कल्चरल हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में Synaptic पुटिका Endocytosis को मापने
Summary
Synaptic पुटिका endocytosis pHluorin Synaptic पुटिका प्रोटीन और पुटिका के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ जुड़े के प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा पता चला है ।
Abstract
endocytosis के दौरान, जुड़े synaptic बुलबुले तंत्रिका टर्मिनलों पर प्राप्त कर रहे हैं, पुटिका रीसाइक्लिंग के लिए अनुमति देता है और इस प्रकार दोहराव तंत्रिका गोलीबारी के दौरान synaptic संचरण के रखरखाव । रोग की स्थिति में बिगड़ा endocytosis synaptic शक्ति और मस्तिष्क कार्यों में कमी आती है । यहां, हम ंयूरॉन संस्कृति में स्तनधारी हिप्पोकैम्पस synapse में synaptic पुटिका endocytosis उपाय करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों का वर्णन । हम एक synaptic vesicular झिल्ली प्रोटीन से इनकार करके synaptic पुटिका प्रोटीन endocytosis पर नजर रखी, synaptophysin और VAMP2/synaptobrevin, vesicular लुमेन के साथ, pHluorin के साथ, एक पीएच-संवेदी ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन है कि बढ़ जाती है अपने प्रतिदीप्ति तीव्रता के रूप में पीएच बढ़ जाती है । exocytosis के दौरान, vesicular लुमेन पीएच बढ़ जाती है, जबकि endocytosis vesicular लुमेन पीएच के दौरान पुन: acidified है. इस प्रकार, pHluorin प्रतिदीप्ति तीव्रता की वृद्धि फ्यूजन इंगित करता है, जबकि एक कमी बला synaptic पुटिका प्रोटीन की endocytosis इंगित करता है । endocytosis रिकॉर्ड करने के लिए pHluorin इमेजिंग विधि का उपयोग करने के अलावा, हम vesicular झिल्ली endocytosis से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) सहिजन peroxidase (एचआरपी) की माप बुलबुले द्वारा निगरानी । अंत में, हम उच्च पोटेशियम प्रेरित ध्रुवीकरण के बाद विभिन्न समय में तंत्रिका टर्मिनल झिल्ली गड्ढ़े के गठन पर नजर रखी । एचआरपी के समय पाठ्यक्रम और झिल्ली गड्ढे गठन endocytosis के समय पाठ्यक्रम को इंगित करता है ।
Introduction
न्यूरोट्रांसमीटर synaptic बुलबुले में संग्रहीत और exocytosis द्वारा जारी कर रहे हैं. synaptic पुटिका झिल्ली और प्रोटीन तो endocytosis द्वारा आंतरिक है, और exocytosis के अगले दौर में reused । synaptic बुलबुले के Endocytosis synaptic पुटिका पूल को बनाए रखने और प्लाज्मा झिल्ली से फैला हुआ बुलबुले को हटा के लिए महत्वपूर्ण है । पीएच के प्रति संवेदनशील ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन pHluorin, जो अंलीय परिस्थितियों में बुझती है और तटस्थ पीएच में बुझती है, को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है endocytosis समय पाठ्यक्रम में रहते है कोशिकाओं1,2,3। pHluorin प्रोटीन आमतौर पर synaptic पुटिका प्रोटीन के लुमेन पक्ष से जुड़ा हुआ है, जैसे synaptophysin या VAMP2/synaptobrevin । आराम में, pHluorin synaptic बुलबुले के ५.५ पीएच लुमेन में बुझती है । प्लाज्मा झिल्ली को पुटिका फ्यूजन extracellular समाधान के लिए vesicular लुमेन उजागर जहां पीएच ~ ७.३ है, pHluorin प्रतिदीप्ति में वृद्धि में जिसके परिणामस्वरूप । exocytosis के बाद, बढ़ी हुई प्रतिदीप्ति क्षय, synaptic पुटिका प्रोटीन के endocytosis के कारण पुटिका पुनः के बाद उन बरामद बुलबुले के भीतर अंलीकरण । हालांकि क्षय दोनों endocytosis और vesicular पुनः अंलीकरण को दर्शाता है, यह ज्यादातर endocytosis को दर्शाता है, क्योंकि पुनः अंलीकरण सबसे अधिक परिस्थितियों में endocytosis से तेज है1,4। पुनः अंलीकरण का समय लगातार 3-4 s या कम5,6है, जो आम तौर पर तेजी से 10 एस या अधिक पुटिका endocytosis4,5के लिए आवश्यक है । यदि प्रयोगों को पुनः अंलीकरण से endocytosis भेद करने की जरूरत है, एसिड शमन प्रयोग 4-Morpholineethanesulfonic एसिड (एमईएस) समाधान का उपयोग (25 मिमी) ५.५ के एक पीएच के साथ निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि क्या synaptic पुटिका प्रोटीन प्राप्त कर रहे हैं प्लाज्मा झिल्ली से endocytosis1,3,4के माध्यम से । इस प्रकार, pHluorin प्रतिदीप्ति तीव्रता वृद्धि exo के एक संतुलन को दर्शाता है-और endocytosis, और तंत्रिका उत्तेजना के बाद कमी विशेष रूप से endocytosis को दर्शाता है ।
pHluorin इमेजिंग न केवल endocytosis के समय पाठ्यक्रम को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह भी synaptic पुटिका पूल के आकार7,8, और पैदा की संभावना जारी और सहज रिलीज9। कई कारकों और प्रोटीन endocytosis को विनियमित करने में शामिल, जैसे कैल्शियम, घुलनशील NSF-अनुलग्नक प्रोटीन रिसेप्टर (जाल) प्रोटीन, मस्तिष्क व्युत्पंन neurotrophic फैक्टर (बीडीएनएफ), और calcineurin pHluorin इमेजिंग का उपयोग कर पहचान की गई है1 , 2 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16. इसके अलावा, न्यूरोट्रांसमीटर के रिलीज न केवल प्राथमिक ंयूरॉंस में पता लगाया जा सकता है लेकिन TIRFM17के साथ neuroblastoma कोशिकाओं में । हाल ही में, pHluorin वेरिएंट, dsRed, mOrange और pHTomato एक एकल synapse18,19में कई कारकों की एक साथ रिकॉर्डिंग की निगरानी के लिए विकसित किया गया । उदाहरण के लिए, pHTomato synaptophysin के साथ जुड़े हुए है और एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतक (GCaMP5K) के साथ प्रयोग किया जाता है presynaptic पुटिका संलयन और सीए2 + आमद postsynaptic डिब्बे में20पर नजर रखने के लिए । इसलिए, synaptic प्रोटीन से जुड़ी pHluorin endocytosis और exocytosis के बीच संबंधों का विश्लेषण करने के लिए एक उपयोगी तरीका प्रदान करता है ।
EM सामांय endocytosis अध्ययन, उच्च स्थानिक संकल्प है कि endocytosis के दौरान ultrastructural परिवर्तन से पता चलता है के कारण के लिए इस्तेमाल किया एक और तरीका है । दो सामान्य क्षेत्रों में21 न्यूरॉन कोशिकाओं और ट्रैक पुटिका प्रोटीन22के भीतर रोग परिवर्तन कल्पना करने की क्षमता है. विशेष रूप से, synaptic पुटिका के अवलोकन, झिल्ली वक्रता periactive क्षेत्र में clathrin द्वारा लेपित है, और endosomal संरचनाओं के साथ संभव है EM3,23,24,25 ,26,27,28. जबकि EM ऐसे निर्धारण प्रेरित विकृतियों के रूप में संभावित कलाकृतियों, शामिल है, कि endocytosis को प्रभावित कर सकते हैं, और डेटा विश्लेषण श्रम गहन है, संकल्प एक आकर्षक सेलुलर संरचना कल्पना अवसर प्रदान करता है । संभावित निर्धारण समस्याओं और उंहें लौकिक संकल्प में सीमा उच्च दबाव ठंड से दूर किया जा सकता है, endocytosis27के दौरान मौजूद नाजुक संरचनाओं को स्थिर करने के एक तेज और गैर रासायनिक विधि प्रदान करते हैं ।
Protocol
नोट: निम्न प्रोटोकॉल का वर्णन करता है pHluorin इमेजिंग विधियों और em विधियों में cultureed हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स का उपयोग किया जाता है । pHluorin पर नज़र रखता है synaptic पुटिका प्रोटीन जीवित कोशिकाओं में और em का पता लगाता …
Representative Results
Discussion
यहां हम synaptic पुटिका endocytosis की निगरानी के लिए दो तरीकों का प्रदर्शन । पहली विधि में, हम निगरानी pHluorin transfected ंयूरॉंस में एक synaptic पुटिका प्रोटीन के साथ जुड़े और बाद में विद्युत उत्तेजित । दूसरे, हम एचआरपी के रूप में K…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम synaptophysin-pHluorin2x निर्माण प्रदान करने के लिए डॉ योंग लिंग झू धंयवाद, और डॉ जेंस ई. रोथमान प्रदान करने के लिए VAMP2-phluorin । हम उनकी तकनीकी सहायता और मदद के लिए डॉ Susan चेंग और वर्जीनिया NINDS इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की सुविधा का धंयवाद । यह काम संयुक्त राज्य अमेरिका में मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक अंदर अनुसंधान कार्यक्रम के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था और KRIBB अनुसंधान पहल कार्यक्रम से अनुदान (कोरियाई जैव चिकित्सा वैज्ञानिक फैलोशिप कार्यक्रम), कोरिया के अनुसंधान संस्थान जैव विज्ञान और बायोटेक्नोलॉजी, रिपब्लिक ऑफ कोरिया.
Materials
| Lipofectamine LTX with Plus | Thermo Fisher | 15338-100 | Transfection of plasmid DNA including synaptophysin or VAMP2-pHluorin |
| neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | Growth medium for neuron, Warm up to 37°C before use |
| B27 | Thermo Fisher | 17504-044 | Gradient for neuronal differentiation |
| Glutamax | Thermo Fisher | 35050-061 | Gradient for neuronal culture |
| Poly-D-Lysine coated coverslip | Neuvitro | GG-25-pdl | Substrate for neuronal growth and imaging of pHluorin |
| Trypsin XI from bovine pancrease | Sigma | T1005 | Neuronal culture-digest hippocampal tissues |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 | Neuronal culture-inhibits viscous cell suspension |
| pulse stimulator | A-M systems | model 2100 | Apply electrical stimulation |
| Slotted bath with field stimulation | Warner Instruments | RC-21BRFS | Apply electrical stimulation |
| stimulus isolation unit | Warner Instruments | SIU102 | Apply electrical stimulation |
| lubricant | Dow corning | 111 | pHluorin imaging-seal with coverslip and imaging chamber, avoid leak from chamber |
| AP5 | Tocris | 3693 | Gradient for normal saline, selective NMDA receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity |
| CNQX | Tocris | 190 | Gradient for normal saline, competitive AMPA/kainate receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity |
| Illuminator | Nikon | C-HGFI | Metal halide light source for pHluorin |
| EMCCD camera | Andor | iXon3 | pHluorin imaging, detect pHluorin fluorescence intensity |
| Inverted microscopy | Nikon | Ti-E | Imaging for synaptophysin or VAMP2 pHluorin transfected cells |
| NIS-Elements AR | Nikon | NIS-Elements Advanced Research | Software for imaging acquisition and analysis |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for imaging analysis and data presentation |
| imaging chamber | Warner Instruments | RC21B | pHluorin imaging, apply field stimulation on living cells |
| poly-l-lysine | Sigma | P4832 | Electron microscopy, substrate for neuronal growth, apply on multiwell plate for 1 h at room temperature then wash with sterilized water 3 times |
| Horseradish peroxidase(HRP) | Sigma | P6782 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by catalyzing DAB in presence hydrogen peroxide, final concentration is 5 mg/mL in normal saline, make fresh before use |
| Na cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Electron microscopy, buffer for fixatives and washing, final concentration is 0.1 N |
| 3,3′-Diaminobenzidine(DAB) | Sigma | D8001 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles, substrate for HRP, final concentration is 0.5 mg/mL in DDW and filtered, make fresh before use |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by inducing HRP-DAB reaction, final concentration is 0.3% in DDW, make fresh before use |
| glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16365 | Electron microscopy, fixatives, final concentration is 4% in Na-cacodylate buffer, make fresh before use, shake well before to use |
| TEM | JEOL | 200CX | Electron microscopy, imaging of endocytosed vesicles and ultrastructural changes |
| CCD digital camera | AMT | XR-100 | Electron microscopy, capturing images |
| Lead citrate | Leica microsystems | 16707235 | Electron microscopy, grid staining |
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