Summary

光干渉断層計: マウス網膜神経節細胞In Vivoイメージング

Published: September 22, 2017
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Summary

本稿では、高分解能のスペクトル領域光干渉断層法 (SD OCT) とマウス網膜の生体内イメージングのためのプロトコルについて説明します。それは網膜神経節細胞 (RGC) のいくつかのスキャンと説明方法を定量化、視神経乳頭周囲地域に焦点を当てください。

Abstract

網膜の構造変化は、眼疾患の一般的な症状です。光干渉断層計 (OCT)、識別可能生体内で-迅速、繰り返し、かつ高解像度で。このプロトコルでは、視神経症 (OPN) を研究するための強力なツールとしてマウス網膜における OCT イメージングについて説明します。OCT システムは共通の事後の組織学的アッセイに干渉法に基づく、非侵襲的代替です。それは網膜の間引きや肥厚などの変更を追跡する可能性を許可する網膜の厚さの迅速かつ正確な評価を提供します。Opa1delTTAGマウス線の例と画像の処理と解析を提案します。スキャンの 3 種類が提案されている、2 つの定量方法: 標準的な自家製のキャリパー。ラジアル スキャン中に視神経乳頭周囲網膜の上の使用に最適、後者は薄い構造の分析により正確であること、お勧めします。ここで説明したすべてのアプローチの網膜神経節細胞 (RGC) のデザインしますが、他の細胞集団に容易に適応可能であります。結論として、10 月マウス モデル表現型では効率よく、治療の信頼性評価に使用する可能性があります。

Introduction

OCT は、網膜構造1、視神経乳頭視神経などの検討を容易にする診断ツールです。長年にわたって齧歯動物45人間2,3病気の進行の信頼性の高い指標になりました。2 μ m の軸解像度の網膜の層の断面像を作成するのに干渉計を使用します。最も内側の層は、網膜神経線維層 (視神経) RGC 軸索を含む主 RGC 体を含む神経節細胞層 (GCL) が続いています。次に、RGC 樹状突起がバイポーラ、水平、およびアマクリン細胞の軸索を満たす内部網状層 (IPL) です。水平細胞と共に、これらは内部の核層 (INL) を形成し、その突起を結ぶ外網状層 (OPL) における視細胞軸索。これは光受容体細胞体による外核層 (ONL) が続き、内部セグメント/外側セグメントとも呼ばれる外境界膜 (OLM)、視細胞層から分離されている (は/OS) 層。最後に、マウス網膜における最後の観察可能な層が網膜色素上皮 (RPE)、脈絡膜 (C)。単独での視神経が薄すぎてマウスを用いての測定通常このように、視神経/GCL の分析代わりには望ましい4,5です。別の可能性は IPL に加えて後者を含む GC の複雑なレイヤー、やすく厚くそしてこうしても 10 月を測定する4をスキャンします。その結果、10 月は OPNs のように網膜の病理組織学的の状態に洞察力を提供できます。

また、マウス網膜の厚さはしばしば事後組織学と分析されます。ただし、組織の採取、固定、切断、染色、取付、したがって、微妙な厚みの変化など、いくつかの欠陥に関するこのテクニック面の制限を検出できません。最後に、同じマウスはいくつかの時間にテストできませんのでポイントごとのペット数 OCT 用とは異なり大幅増加を研究します。すべてのすべてで、繰り返し非侵襲、高解像度、可能性、時間監視時間と OCT 技術の使いやすさで、選択の方法網膜疾患研究です。

マウス モデルは、遺伝子欠陥を識別するために、retinopathies6の分子機構を解明するために使用されます。OPN は、約 120 万 RGC 軸索から成っている、(に)、視神経に重大な障害と網膜症のフォームです。OPN は ON に集中することができます。 または他の疾患、先天性またはない7、二次視野欠損しその後、失明をリードすることができます。OPN の特性 RGC 損失、被害、見られるよう人間 OCT で視神経と GCL2,3を薄くなります。一方、OPN の病態はまだよく理解されていない、それゆえマウス網膜をテストする必要性のまま。

本稿では、イメージングと定量 Opa1delTTAGマウス線89、支配的な視神経萎縮 (DOA)10のモデル例を用いた網膜層厚さをについて説明します。RGC の病態を評価するために、長方形、放射状、環状のスキャンは定量化されました。これは、10 月のソフトウェアによって提供される標準ノギスまたはオープン ソース画像処理プログラムの開発した自家製マクロで行われました。標準ノギスは、自家製キャリパーが使いやすい、再現、およびより正確なと操作が難しく、視神経/GCL より頻繁に厚い。マクロは、自動的に検出された層の 5 点と視神経乳頭地域の両側の固定位置の測定を実行します。提案するプロトコルの目的は、Rgc 焦点を網膜の位置を指定するのに OCT スキャン データ収集を記述するためです。

Protocol

実験的プロトコルは Institut 国民 de の la の健康によって承認された et de la recherche médicale (Inserm;モンペリエ、フランス)、欧州指令と一貫した眼科研究における動物の使用の ARVO ステートメントに準拠しています。それは (CEEALR; nuCEEA LR 12123) 動物実験における倫理のラングドック ・ ルシヨン礼譲の契約の下で行われました。 1。 機器の設定や事前イメージング準備 <p cl…

Representative Results

SD 10 月技術により網膜を想像し、組織に匹敵するが、高速厚解析、詳細 (図 3)。野生型 c57bl/6 マウスにもかかわらず SD OCT スキャンの品質が表示 (図 3 a右) は網膜断面 (図 3 a、左) のイメージのそれと同じくらい良いではない、それは複数の層 (例えばOLM) を可視化します。さらに、数日または数?…

Discussion

非侵襲的体内イメージング法、OCT システムは、高解像度の網膜クロス section のようなスキャンを提供します。したがって、その主な利点は、その潜在的な日常的にマウスのモデルに人間に適用されるプロトコルを転置する素晴らしい機会の詳細な分析です。

Opa1delTTAG変異マウスの例、SD 10 月結果 DOA 病態9のさらなる探鉱の視神経、…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この仕事に支えられた連合国デ Aveugles 網膜フランス、モンペリエ大学 Inserm et Déficients Visuels (UNADEV)、協会症候群・ デ ・ ウルフラム、財団を注ぐラ凝った Médicale 財団・ ド ・ フランスと卓越性の研究室EpiGenMed プログラム。

Materials

Mice
Opa1delTTAG mouse Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France Opa1 knock-in mice carrying  OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Bioptigen, Leica Microsystems, Germany Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software Bioptigen, Leica Microsystems, Germany Software for OCT acquisition and analysis
ImageJ 1.48v Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool
Self-regulating heating plate Bioseb, France BIO-062 Protection against hypothermia
Name Company Catalog Number Comments
Supplies
Nose Band Elastic band
Gauze pads 3"x3" Curad, USA CUR20434ERB Protection against hypothermia
Dual Ended Cotton tip applicator Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA Gel application
Cotton Twists CentraVet, France T.7979C.CS Mouse positioning
Name Company Catalog Number Comments
Reagents and Drugs
Néosynéphrine Faure 10% Laboratoires Europhtha, Monaco Eye dilatation
Mydriaticum 0.5% Laboratoires Théa, France 3397908 Eye dilatation
Cebesine 0.4% Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France 3192342 Local anesthesia
Imalgene 1000 Merial, France/CentraVet, France IMA004 General anesthesia
Rompun Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France ROM001 General anesthesia, analgesia, muscle relaxation
NaCl 0,9% Laboratoire Osalia, France  103697114 Physiological serum
Systene Ultra Alcon, Novartis, USA Hydration of eyes
GenTeal' Alcon, Novartis, USA Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities
Aniospray Surf 29 Laboratoires Anios, France 59844 Desinfectant

Referências

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Citar este artigo
Jagodzinska, J., Sarzi, E., Cavalier, M., Seveno, M., Baecker, V., Hamel, C., Péquignot, M., Delettre, C. Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo. J. Vis. Exp. (127), e55865, doi:10.3791/55865 (2017).

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