Células vivas medición de olor del Receptor activación utilizando un ensayo de campo en tiempo real

El sentido del olfato desempeña un papel importante en la supervivencia de animales como ellos confían en sus capacidades olfativas para obtener comida, evitar depredadores y peligros, especies y seleccionar mate^1,2. La realización de estas funciones depende de los receptores de olor (RUP), que se expresan individualmente en la superficie ciliar de las neuronas sensoriales olfativas (OSNs) localizada en el epitelio olfatorio (OE). ORs constituyen la mayor familia de la superfamilia de receptores (GPCR) de la proteína G acoplada con aproximadamente 400 y 1200 diversos OR genes en humanos y ratón, respectivamente^3,4,5. ORs activados por olores conducen al aumento de los niveles intracelular de cAMP a través de la activación secuencial de proteína olfatoria de G (G_olf) y tipo cyclase del adenylyl III (ACIII). El mayor nivel de cAMP intracelular resultante podría funcionar como un segundo mensajero, que se abre el canal nucleotide-bloqueado en la superficie de la célula, provocando afluencia de cationes como Ca^{2 +} y los potenciales de acción y en última instancia iniciando potencial de neuro transmisión y percepción olfativa. El proceso de detectar y discriminar una gran cantidad de olores por ORs es considerado como el primer paso de percepción olfativa^6,7.

Puesto que Buck y Axel⁸ primero con éxito había reproducido receptores odorantes y dilucidado el mecanismo de la percepción olfativa iniciada por ORs, deorphanization de la familia de OR se convirtió en uno de los hotspots en este campo. Varios métodos in vivo, ex vivo y en vitro para medir la activación OR han sido reportados^9,10,11,12. Un método tradicional que utiliza Ca^{2 +} proyección de imagen de seguido por RT-PCR unicelular en OSNs permitió la identificación de diferentes SRO a aceites alifáticos^13,14,15. Más recientemente, el advenimiento de los análisis del transcriptoma a gran escala promueve el desarrollo de métodos de alto rendimiento en vivo más. El ensayo de Kentucky había identificado ORs de eugenol y muscone-sensible al ratón con el uso de la S100a5-tauGFP reportero ratón cepa y microarrays análisis⁹. Basado en la disminución de los niveles de mRNA de OR después de la exposición de olor, la tecnología de sueño emplea un enfoque transcriptómicos para determinar perfiles de activación OR en ambas especies de vertebrados y no vertebrados¹⁶. Asimismo, habida cuenta de la fosforilación de S6 en activaciones neuronales, la señorita grupo secuenciado mRNAs de immunoprecipitations ribosoma fosforilada para identificar capacidad de respuesta de ORs¹². Por último, el grupo de Feinstein informó ratones estupendo sniffer que podrían servir como una plataforma para estudiar olor codificación en vivo, conocido como la tecnología de MouSensor¹⁷.

En el Reino de vitro , el reto de cultivo OSNs hace un sistema de expresión heteróloga que imita OR expresión funcional en vivo una solución ideal para la investigación a gran escala de los productos químicos para ORs. Sin embargo, puesto que las líneas de cultivo de células de origen no olfativa difieren OSNs nativos, o proteínas son retenidas en el retículo endoplasmático e incapaz de tráfico a la membrana plasmática, dando por resultado OR degradación y pérdida de función del receptor^{18 , 19}. para resolver este problema, se han realizado trabajos extensos para replicar expresión funcional OR sobre la membrana celular en células heterólogas. Krautwurst et al. primero atribuye los 20 primeros aminoácidos de la rodopsina (Rho-etiqueta) a la N-terminal de la proteína de OR y esto promovió la expresión de superficie de la célula de algunos ORs en células de riñón embrionario humano (HEK)²⁰. Mediante la realización de un análisis de serie de análisis del gene expresión (SAGE) Biblioteca de solo OSNs, Saito et al. clonó por primera vez el transporte del receptor proteína (RTP) miembros de la familia, RTP1 y RTP2 y la proteína del receptor de expresión potenciador 1 (REEP1) que facilitó el tráfico de OR a la membrana celular y mejorada respuestas mediadas por el olor de las RUP en las células HEK293T ²¹. basándose en estos hallazgos, el grupo de la señorita establecido con éxito la línea celular de Hana3A estable transfected con RTP1, RTP2, REEP1 y Gα_olf en HEK293T y transitorio transfected con ORs tagged Rho, eficiente o funcional expresión. Posteriores estudios revelaron 1) una forma más corta de RTP1, RTP1S, que podrían promover más robusta o función de la proteína original de RTP1 y 2) el receptor muscarínico de tipo 3 (M3R) que podría mejorar la actividad OR vía inhibición de la β-arrestin-2 contratación, los cuales fueron introducidos en el sistema de expresión heteróloga para optimizar experimental salida^22,23.

Varios métodos de detección se han utilizado para cuantificar la activación del receptor en sistemas heterólogos. El ensayo de la fosfatasa alcalina placentaria secretada (SEAP) trabaja con una enzima reporter reglamentada transcripcionalmente por elementos de la respuesta de campo (CREs), convirtiéndolo en una opción atractiva para evaluar la activación de la OR. La fluorescencia se detecta fácilmente en una muestra de medio de cultivo después de la incubación con SEAP detección reactivo²⁴. Usando este método, las funciones de RUP como una clase secundaria de receptores chemosensory en el OE-el rastro receptores asociados a aminas (Edmonton) han sido caracterizan^25,26,27. Otro método común, el ensayo de luciferasa, utiliza un gen de reportero de luciferasa de luciérnaga bajo el control del elemento de respuesta cAMP (CRE). Luminiscencia generada por la producción de luciferase de medición proporciona un medio eficiente y robusto de cuantificación OR activación^10,11,28.

Ensayos de campo en tiempo real también han sido ampliamente utilizados en el seguimiento dinámicamente la función de los GPCRs heterólogas o endógenas. Un ejemplo de tales ensayos avanzados aprovecha una variante genéticamente codificados biosensor, que posee un dominio de unión a campo fusionado a la forma mutante de la luciferasa. Cuando el campo se une, el cambio conformacional conduce a la activación de la luciferasa, luminiscencia que puede medirse entonces con un lector de la quimioluminescencia^29,30. La tecnología de campo en tiempo real ha informado conveniente para la orfandad de los receptores de olor humano en las células HEK293 y NxG de 108CC15culo = “xref” > 31^,32,33, como así como en la Hana3A HEK293T derivado células^34,35. El grupo Krautwurst también describe en detalle la tecnología de campo en tiempo real para ser conveniente para enfoques a gran escala o detección bidireccional^32,33.

Aquí se describe un protocolo para medir la activación OR usando un análisis de campo en tiempo real en células Hana3A. En el presente Protocolo, la luminiscencia de células vivas previamente equilibradas se mide cinéticamente por 30 min después del tratamiento con compuestos volátiles específicos, que representan un análisis más eficiente y preciso de la activación de OR que son menos susceptibles a artefactos que se producen en el entorno celular con tiempo prolongado y toxicidad celular inducida por el olor. Esta medida en tiempo real permite una proyección a gran escala de SRO y ligandos, así como caracterización de pares OR-ligando específicos de interés. Usando este método, con éxito identificamos OR5AN1 como receptor para el muscone compuesto de almizcle realizando una proyección contra 379 ORs humanas y posteriormente confirmar el resultado de la investigación positiva.