet der akkumulierende Beweis darauf hin, dass OR-Moleküle den neuronalen Identitätscode durch eine einzigartige Kombination von axon-sortierenden Molekülen 9 erzeugen. Um also den Mechanismus der OR-abhängigen glomerulären Segregation zu verstehen, ist es notwendig, die Expressionsprofile des axon-sortierenden mol zu charakterisierenEcules in OSNs.
Fluoreszierende Immunfärbung ist eine gängige Methode, um die Expression spezifischer Gene zu visualisieren. Da Proteine von Axon-Sortiermolekülen überwiegend auf OSN-Axone lokalisiert sind, müssen Forscher OB-Sektionen verwenden, um ihre Expressionsmuster in OSNs zu charakterisieren. Der koronale Schnitt des OB wurde routinemäßig für die Immunfärbung verwendet. Diese Vorbereitung verliert jedoch die topographische Information entlang der anterior-posterioren Achse im gleichen OB-Abschnitt. Wir haben daher eine parasagittale Vorbereitung der medialen Seite des OB entwickelt, die so viele umliegende Glomeruli wie möglich auf dem gleichen OB-Abschnitt aufbringen kann. Kombiniert mit der Immunfärbung unter Verwendung mehrerer Antikörper, ermöglicht dieses Präparat den Vergleich und die Analyse der Expressionsmuster von axon-sortierenden Molekülen ohne Färbevariation zwischen OB-Sektionen.
Weiterhin wurde eine immunhistochemische Färbemethode ohne Nachfixierung mit PFA a vorgestelltSaccharosebehandlung. Diese Methode ermöglicht es Forschern, genügend qualitativ hochwertige Färbedaten für die multivariable Datenanalyse zu erhalten. Die hier vorgestellten Protokolle geben Details für leistungsstarke Methoden für Forscher, die die olfaktorische neuronale Schaltungsbildung untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Quadruple-Immunfärbung von parasagittalen OB-Sektionen ermöglichte die Visualisierung und Quantifizierung der Expressionsniveaus von bis zu vier Axon-Sortiermolekülen gleichzeitig in einer größeren Anzahl von Glomeruli. Durch die Analyse dieser multivariablen Daten mit PCA können die Eigenschaften für die Expression dieser Moleküle spekuliert werden.
Für eine erfolgreiche Färbung ist die Gewebeprobenpräparation von entscheidender Bedeutung. Einige Protokolle deuten darauf hin,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Mitsubishi Foundation, der Takeda Science Foundation, JST PRESTO und JSPS KAKENHI Grant Number 16H06144 unterstützt.
Materials
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TAKARA BIO | T9181 | |
| Skim Milk | nacalai tesque | 31149-75 | |
| goat anti-Sema7A antibody | R&D Systems | AF2068 | |
| rat anti-OLPC antibody | Merck Millipore | MABT20 | |
| mouse anti-VGLUT2 antibody | Merck Millipore | MAB5504 | |
| goat anti-BIG-2 antibody | R&D Systems | AF2205 | |
| gunea pig anti-Kirrel2 antibody | Operon Biotechnologies | Anti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP | |
| donkey anti-mouse Alexa Fluor 405 | Abcam | ab175658 | |
| donkey anti-goat Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21432 | |
| donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| MAS coated slide glasses | MATSUNAMI | MAS-01 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11253-27 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X700 | |
| DAPI filter cube | KEYENCE | OP-87762 | |
| GFP filter cube | KEYENCE | OP-87763 | |
| TRITC filter cube | KEYENCE | OP-87764 | |
| Cy5 filter cube | KEYENCE | OP-87766 | |
| filter paper | ADVANTEC | 00011185 | |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | M71484 |
Referências
- Mori, K., Sakano, H. How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain?. Annu Rev Neurosci. 34, 467-499 (2011).
- Takeuchi, H., Sakano, H. Neural map formation in the mouse olfactory system. Cell Mol Life Sci. 71, 3049-3057 (2014).
- Mombaerts, P., et al. Visualizing an olfactory sensory map. Cell. 87, 675-686 (1996).
- Feinstein, P., Mombaerts, P. A contextual model for axonal sorting into glomeruli in the mouse olfactory system. Cell. 117, 817-831 (2004).
- Ishii, T., et al. Monoallelic expression of the odourant receptor gene and axonal projection of olfactory sensory neurones. Genes Cell. 6, 71-78 (2001).
- Nakashima, A., et al. Agonist-independent GPCR activity regulates anterior-posterior targeting of olfactory sensory neurons. Cell. 154, 1314-1325 (2013).
- Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127, 1057-1069 (2006).
- Kaneko-Goto, T., Yoshihara, S., Miyazaki, H., Yoshihara, Y. BIG-2 mediates olfactory axon convergence to target glomeruli. Neuron. 57, 834-846 (2008).
- Ihara, N., Nakashima, A., Hoshina, N., Ikegaya, Y., Takeuchi, H. Differential expression of axon-sorting molecules in mouse olfactory sensory neurons. Eur J Neuro. 44, 1998-2003 (2016).
- Williams, E. O., et al. Delta Protocadherin 10 is Regulated by Activity in the Mouse Main Olfactory System. Front Neural Circuits. 5, 9 (2011).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17, 681-693 (1996).
