מדידת אנדוציטוזה שלפוחית סינפטית של נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית
Summary
שלפוחית סינפטית אנדוציטוזה מזוהה על ידי מיקרוסקופ אור של pHluorin התמזגו עם שלפוחית סינפטית חלבונים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים של ספיגת שלפוחית.
Abstract
במהלך אנדוציטוזה, מאוחה הסינפטיות מאוחזרות על קצות עצבים היקפיים, המאפשרות שלפוחית מיחזור, ובכך את התחזוקה של ההעברה הסינאפסית במהלך ירי עצב חוזרות. אנדוציטוזה לקוי בתנאים פתולוגיים מוביל ירידות סינפטית כוח, המוח מתפקד. כאן, אנו מתארים שיטות למדידת אנדוציטוזה שלפוחית סינפטית על הסינפסה בהיפוקמפוס יונקים בתרבות עצביים. אנחנו בפיקוח שלפוחית סינפטית חלבון אנדוציטוזה פיוזינג חלבון ממברנה vesicular סינפטית, כולל synaptophysin ו VAMP2/synaptobrevin, בצד lumenal vesicular, עם pHluorin, רגיש pH חלבון פלואורסצנטי ירוק זה מגביר שלה עוצמת קרינה פלואורסצנטית כמו ה-pH מעלה. במהלך אקסוציטוזה, מגביר לומן vesicular pH, ואילו במהלך אנדוציטוזה vesicular לומן pH הוא acidified מחדש. לפיכך, גידול של עוצמת קרינה פלואורסצנטית pHluorin מציין היתוך, ואילו ירידה מציין אנדוציטוזה של החלבון שלפוחית סינפטית עם תוויות ברורות. בנוסף לשימוש בשיטת הדמיה pHluorin להקליט אנדוציטוזה, אנחנו בפיקוח אנדוציטוזה ממברנה vesicular על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) מדידות של ספיגת peroxidase (HRP) חזרת שלפוחית. בסופו של דבר, אנחנו פיקוח היווצרות של חוצפה רפידה מסוף בורות בזמנים שונים לאחר דפולריזציה הנוצרות על-ידי אשלגן גבוה. מסלול הזמן של ספיגת HRP בור היווצרות קרום מציין את מהלך הזמן של אנדוציטוזה.
Introduction
נוירוטרנסמיטרים מאוחסנים הסינפטיות, שפורסמו על ידי אקסוציטוזה. קרום שלפוחית סינפטית של חלבון לאחר מכן על ידי אנדוציטוזה הינם בשימוש חוזר לסיבוב הבא של אקסוציטוזה. אנדוציטוזה של הסינפטיות חשוב לשמירה על שלפוחית סינפטית בריכות ומסירה שלפוחית הבולטות של קרום פלזמה. PHluorin רגיש pH חלבון פלואורסצנטי ירוק, אשר הוא מתרצה בנסיבות חומצי, dequenched ב pH ניטראלי, שימש כדי למדוד זמן אנדוציטוזה קורסים לחיות תאים1,2,3. החלבון pHluorin מחובר בדרך כלל לצד lumenal של חלבונים שלפוחית סינפטית, כגון synaptophysin או VAMP2/synaptobrevin. במצב מנוחה, pHluorin הוא מתרצה ב- 5.5 pH לומן של הסינפטיות. פיוז’ן שלפוחית על קרום פלזמה חושף לומן vesicular לתמיסה חוץ-תאית איפה ה-pH ~ 7.3, וכתוצאה מכך עלייה בזריחה pHluorin. לאחר אקסוציטוזה, נרקב זריחה מוגברת, עקב אנדוציטוזה של חלבונים שלפוחית סינפטית ואחריו שלפוחית acidification מחדש בתוך שלפוחית התאושש האלה. למרות הריקבון משקף אנדוציטוזה והן vesicular acidification מחדש, הוא משקף בעיקר אנדוציטוזה, כי acidification מחדש הוא מהיר יותר מאשר אנדוציטוזה רוב התנאים1,4. קבוע הזמן של acidification מחדש הוא 3-4 s או פחות5,6, שהוא בדרך כלל מהיר יותר 10 s או יותר הדרושים עבור שלפוחית אנדוציטוזה4,5. אם הניסויים נדרשים לבידול אנדוציטוזה acidification מחדש, חומצה שכבתה ניסויים באמצעות 4-Morpholineethanesulfonic חומצה (MES) הפתרון (25 מ מ) עם pH של 5.5 יכול לשמש כדי לקבוע אם חלבונים שלפוחית סינפטית מאוחזרות של קרום פלזמה ויה אנדוציטוזה-1,–3,–4. לפיכך, העלייה עוצמת קרינה פלואורסצנטית pHluorin משקפת איזון של מסכות, אנדוציטוזה ולאחר הירידה לאחר גירוי עצבי משקף באופן ספציפי אנדוציטוזה.
הדמיה pHluorin עשוי לשמש לא רק כדי למדוד את מהלך הזמן של אנדוציטוזה, אלא גם את הגודל של שלפוחית סינפטית בריכות7,8, ולשחרר ההסתברות של שחרור עורר וספונטני9. גורמים רבים, חלבונים מעורב בוויסות אנדוציטוזה, כגון סידן, מסיסים NSF-מצורף חלבון קולטן (מוקש) חלבונים, המוח, נגזר neurotrophic factor(BDNF) calcineurin זוהו באמצעות הדמיה pHluorin1 , 2 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16. יתר על כן, שחרור נוירוטרנסמיטר יכול להתגלות נוירונים לא רק העיקרי אלא נוירובלסטומה תאים עם TIRFM17. לאחרונה, גרסאות pHluorin, dsRed, מורנג ו pHTomato פותחו לפיקוח הסימולטניות הקלטות של גורמים רבים ב18,סינפסה בודדת19. לדוגמה, pHTomato יש כבר התמזגו עם synaptophysin, נהגה עם מחוון סידן מקודדים גנטית (GCaMP5K) לפקח על שלפוחית presynaptic fusion ו Ca2 + זרם ב ה תא postsynaptic20. לכן, pHluorin מחוברים חלבונים סינפטיים מספק שיטה שימושית כדי לנתח את הקשר בין אקסוציטוזה אנדוציטוזה.
EM הוא שיטה נוספת בשימוש נפוץ ללמוד אנדוציטוזה, בשל הרזולוציה המרחבית הגבוהה זה מציגה את השינויים ultrastructural במהלך אנדוציטוזה. בשני תחומים כלליים הן את היכולת להמחיש שינויים פתולוגיים בתוך תאים עצביים21 ולעקוב אחר שלפוחית חלבונים22. בפרט, ההתבוננות שלפוחית סינפטית תפיסה, ממברנה עקמומיות מצופה מאת clathrin באיזור periactive, endosomal מבנים אפשריים עם EM3,23,24,25 ,26,27,28. בעוד EM כרוך לכלוכים פוטנציאליים, כגון מקבע-induced מומים, זה עלול להשפיע על אנדוציטוזה ולאחר ניתוח נתונים הוא עמל רב, שהפתרון מספק הזדמנות אטרקטיבית להמחיש המבנה התאי. בעיות פוטנציאליות מקבע והגבלת ברזולוציה הטמפורלית EM ניתן להתגבר על ידי לחץ גבוה קפוא, מתן שיטה מהירה ללא כימיקלים לייצב את המבנים עדין נוכח בזמן אנדוציטוזה27.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן נדגים שתי שיטות לניטור אנדוציטוזה שלפוחית סינפטית. בשיטה הראשונה, אנחנו במעקב pHluorin התמזגו עם חלבון שלפוחית סינפטית בנוירונים transfected, לאחר מכן חשמלית מגורה. שנית, השתמשנו EM הדמיה של ספיגת HRP כפי שנגזרות אשלגן כלורי. השתמשנו גירויים שונים משתי סיבות. ראשית, יישום אשלגן גבוה גורם דפולריזצ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ד ר יונג-לינג ז’ו על מתן לבנות synaptophysin-pHluorin2x, ד ר ג’יימס דגלס רוטמן על מתן VAMP2-phluorin. אנו מודים ד ר סוזן נג ו וירג’יניה קרוקר NINDS מיקרוסקופ אלקטרונים מתקן על תמיכה טכנית ועזרה שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ תוכנית מחקר מגזר בארה ב, מענק של KRIBB המחקר יוזמת התוכנית (קוריאנית ביו מדען תכנית העמיתים), המכון הקוריאני לחקר של Bioscience, ביוטכנולוגיה/ביולוגיה, הרפובליקה של קוריאה.
Materials
| Lipofectamine LTX with Plus | Thermo Fisher | 15338-100 | Transfection of plasmid DNA including synaptophysin or VAMP2-pHluorin |
| neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | Growth medium for neuron, Warm up to 37°C before use |
| B27 | Thermo Fisher | 17504-044 | Gradient for neuronal differentiation |
| Glutamax | Thermo Fisher | 35050-061 | Gradient for neuronal culture |
| Poly-D-Lysine coated coverslip | Neuvitro | GG-25-pdl | Substrate for neuronal growth and imaging of pHluorin |
| Trypsin XI from bovine pancrease | Sigma | T1005 | Neuronal culture-digest hippocampal tissues |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 | Neuronal culture-inhibits viscous cell suspension |
| pulse stimulator | A-M systems | model 2100 | Apply electrical stimulation |
| Slotted bath with field stimulation | Warner Instruments | RC-21BRFS | Apply electrical stimulation |
| stimulus isolation unit | Warner Instruments | SIU102 | Apply electrical stimulation |
| lubricant | Dow corning | 111 | pHluorin imaging-seal with coverslip and imaging chamber, avoid leak from chamber |
| AP5 | Tocris | 3693 | Gradient for normal saline, selective NMDA receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity |
| CNQX | Tocris | 190 | Gradient for normal saline, competitive AMPA/kainate receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity |
| Illuminator | Nikon | C-HGFI | Metal halide light source for pHluorin |
| EMCCD camera | Andor | iXon3 | pHluorin imaging, detect pHluorin fluorescence intensity |
| Inverted microscopy | Nikon | Ti-E | Imaging for synaptophysin or VAMP2 pHluorin transfected cells |
| NIS-Elements AR | Nikon | NIS-Elements Advanced Research | Software for imaging acquisition and analysis |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for imaging analysis and data presentation |
| imaging chamber | Warner Instruments | RC21B | pHluorin imaging, apply field stimulation on living cells |
| poly-l-lysine | Sigma | P4832 | Electron microscopy, substrate for neuronal growth, apply on multiwell plate for 1 h at room temperature then wash with sterilized water 3 times |
| Horseradish peroxidase(HRP) | Sigma | P6782 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by catalyzing DAB in presence hydrogen peroxide, final concentration is 5 mg/mL in normal saline, make fresh before use |
| Na cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Electron microscopy, buffer for fixatives and washing, final concentration is 0.1 N |
| 3,3′-Diaminobenzidine(DAB) | Sigma | D8001 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles, substrate for HRP, final concentration is 0.5 mg/mL in DDW and filtered, make fresh before use |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by inducing HRP-DAB reaction, final concentration is 0.3% in DDW, make fresh before use |
| glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16365 | Electron microscopy, fixatives, final concentration is 4% in Na-cacodylate buffer, make fresh before use, shake well before to use |
| TEM | JEOL | 200CX | Electron microscopy, imaging of endocytosed vesicles and ultrastructural changes |
| CCD digital camera | AMT | XR-100 | Electron microscopy, capturing images |
| Lead citrate | Leica microsystems | 16707235 | Electron microscopy, grid staining |
Referências
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nature cell biol. 2 (4), 197-204 (2000).
- Sun, T., Wu, X. S., et al. The role of calcium/calmodulin-activated calcineurin in rapid and slow endocytosis at central synapses. J Neurosci. 30 (35), 11838-11847 (2010).
- Wu, X. -. S. S., Lee, S. H., et al. Actin Is Crucial for All Kinetically Distinguishable Forms of Endocytosis at Synapses. Neuron. 92 (5), 1020-1035 (2016).
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51 (6), 773-786 (2006).
- Atluri, P. P., Ryan, T. A. The kinetics of synaptic vesicle reacidification at hippocampal nerve terminals. J Neurosci. 26 (8), 2313-2320 (2006).
- Royle, S. J., Granseth, B., Odermatt, B., Derevier, A., Lagnado, L. Imaging phluorin-based probes at hippocampal synapses. Methods Mol Biol. 457, 293-303 (2008).
- Moulder, K. L., Mennerick, S. Reluctant vesicles contribute to the total readily releasable pool in glutamatergic hippocampal neurons. J Neurosci. 25 (15), 3842-3850 (2005).
- Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptopHluorin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (17), 6131-6136 (2005).
- Morris, R. G. Elements of a neurobiological theory of hippocampal function: the role of synaptic plasticity, synaptic tagging and schemas. Eur J Neurosci. 23 (11), 2829-2846 (2006).
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Calcium accelerates endocytosis of vSNAREs at hippocampal synapses. Nat Neurosci. 4 (2), 129-136 (2001).
- Balaji, J., Armbruster, M., Ryan, T. A. Calcium control of endocytic capacity at a CNS synapse. J Neurosci. 28 (26), 6742-6749 (2008).
- Ferguson, S. M., Brasnjo, G., et al. A selective activity-dependent requirement for dynamin 1 in synaptic vesicle endocytosis. Science. 316 (5824), 570-574 (2007).
- Baydyuk, M., Wu, X. S., He, L., Wu, L. G. Brain-derived neurotrophic factor inhibits calcium channel activation, exocytosis, and endocytosis at a central nerve terminal. J Neurosci. 35 (11), 4676-4682 (2015).
- Wu, X. S., Zhang, Z., Zhao, W. D., Wang, D., Luo, F., Wu, L. G. Calcineurin is universally involved in vesicle endocytosis at neuronal and nonneuronal secretory cells. Cell Rep. 7 (4), 982-988 (2014).
- Zhang, Z., Wang, D., et al. The SNARE proteins SNAP25 and synaptobrevin are involved in endocytosis at hippocampal synapses. J Neurosci. 33 (21), 9169-9175 (2013).
- Wu, L. -. G. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annu Rev Physiol. 76 (1), 301-331 (2014).
- Daniele, F., Di Cairano, E. S., Moretti, S., Piccoli, G., Perego, C. TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in SH-SY5Y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis. J Vis Exp. (95), e52267 (2015).
- Shaner, N. C., Lin, M. Z., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (6), 545-551 (2008).
- Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).
- Leitz, J., Kavalali, E. T. Fast retrieval and autonomous regulation of single spontaneously recycling synaptic vesicles. Elife. 3, e03658 (2014).
- Bisht, K., El Hajj, H., Savage, J. C., Sánchez, M. G., Tremblay, M. -. &. #. 2. 0. 0. ;. Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with β-Amyloid Plaques. J Vis Exp. (112), e54060 (2016).
- Schikorski, T. Monitoring Synaptic Vesicle Protein Sorting with Enhanced Horseradish Peroxidase in the Electron Microscope. High-Resolution Imaging of Cellular Proteins: Methods and Protocols. , 327-341 (2016).
- Kononenko, N. L., Puchkov, D., et al. Clathrin/AP-2 mediate synaptic vesicle reformation from endosome-like vacuoles but are not essential for membrane retrieval at central synapses. Neuron. 82 (5), 981-988 (2014).
- Wu, Y., O’Toole, E. T., et al. A dynamin 1-, dynamin 3- and clathrin-independent pathway of synaptic vesicle recycling mediated by bulk endocytosis. eLife. 2014 (3), e01621 (2014).
- Heuser, J. E., Reese, T. S. Evidence for recycling of synaptic vesicle membrane during transmitter release at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 57 (2), 315-344 (1973).
- Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Turnover of transmitter and synaptic vesicles at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 57 (2), 499-524 (1973).
- Watanabe, S., Rost, B. R., et al. Ultrafast endocytosis at mouse hippocampal synapses. Nature. 504 (7479), 242-247 (2013).
- Watanabe, S., Trimbuch, T., et al. Clathrin regenerates synaptic vesicles from endosomes. Nature. 515 (7526), 228-233 (2014).
- Sankaranarayanan, S., Atluri, P. P., Ryan, T. A. Actin has a molecular scaffolding, not propulsive, role in presynaptic function. Nat Neurosci. 6 (2), 127-135 (2003).
- Zhu, Y., Xu, J., Heinemann, S. F. Two pathways of synaptic vesicle retrieval revealed by single-vesicle imaging. Neuron. 61 (3), 397-411 (2009).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Arnao, M. B. B., Acosta, M., del Rio, J. A. A., García-Cánovas, F. Inactivation of peroxidase by hydrogen peroxide and its protection by a reductant agent. Biochim Biophys Acta. 1038 (1), 85-89 (1990).
- Deák, F., Schoch, S., et al. Synaptobrevin is essential for fast synaptic-vesicle endocytosis. Nat Cell Biol. 6 (11), 1102-1108 (2004).
- Clayton, E. L., Evans, G. J. O., Cousin, M. A. Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation. J Neurosci. 28 (26), 6627-6632 (2008).
- Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nat Neurosci. 17 (1), 10-16 (2014).
- Wienisch, M., Klingauf, J. Vesicular proteins exocytosed and subsequently retrieved by compensatory endocytosis are nonidentical. Nat Neurosci. 9 (8), 1019-1027 (2006).
- Fernández-Alfonso, T., Kwan, R., Ryan, T. A. Synaptic vesicles interchange their membrane proteins with a large surface reservoir during recycling. Neuron. 51 (2), 179-186 (2006).
- Gimber, N., Tadeus, G., Maritzen, T., Schmoranzer, J., Haucke, V. Diffusional spread and confinement of newly exocytosed synaptic vesicle proteins. Nat Commun. 6, 8392 (2015).
- Nicholson-Fish, J. C., Smillie, K. J., Cousin, M. A. Monitoring activity-dependent bulk endocytosis with the genetically-encoded reporter VAMP4-pHluorin. J Neurosci Methods. 266, 1-10 (2016).
- Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2006).
- Wisse, E., Braet, F., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World journal of gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing Photodamage in Live-Cell Microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
- Søndergaard, C. R., Garrett, A. E., et al. Structural artifacts in protein-ligand X-ray structures: implications for the development of docking scoring functions. J Med Chem. 52 (18), 5673-5684 (2009).
