새로운 세계 Zika 바이러스 전염성 클론으로부터 재조합 바이러스의 구조 및 특성 규명

Zika 바이러스 (ZIKV, Family Flaviviridae : Flavivirus 속)는 2013-14 년 브라질에 도착한 모기에 의한 플라 비 바이러스로 이후 미주 전역에 퍼져 있던 열병의 대규모 발생과 관련이 있습니다 ¹ . 또한, ZIKV는 성인의 길랑 발레 증후군 및 태아 및 신생아의 소두증과 같은 심각한 질병 결과와 관련되어 있습니다 ² . 서반구에서 급속하게 확산되기 전에 ZIKV에 대해 알려진 것이 거의 없다. 여기에는 분자 도구가 없어 기계 론적 연구가 어려웠습니다. 감염성 cDNA 클론과 같은 바이러스의 분자 도구는 백신 및 항 바이러스 치료 개발을 촉진하고 차별적 인 바이러스 병인, 면역 반응 및 바이러스 성 진화와 관련된 바이러스 유전 인자의 평가를 허용합니다.

플라 비 바이러스 전염성 클론은 cr 때문에 박테리아에서 매우 불안정한 것으로 알려져있다그들의 게놈에 존재하는 유익한 원핵 생물 프로모터 ³ . 이 문제를 개선하기 위해 몇 가지 접근법이 사용되었습니다. 바이러스 서열 ^4의 상류 중계 반복의 삽입, 추정 원핵 생물 프로모터 서열 ^5의 돌연변이, 게놈을 다중 플라스미드 ⁶ 으로 분할, 저 복사 수 벡터 (박테리아 인공 염색체 포함) ⁷ 및 바이러스 게놈에서의 인트론 삽입 ⁹ . 수정하지 않은 하나의 전장 시스템이 ZIKV에 대해 설명되었습니다. 그러나,이 클론은 세포 배양 및 마우스에서 약화 된 것으로 보였다. 다른 그룹은 인트론을 ZIKV 게놈으로 조작하여 감염성 바이러스 ¹¹ 의 생산을 위해 포유류 세포 에서 시험관 내 에서 접합 될 수있는 박테리아의 불안정한 서열을 파괴 할 수 있도록했습니다^{, 12} . 또한, 전염성 – 서브 게놈 – 앰플리 콘이라는 제목의 PCR 기반 시스템이 ZIKV ¹³ 의 원형 MR766을 구제하는데 성공적으로 사용되었습니다. 여기에 설명 된 접근 방식은 외래 서열을 필요로하지 않고 황열병 ⁶ , 뎅기열 ^{14 , 15} 및 웨스트 나일 바이러스 ^16에서 성공적으로 사용 된 여러 플라스미드를 사용하여 불안정성이 높은 지역의 게놈을 파괴합니다. 또한 바이러스 게놈 말단에 D 형 간염 리보 자임 서열을 추가하면 선형화 부위를 추가 할 필요없이 진정한 3 '말단을 만들 수 있습니다. 또한 두 플라스미드는 잔류 독성을 완화하기 위해 낮은 카피 수 벡터 (pACYC177, 세포 당 ~ 15 카피)로 구성된다. 복구 된 바이러스는포유류와 곤충 둘 다에서 파생 된 다양한 세포 유형을 포함하는 8 개의 세포주 에서 체외 성장 곡선에서 부모 바이러스. 모기에서 마우스와 감염, 보급 및 전염 속도에서 동일한 병원성 프로파일을 나타냈다.

여기서, 우리는 감염성 클론 플라스미드를 성장시키고, 체외에서 전장 바이러스 성 RNA (바이러스 성 게놈) 를 생성하고 , 세포 배양에서 감염성 바이러스를 회수하는 방법을 기술 한 프로토콜을 상세히 설명한다. 첫째, 우리는 박테리아에서 플라스미드의 번식 또는 롤링 서클 증폭 (RCA)을 이용한 박테리아없는 증폭을 기술한다. 다음으로, 우리는 두 플라스미드가 어떻게 소화되는지를 보여 주며,이어서 전체 길이의 바이러스를 생성하기 위해 함께 연결됩니다. 마지막으로, 우리는 전사 RNA의 생산과 Vero 세포로의 전기 천공을 기술하고, 회수 된 바이러스의 적정을 기술한다 ( 그림 1 ). 설명 된 접근법은 빠르며, fo1 ~ 2 주 안에 전염성 바이러스 주식을 회수.