JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia do Desenvolvimento

Lichtgemedieerde Terugkeerbare Modulatie van de Mitogeen-Geactiveerde Proteïne Kinase Pathway tijdens Cell Differentiatie en<em> Xenopus</em> Embryonale Ontwikkeling

Published: June 15, 2017
doi:
10.3791/55823
, , , , , , ,
1Department of Biochemistry,University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Comparative Biosciences,University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Neuroscience Program,University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Center for Biophysics and Quantitative Biology,University of Illinois at Urbana-Champaign

Summary

Dit protocol beschrijft een optogenetische strategie voor het moduleren van mitogeen-geactiveerde proteïne kinase (MAPK) activiteit tijdens celdifferentiatie en Xenopus embryonale ontwikkeling. Deze methode maakt het mogelijk om de omkeerbare activering van de MAPK signalering weg in zoogdiercelcultuur en in multicellulaire levende organismen, zoals Xenopus embryo's, met een hoge ruimtelijke en temporale resolutie.

Abstract

Kinase-activiteit is cruciaal voor een overvloed aan cellulaire functies, waaronder celproliferatie, differentiatie, migratie en apoptose. Tijdens de vroege embryonale ontwikkeling is de kinase-activiteit zeer dynamisch en wijdverspreid over het embryo. Farmacologische en genetische benaderingen worden vaak gebruikt om kinase-activiteiten te onderzoeken. Helaas is het uitdagend om superieure ruimtelijke en temporale resolutie te bereiken met behulp van deze strategieën. Bovendien is het niet haalbaar om de kinaseactiviteit op een omkeerbare manier te controleren in levende cellen en multicellulaire organismen. Een dergelijke beperking blijft een knelpunt voor het bereiken van een kwantitatief begrip van kinase-activiteit tijdens ontwikkeling en differentiatie. Dit werk presenteert een optogenetische strategie die profiteert van een bicistronisch systeem dat fotoactivatabele eiwitten bevat Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) en het N-terminale domein van Cryptochrome-interactie Basis-Helix-Lus-Helix (CIBN). ReversiBle activatie van de mitogeen-geactiveerde proteïne kinase (MAPK) signalering route wordt bereikt door middel van licht gemedieerde eiwit translocatie in levende cellen. Deze aanpak kan toegepast worden op zoogdiercelculturen en levende embryo's van vertebraten. Dit bicistronische systeem kan worden genegaliseerd om de activiteit van andere kinasen te reguleren met soortgelijke activatiemechanismen en kan toegepast worden op andere modelsystemen.

Introduction

Groeifactoren zijn betrokken bij een breed spectrum van celfuncties, waaronder proliferatie, differentiatie, migratie en apoptose, en spelen in vele biologische gebeurtenissen een centrale rol, waaronder embryonale ontwikkeling, veroudering en regulering van de mentale status 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Veel groeifactoren signaleren via complexe intracellulaire signalerende cascades. Deze signaleringsgebeurtenissen worden op een nauwkeurig gereguleerde wijze 6 , 7 vaak door reversibele eiwitfosforylering bediend. Zo is een begrip van de signaleringsuitkomsten van proteïnekinasen, die verantwoordelijk zijn voor eiwitfosforylering, fundamenteel belangrijk.

Verschillende groeifactoren fungeren door een vrij algemeen intracellulair signaleringsnetwerk, ook al stimuleren ze distInkt cellulaire responsen 8 , 9 . Algemene intracellulaire mediatoren van receptor tyrosine kinasen omvatten Ras, Raf, extracellulaire signaal-gereguleerde kinase (ERK), mitogeen-geactiveerde proteïne kinase (MAPK) / ERK kinase (MEK), fosfoinositide 3-kinase (PI3K), Akt en fosfolipase C gamma (PLCy) 10 , 11 . Het verzamelen van bewijs suggereert dat signalering diversiteit en specificiteit afhangen van de ruimtelijke en tijdelijke regulatie van signaleringsactiviteit 12 . Bijvoorbeeld, bij ratfheochromocytoomcellen (PC12) stimuleert epidermale groeifactor (EGF) -stimulatie, die resulteert in celproliferatie, de ERK-route 9 transient actief. Anderzijds stimuleert stimulatie met zenuwgroeifactor (NGF), die leidt tot celdifferentiatie, de ERK-weg op een volgehoue ​​wijze 9 , 13 . In gekweekte rBij hippocampale neuronen bevordert transiënte signalering door hersenafleidende neurotrofe factor (BDNF) de primaire neurietgroei, terwijl blijvende signalering leidt tot verhoogde neurietakking 14 . Tijdens de vroege embryonale ontwikkeling is de gefosforyleerde ERK-activiteit tijdelijk dynamisch en verspreid over het embryo 6 . Een recent genetisch scherm tijdens de vroege Xenopus embryogenese toonde aan dat ERK en Akt signaling cascades, twee stroomafwaartse primaire groeifactorroutes, display-specifieke activatieprofielen 7 tonen . Zo begrijpt een begrip van kinase signalering uitkomsten hulpmiddelen die de ruimtelijke en temporale kenmerken van kinase-activiteit met voldoende resolutie kunnen proberen.

Conventionele experimentele benaderingen om de dynamische aard van de signaaltransductie tijdens de ontwikkeling te onderzoeken, missen de wenselijke ruimtelijke en temporale resolutie. Bijvoorbeeld, farmacologische benaderingen gebruiken kleine chemIcal of biologische moleculen om signaaltransductie in cellen en weefsels te stimuleren of te onderdrukken. De diffusieve aard van deze kleine moleculen maakt het uitdagend om hun actie te beperken tot een bepaald gebied van belang 15 . Genetische benaderingen ( bijv. Transgenese, het Cre-Lox-systeem of mutagenese) leiden vaak tot de onomkeerbare activering of repressie van de doelgen-expressie of eiwitactiviteit 16 , 17 , 18 . Het Tet-On / Tet-Off systeem 19 biedt verbeterde tijdelijke controle van gentranscriptie, maar heeft geen strikte ruimtelijke controle omdat het afhankelijk is van de diffusie van tetracycline. Recente ontwikkelingen in chemisch geïnduceerde eiwitdimerisatie 20 of foto-uncaging 21 , 22 , 23 , 24 hebben een grote verbeteringDe tijdelijke controle van signaleringsnetwerken bewerkstelligd. De ruimtelijke controle blijft echter uitdagend door de diffusieve aard van de gecasteerde chemicaliën.

Recente opkomende optogenetische benaderingen, die de kracht van het licht aanwenden om eiwit-eiwitinteracties te beheersen, maken het mogelijk om de signaleringstrajecten te moduleren met hoge spatiotemporale precisie en omkeerbaarheid. Kort na zijn eerste succes bij het beheersen van neuronale ontsteking 25 , 26 , 27 is optogenetica uitgebreid om andere cellulaire processen te beheersen, zoals gentranscriptie, translatie, celmigratie, differentiatie en apoptose 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 . Een strategie met behulp van de pHotoactivatabele eiwitpaar Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) eiwit en het N-terminale domein van cryptochrome-interactie-basisschroef-lus-helix (CIBN) werd recent ontwikkeld om Raf1 kinase-activiteit in zoogdiercellen en Xenopus embryo's 35 te controleren. CRY2 bindt aan CIBN bij blauwlichtstimulatie, en het CRY2 / CIBN eiwitcomplex splitst spontaan in het donker 34 . Blauw licht verwekt de CRY2 cofactor, flavin adenine dinucleotide (FAD), wat leidt tot een conformatieve verandering in CRY2 en de daaropvolgende binding aan CIBN. Constitutief actieve (W374A) en flavin-deficiënte (D387A) mutanten van CRY2 kunnen worden geproduceerd door mutaties in de FAD-bindende zak: de CRY2 W374A mutant bindt aan CIBN onafhankelijk van licht, terwijl de CRY2 D387A mutant niet bindt aan CIBN onder blauw -lichtstimulatie 36 , 37 . Het optogenetische systeem beschreven iN dit protocol gebruikt wildtype CRY2 en CIBN om eiwittranslokatiegemedieerde Raf1-activering in levende cellen te induceren. Het is bekend dat de membraanaanwerving van Raf1 zijn activiteit 38 verbetert. In dit systeem wordt een tandem CIBN-module verankerd aan het plasmamembraan en CRY2-mCherry is gefuseerd aan de N-terminale van Raf1 35 . Bij gebrek aan blauw licht blijft CRY2-mCherry-Raf1 in het cytoplasma, en Raf1 is inactief. Blue-light stimulatie induceert CRY2-CIBN binding en rekruteert Raf1 aan het plasmamembraan, waar Raf1 geactiveerd is. Raf activering stimuleert een Raf / MEK / ERK signalering cascade. Beide CRY2- en CIBN-fusie-eiwitten worden gecodeerd in een bicistronisch genetisch systeem. Deze strategie kan worden genegaliseerd om andere kinasen te controleren, zoals Akt, waarvan de activeringsstaat ook kan worden aangestuurd door eiwittransplicatie in cellen 39 . Dit werk bevat gedetailleerde protocollen voor de implementatie van deze optogenetische strategie bij zoogdiercelcultuRes en multicellulaire organismen.

Protocol

Dieronderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen die zijn vastgesteld door het Institusionele Diervoeder- en Gebruikskomitee van Illinois (IACUC) en het departement van dierlijke hulpbronnen van de Universiteit van Illinois (DAR). 1. Optogenetische Inductie van Proteïne Lokalisatie in BHK21 Mammalian Cell Culture OPMERKING: Stappen 1.1-1.3 geven een methode om een ​​celcultuurkamer te monteren voor beeldvorming met hoge vergrotingsdoelstelling…

Representative Results

Ratiometrische expressie van fotoactivatabele eiwitparen: Figuur 1A toont het ontwerp van een bicistronisch optogenetisch construct, CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX (aangeduid als CRY2-2A-2CIBN), gebaseerd op de porcine teschovirum- 1 2A (P2A) peptide, dat de hoogste ribosom-overspringende efficiëntie onder zoogdiercellijnen 42 toont. In eerdere werkzaamheden is vastgesteld dat de optimale verhouding voor CIBN-GFP-CaaX: CRY2…

Discussion

Bij het bouwen van de lichtbox moet de stroom van individuele LED's worden gemeten. Op basis van eerdere ervaringen kan de stroomuitgang variëren tussen individuele LED's door de fabricagevariantie. Selecteer een set LED's die een stroomuitgang hebben binnen 10% van elkaar. Het aantal LED's, de stroombegrenzende weerstand en de voedingsingang kunnen worden aangepast voor verschillende soorten celcultuurcontainers (bijvoorbeeld een 6-put of een 24-putje plaat). Een 24 uur lichtverlichting bij een vermoge…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de Universiteit van Illinois in Urbana-Champaign (UIUC) en de National Institutes of Health (NIGMS R01GM111816).

Materials

Glass coverslip  VWR 48393 230 Substrate for live cell imaging
Coverslip holder  Newcomer Supply 6817B Holder for coverslips
Detergent  ThermoFisher 16 000 104 For cleaning coverslips
Boric acid  Sigma-Aldrich B6768-500G For making PLL buffer
Disodium tetraborate Sigma-Aldrich 71996-250G For making  PLL buffer
Plastic beaker Nalgene 1201-1000 For cleaning coverslips
Sodium hydroxide  Sigma-Aldrich 221465-2.5KG For adjust pH
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P1274-500MG For coating coverslip
Diethylpyrocarbonate (DEPC)-Treated Water ThermoFisher Scientific 750024 For DNA preparation
Cover Glass Forceps Ted Pella 5645 Cover glass handling
Tissue cutlure dish Thermofisher 12565321 Cell culture dish
Sterile centrifuge tubes ThermoFisher 12-565-271 Buffer storage
Transfection Reagent ThermoFisher R0534 Transfection
CO2-independent medium ThermoFisher 18045088 For live cell imaging
Polydimethylsiloxane (PDMS) Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Form make cell chamber
Plasmid Maxiprep kit Qiagen 12965 Plasmid preparation
DMEM medium ThermoFisher 11965-084 Cell culturing medium component
F12K medium ThermoFisher 21127022 Cell culturing medium component
Horse serum ThermoFisher 16050122 Cell culturing medium component
Fetal Bovine Serum Signa-Aldrich 12303C-500 mL Cell culturing medium component
Penicillin-Streptomycin-Glutamine ThermoFisher 10378016 Cell culturing medium component
Trypsin (0.25%), phenol red ThermoFisher Scientific 15050065  For mammalian cell dissociation
Agarose Fisher Scientific BP1356-100 For DNA preparation
Ficoll PM400 GE Heathcare Life Sciences 17-5442-02 For embryo buffer
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma-Aldrich 1.02839.0025 Oocyte preparation
ApaI ThermoFisher FD1414 For linearization of plasmids
Dnase I ThermoFisher AM2222 For removing DNA template in the in vitro transcription assay
Index-match materials (immersion oil) Thorlabs MOIL-20LN For matching the index between sample substrate and objective
Blue LED Adafruit 301 Light source for optogenetic stimulation
Resistor kit Amazon EPC-103 current-limiting resistor
Aluminum boxes BUD Industries AC-401 light box 
BreadBoard Jekewin 837654333686 For making LED array
Hook up Wire Electronix Express 27WK22SLD25 For making LED array
Relay Module Jbtek SRD-05VDC-SL-C For intermittent light control
DC Power Supply  TMS DCPowerSupply-LW-(PS-305D) Power supply for LED
Silicon Power Head Thorlabs S121C For light intensity measurement
Power meter Thorlabs PM100D  For light intensity measurement
Microscope Leica Biosystems DMI8 For live cell imaging
BioSafety Cabinet ThermoFisher 1300 Series A2 For mammalian cell handling
CO2 incubator ThermoFisher Isotemp For mammalian cell culturing
Stereo microscope Leica M60 For embryo micro-manipulation
Microinjector Narishige IM300 For embryo microinjection
Micropipette puller Sutter Instruments P87 Needle puller
in vitro transcription kit ThermoFisher AM1340 For in vitro transcription. The kit includes nuclease-free water, SP6 RNA  Polymerase, ribonucleotide mixture, cap analog, lithium choride precipitation solution, and spin column  
RNA purfication kit Qiagen 74104 Silica-membrane spin column for purification of synthesized RNA 
Convection oven MTI corporation  EQ-DHG-9015 PDMS curing
Centrifugal mixer and teflon container THINKY AR310 For mixing PDMS
Silicon wafer UniversityWafer 452 Base for making PDMS  devices
Blade Techni Edge 01-801 For cutting PDMS
Capillary glass Sutter Instruments BF100-58-10 For fabrication of injecting needles. 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Schlessinger, J., Ullrich, A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases. Neuron. 9 (3), 383-391 (1992).
  2. Thisse, B., Thisse, C. Functions and regulations of fibroblast growth factor signaling during embryonic development. Dev Biol. 287 (2), 390-402 (2005).
  3. Perrimon, N., Pitsouli, C., Shilo, B. Z. Signaling mechanisms controlling cell fate and embryonic patterning. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a005975 (2012).
  4. Salles, F. H., et al. Mental disorders, functional impairment, and nerve growth factor. Psychol Res Behav Manag. 10, 9-15 (2017).
  5. Basson, M. A. Signaling in cell differentiation and morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (6), (2012).
  6. Schohl, A., Fagotto, F. beta-catenin, MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
  7. Zhang, S. W., Li, J. J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PloS one. 8 (11), e79469 (2013).
  8. Sweeney, C., et al. Growth factor-specific signaling pathway stimulation and gene expression mediated by ErbB receptors. J Biol Chem. 276 (25), 22685-22698 (2001).
  9. Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 80 (2), 179-185 (1995).
  10. Vandergeer, P., Hunter, T., Lindberg, R. A. Receptor Protein-Tyrosine Kinases and Their Signal-Transduction Pathways. Annu Rev Cell Biol. 10, 251-337 (1994).
  11. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  12. Hunter, T. Signaling–2000 and beyond. Cell. 100 (1), 113-127 (2000).
  13. Qiu, M. S., Green, S. H. PC12 cell neuronal differentiation is associated with prolonged p21ras activity and consequent prolonged ERK activity. Neuron. 9 (4), 705-717 (1992).
  14. Ji, Y., et al. Acute and gradual increases in BDNF concentration elicit distinct signaling and functions in neurons. Nat Neurosci. 13 (3), 302-309 (2010).
  15. Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: volume, viscosity, diffusion, intracellular surface area. Int Rev Cytol. 192, 189-221 (2000).
  16. Sauer, B. Inducible gene targeting in mice using the Cre/lox system. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 14 (4), 381-392 (1998).
  17. Ling, M. M., Robinson, B. H. Approaches to DNA mutagenesis: an overview. Anal Biochem. 254 (2), 157-178 (1997).
  18. Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214 (2-3), 91-109 (2010).
  19. Wanka, F., et al. Tet-on, or Tet-off, that is the question: Advanced conditional gene expression in Aspergillus. Fungal Genet Biol. 89, 72-83 (2016).
  20. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28 (7), 743-747 (2010).
  21. Liu, Q. Y., Deiters, A. Optochemical Control of Deoxyoligonucleotide Function via a Nucleobase-Caging Approach. Accounts of Chemical Research. 47 (1), 45-55 (2014).
  22. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  23. Gautier, A., Deiters, A., Chin, J. W. Light-activated kinases enable temporal dissection of signaling networks in living cells. J Am Chem Soc. 133 (7), 2124-2127 (2011).
  24. Nguyen, D. P., et al. Genetic Encoding of Photocaged Cysteine Allows Photoactivation of TEV Protease in Live Mammalian Cells. J Am Chem Soc. 136 (6), 2240-2243 (2014).
  25. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  26. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  27. Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
  28. Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends in Biotechnology. 33 (2), 92-100 (2015).
  29. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (8), 551-558 (2014).
  30. Kim, B., Lin, M. Z. Optobiology: optical control of biological processes via protein engineering. Biochemical Society Transactions. 41 (5), 1183-1188 (2013).
  31. Tucker, C. L. Manipulating cellular processes using optical control of protein-protein interactions. Prog Brain Res. 196, 95-117 (2012).
  32. Toettcher, J. E., Gong, D. Q., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light Control of Plasma Membrane Recruitment Using the Phy-Pif System. Method Enzymol. 497, 409-423 (2011).
  33. Zoltowski, B. D., Gardner, K. H. Tripping the light fantastic: blue-light photoreceptors as examples of environmentally modulated protein-protein interactions. Bioquímica. 50 (1), 4-16 (2011).
  34. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  35. Krishnamurthy, V. V., et al. Reversible optogenetic control of kinase activity during differentiation and embryonic development. Development. 143 (21), 4085-4094 (2016).
  36. Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 Interacts with CIB1 to Regulate Transcription and Floral Initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  37. Li, X., et al. Arabidopsis cryptochrome 2 (CRY2) functions by the photoactivation mechanism distinct from the tryptophan (trp) triad-dependent photoreduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20844-20849 (2011).
  38. Leevers, S. J., Paterson, H. F., Marshall, C. J. Requirement for Ras in Raf Activation Is Overcome by Targeting Raf to the Plasma-Membrane. Nature. 369 (6479), 411-414 (1994).
  39. Kohn, A. D., Takeuchi, F., Roth, R. A. Akt, a pleckstrin homology domain containing kinase, is activated primarily by phosphorylation. J Biol Chem. 271 (36), 21920-21926 (1996).
  40. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  41. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).
  42. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556 (2011).
  43. Ishimura, A., et al. Oncogenic Met receptor induces ectopic structures in Xenopus embryos. Oncogene. 25 (31), 4286-4299 (2006).
  44. Zhang, K., et al. Light-Mediated Kinetic Control Reveals the Temporal Effect of the Raf/MEK/ERK Pathway in PC12 Cell Neurite Outgrowth. PloS one. 9 (3), e92917 (2014).
  45. Mohanty, S. K., Lakshminarayananan, V. Optical Techniques in Optogenetics. J Mod Opt. 62 (12), 949-970 (2015).
  46. Taslimi, A., et al. Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nature chemical biology. 12 (6), 425-430 (2016).
  47. Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nat Commun. 6, 6256 (2015).
  48. Wang, H., et al. LOVTRAP: an optogenetic system for photoinduced protein dissociation. Nat Methods. 13 (9), 755-758 (2016).
  49. Chang, K. Y., et al. Light-inducible receptor tyrosine kinases that regulate neurotrophin signalling. Nat Commun. 5, 4057 (2014).
  50. Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140 (7), 1605-1613 (2013).
  51. Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PLoS One. 7 (11), e50738 (2012).
  52. Buckley, C. E., et al. Reversible Optogenetic Control of Subcellular Protein Localization in a Live Vertebrate Embryo. Dev Cell. 36 (1), 117-126 (2016).
  53. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  54. Beyer, H. M., et al. Red Light-Regulated Reversible Nuclear Localization of Proteins in Mammalian Cells and Zebrafish. ACS Synth Biol. 4 (9), 951-958 (2015).

Tags

Light-mediatedReversible ModulationMitogen-activated Protein Kinase PathwayCell DifferentiationXenopus Embryonic DevelopmentOptogenetic InductionCIBN-CRY2 InteractionFluorescence ImagingPHK21 CellsCRY2-mCherry-Raf1 Plasmid

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Krishnamurthy, V. V., Turgeon, A. J., Khamo, J. S., Mondal, P., Sharum, S. R., Mei, W., Yang, J., Zhang, K. Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development. J. Vis. Exp. (124), e55823, doi:10.3791/55823 (2017).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image