Lichtvermittelte reversible Modulation des mitogenaktivierten Proteinkinase-Pathways während der Zelldifferenzierung und<em> Xenopus</em> Embryonale Entwicklung

Wachstumsfaktoren sind an einem breiten Spektrum von Zellfunktionen beteiligt, darunter Proliferation, Differenzierung, Migration und Apoptose und spielen in vielen biologischen Ereignissen, einschließlich embryonaler Entwicklung, Alterung und Regulierung des mentalen Status ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} Viele Wachstumsfaktoren signalisieren durch komplexe intrazelluläre Signalkaskaden. Diese Signalisierungsereignisse werden oft durch reversible Proteinphosphorylierung präzise geregelt ^{6 , 7} betrieben. So ist ein Verständnis der Signalisierungsergebnisse von Proteinkinasen, die für die Proteinphosphorylierung verantwortlich sind, von grundlegender Bedeutung.

Unterschiedliche Wachstumsfaktoren wirken durch ein relativ häufiges intrazelluläres Signalisierungsnetzwerk, obwohl sie dist anregenInct zelluläre Reaktionen ^{8 , 9} . Häufige intrazelluläre Mediatoren von Rezeptortyrosinkinasen umfassen Ras, Raf, extrazelluläre signalregulierte Kinase (ERK), mitogenaktivierte Proteinkinase (MAPK) / ERK-Kinase (MEK), Phosphoinositid-3-kinase (PI3K), Akt und Phospholipase C gamma (PLC & gamma;) ^{10 , 11} . Die akkumulierende Evidenz deutet darauf hin, dass die Signalisierungsvielfalt und die Spezifität von der räumlichen und zeitlichen Regulierung der Signalisierungsaktivität abhängen. Zum Beispiel aktiviert bei Ratten-Pheochromozytomzellen (PC12) die epidermale Wachstumsfaktor (EGF) -Stimulation, die zu einer Zellproliferation führt, den ERK-Weg ⁹ vorübergehend. Auf der anderen Seite aktiviert die Stimulation mit dem Nervenwachstumsfaktor (NGF), die zur Zelldifferenzierung führt, den ERK-Weg nachhaltig ^{9 , 13} . In kultivierten rBei hippocampalen Neuronen fördert die transiente Signalisierung durch den vom Gehirn abgeleiteten neurotrophischen Faktor (BDNF) das primäre Neuritenwachstum, während die anhaltende Signalisierung zu einer erhöhten Neuritenverzweigung führt. Während der frühen embryonalen Entwicklung ist die phosphorylierte ERK-Aktivität zeitlich dynamisch und weit verbreitet im Embryo ⁶ . Ein aktueller genetischer Screen während der frühen Xenopus- Embryogenese zeigte, dass ERK- und Akt-Signalkaskaden, zwei nachgeschaltete primäre Wachstumsfaktorwege, bühnenspezifische Aktivierungsprofile zeigen ⁷ . So verlangt ein Verständnis der Kinase-Signalisierungsergebnisse Werkzeuge, die die räumlichen und zeitlichen Merkmale der Kinaseaktivität mit ausreichender Auflösung untersuchen können.

Konventionelle experimentelle Ansätze, die dynamische Natur der Signaltransduktion während der Entwicklung zu untersuchen, fehlt der wünschenswerten räumlichen und zeitlichen Auflösung. Zum Beispiel verwenden pharmakologische Ansätze kleine chemIcal oder biologischen Molekülen zur Stimulierung oder Unterdrückung der Signaltransduktion in Zellen und Geweben. Die diffuse Natur dieser kleinen Moleküle macht es schwierig, ihre Handlung auf eine bestimmte Region von Interesse zu beschränken ¹⁵ . Genetische Ansätze ( zB Transgenese, Cre-Lox-System oder Mutagenese) führen häufig zur irreversiblen Aktivierung oder Repression der Zielgenexpression bzw. Proteinaktivität ^{16 , 17 , 18} . Das Tet-On / Tet-Off-System ¹⁹ bietet eine verbesserte zeitliche Kontrolle der Gentranskription, aber es fehlt eine strikte räumliche Kontrolle, da es auf der Diffusion von Tetracyclin beruht. Jüngste Entwicklungen in der chemisch induzierten Proteindimerisierung ²⁰ oder photo-uncaging ^{21 , 22 , 23 , 24} haben stark verbessertDie zeitliche Steuerung von Signalisierungsnetzwerken. Die räumliche Kontrolle bleibt jedoch aufgrund der diffusen Beschaffenheit der eingesperrten Chemikalien anspruchsvoll.

Jüngste aufkommende optogenetische Ansätze, die die Kraft des Lichts nutzen, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu kontrollieren, erlauben die Modulation von Signalwegen mit hoher räumlich-zeitlicher Präzision sowie Reversibilität. Kurz nach ihrem anfänglichen Erfolg bei der Kontrolle des neuronalen Brennens ^{25 , 26 , 27} wurde die Optogenetik erweitert, um andere zelluläre Prozesse wie die Gentranskription, Translation, Zellmigration, Differenzierung und Apoptose ^{28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 zu} kontrollieren ^{, 34} . Eine Strategie mit dem pHotoaktivierbares Proteinpaar Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) -Protein und die N-terminale Domäne von Cryptochrom-interagierenden Basic-Helix-Loop-Helix (CIBN) wurde kürzlich entwickelt, um die Raf1-Kinase-Aktivität in Säugetierzellen und Xenopus- Embryonen ^{35 zu} kontrollieren. CRY2 bindet an CIBN bei Blue-Light-Stimulation, und der CRY2 / CIBN-Proteinkomplex dissoziiert spontan im Dunkeln ³⁴ . Blaues Licht erregt den CRY2-Cofaktor, Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD), was zu einer Konformationsänderung in CRY2 und dessen anschließender Bindung an CIBN führt. Konstitutiv aktive (W374A) und Flavin-defiziente (D387A) -Mutanten von CRY2 können durch Mutationen in der FAD-Bindungstasche ^{produziert werden} : Die CRY2 ^W374A- Mutante bindet an CIBN unabhängig von Licht, während die CRY2 ^D387A- Mutante nicht an CIBN unter blau bindet Leichte Stimulation ^{36 , 37} . Das optogenetische System beschrieben iN dieses Protokoll verwendet Wildtyp-CRY2 und CIBN, um die Protein-Translokation-vermittelte Raf1-Aktivierung in lebenden Zellen zu induzieren. Es ist bekannt, dass die Membranrekrutierung von Raf1 seine Aktivität verstärkt. In diesem System ist ein Tandem-CIBN-Modul an der Plasmamembran verankert und CRY2-mCherry ist an den N-Terminus von Raf1 ³⁵ fusioniert. In Abwesenheit von blauem Licht bleibt CRY2-mCherry-Raf1 im Zytoplasma und Raf1 ist inaktiv. Die Blaulichtstimulation induziert die CRY2-CIBN-Bindung und rekrutiert Raf1 an die Plasmamembran, wo Raf1 aktiviert wird. Die Raf-Aktivierung stimuliert eine Raf / MEK / ERK-Signalkaskade. Sowohl CRY2- als auch CIBN-Fusionsproteine ​​sind in einem bikistronischen genetischen System codiert. Diese Strategie kann verallgemeinert werden, um andere Kinasen, wie zB Akt, zu kontrollieren, deren Aktivierungszustand auch durch Protein-Translokation in Zellen ³⁹ eingeschaltet werden kann. Diese Arbeit stellt detaillierte Protokolle für die Umsetzung dieser optogenetischen Strategie in Säugetierzellkultur darRes und multizellulären Organismen.