Modellierung von neuronalen Tod und Degeneration in Maus primären zerebelläre Granulat Neuronen

Zerebelläre Granulat Neuronen (CGNs) zeichnen sich auch in der Kultur und dienten als ein effektives Modell neuronalen Tod und Entwicklung ^1,2,3,4,5, zu studieren ⁶. der frühen Ausdruck der N-Methyl-D-Aspartat-(NMDA)-Rezeptoren in CGN Kulturen in Vitro macht ihnen ein attraktives Modell, NMDA-induzierte Signalisierung zu studieren. Aktivierung dieser Rezeptoren mit NMDA in Verbindung mit Membran-Depolarisation wird verwendet, um physiologische neuronale Aktivität Stimulation zu modellieren und hat für die Forschung über die Mechanismen der synaptischen Plastizität ^7,8erlaubt. Im Gegenteil, kann über-Stimulation dieser Rezeptoren durch NMDA-Liganden Excitotoxizität, einen wichtigen Mechanismus der neuronaler Verlust in akuten Hirnschäden und Neurodegenerative Krankheiten ⁹modellieren verwendet werden. Ein Mechanismus für die Induktion der Excitotoxizität ist durch ATP Hunger mit reduzierter Sauerstoff mit akuten neuronalen Verletzung gesehen. Dies führt zu Membran-Depolarisation und erhöhte Konzentrationen von Glutamat frei an der Synapse. Die nachfolgenden Reizüberflutung des NMDA-Rezeptors durch erhöhte Glutamat führt zu übermäßiger Ca^{2 +} Zustrom über diese Rezeptoren, die wiederum mehrere Wege einschließlich Ca^{2 +}aktiviert-aktiviert Proteasen, Phospholipases, und jedoch, was in den unkontrollierten Abbau von kritischen zellulären Komponenten und Zelltod. Darüber hinaus führt hohe intrazelluläre Ca^{2 +} auf die Generation der freie Sauerstoff-Radikale und mitochondriale Schäden ^10,11.

Während die Mehrheit der neuronalen Verlust nach NMDA-induzierten neuronalen Excitotoxizität aufgrund Kalzium Zustrom und Bax/Bak unabhängige, werden nicht andere Mechanismen des Zelltods von diesem Modell ausgeschlossen. Das Aussehen der beiden nekrotische und apoptotischen Zelltod durch Excitotoxizität teilweise durch die Generation von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und DNA-Schäden durch^{hohe intrazelluläre Ca 2 +} Level ¹²ist. DNA-Schädigung führt zu neuronalen Tod durch Apoptose Mechanismen, mit Markenzeichen des apoptotischen Zelltod, wie das Auftreten von Chromatin Massen und Apoptotic Körper korreliert werden. Induktion der Apoptose ist vermittelt durch die Freisetzung von Cytochrom c aus Mitochondrien und hat gezeigt, dass Bax/Bak Oligomerisierung ¹³abhängig sein. Bax/Bak Oligomerisierung fördert Porenbildung in der äußeren mitochondrialen Membran, was zu Cytochrom C Version und die Aktivierung der Pro-apoptotische Regulierungsbehörden wie mit milden ischämische Schädigung ¹⁴gesehen.

Generation von ROS ist ein wichtiges Thema im Gehirn aufgrund der niedrigen endogenen Antioxidantien, gepaart mit der großen Sauerstoffbedarf für neuronale funktionierenden ¹⁵. Wenn zu einem ischämischen Ereignis ausgesetzt, ist Stickoxid-Synthase hochreguliert, Produktion von Stickstoffmonoxid und Erhöhung der reaktiven Sauerstoff-Spezies- ¹⁴. Die erhöhte Konzentration von Sauerstoff-Radikalen kann DNA-Schäden führen und indirekt Energie Hunger verursachen. Hohes Maß an DNA-Doppelstrang-Brüche werden durch die Aktivierung von Poly ADP-Ribose-Polymerase-1 (PARP-1), eine eukaryotische Chromatin-gebundenen Protein verantwortlich für katalysieren die Übertragung der ADP-Ribose Einheiten von NAD⁺, ein integraler Bestandteil der Prozess behoben. DNA-Reparatur- ¹⁶. Jedoch mit unverhältnismäßig großer Schäden durch oxidativen Stress, kann Aktivierung von PARP-1 Energie Hungertod aufgrund der erhöhten Abfluss auf NAD⁺, notwendige Substrat für die ATP-Produktion durch Oxidative Phosphorylierung führen. Letztlich oxidativer Stress löst Apoptose in gewissem Bax/Bak abhängig zur mitochondrialen Cytochrom C Veröffentlichung, und hat gezeigt, dass mitochondriale Umbau in CGNs ¹⁷zu induzieren.

Zu guter Letzt können Konzentrationsänderungen von Kaliumchlorid (KCl) in CGN Kulturen zu niedrigen Kalium/Depolarisation vermittelte Apoptose ^18,19,20Modell verwendet werden. Wenn auf ein niedriges Niveau von K⁺ausgesetzt, unterziehen CGNs unterschiedliche physiologische Veränderungen, was zu Kürzungen der mitochondrialen Atmung und Glykolyse, verminderte zelluläre Nachfrage ²¹, zugeschrieben sowie Abstriche an nuklearer Faktor-κB (NFκB) die Aktivitäten wie Entzündungen und synaptische Übertragung ²²regelt. Dieses Modell ist von besonderem Interesse für das Studium der Zelltod während der neuronalen Entwicklung. Die niedrigen K⁺ Umwelt mehr ähnelt physiologische Bedingungen, und bewirkt, dass Kennzeichen des Zelltods gesehen während der neuronalen Entwicklung ²³.

Zusammenfassend bieten CGNs eine langjährige Modell, um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der neuronalen Tod und Degeneration zu untersuchen. Das folgende Protokoll ermöglicht Isolierung und Kultivierung von CGNs, Ausdruck oder Unterdrückung von bestimmten genetischen Weg mit Viren und die Induktion der neuronalen Tod durch unterschiedliche Mechanismen aus neuronalen Verletzungen und Degeneration.