提出了使用一个样品从生物组织中综合提取脂质,代谢物和蛋白质的方案。
了解复杂的生物系统需要测量,分析和整合活细胞的多种化合物类型,通常通过转录组学,蛋白质组学,代谢组学和脂质组学测量来确定。在本协议中,我们引入了一种简单的方法,可以使用每个样品的单一等分试样从生物组织中重现性提取代谢物,脂质和蛋白质。提取方法基于甲基叔丁基醚:甲醇:液体系统:将疏水和极性代谢物液体分配成两个不混溶相,同时沉淀蛋白质和其他大分子作为固体颗粒。因此,该方法提供了特定分子组成的三个不同部分,其与常见的高通量“omics”技术完全相容,例如与质谱联用的液相色谱(LC)或气相色谱(GC)。即使该方法是init被开发用于不同植物组织样品的分析,已被证明完全兼容于从藻类,昆虫,哺乳动物组织和细胞培养物等系统中提取和分析生物样品。
系统生物学在上个世纪中期出现1 ,并通过基因组和转录组数据集2,3的大规模分析推进,已经发展成为复杂生物系统分析的新的和不可或缺的方法4,5 。系统生物学的主要目标是破译生物系统中的组分相互作用和依赖关系,并桥接基因型,其实现,分子转化和所得表型之间的联系。因此,通过各种大规模分析方法,即基因组学,转录组学,代谢组学,脂质组学和蛋白质组学及其计算分析所产生的综合数据集的整合已经成为对复杂生物系统的描述和理解的先决条件。
巴斯关于任何生活系统中生物成分的巨大化学多样性和复杂性,大量和全面的“omics”数据集的生产强烈依赖于应用提取方法的质量9 。除了提取方法的质量外,该方法的经济性也很重要;这意味着希望从尽可能少的样品输入获得尽可能多的分子信息。通常,样品量可以是限制性的,因此非常希望使用提取方法,其可以从给定样品的单次提取中获得尽可能多的分子等级。这意味着,不是使用几种专门的提取方法从相同样品的不同样品等分试样中提取不同的化合物类别,而是采用顺序提取方法,将单个等分试样的分子成分分解成不同的分子级分。
_content“>这些分级提取方法采用的常用方法是基于Folch 等在1957年开发的两相脂质提取方法10 ,该方法基于氯仿:甲醇/水分配极性和疏水性代谢物,并且是随着多系统生物学的发展,Folch方法进一步逐步改进,通过利用它对蛋白质和极性代谢物和脂质的样品分配进行改进,基于气相色谱和液相色谱的代谢组学和极性和疏水性化合物的脂质组学,除了基于液相色谱的蛋白质组学11,12,13,14之外,遗憾的是,所有这些方法都依赖于基于氯仿的提取方法,导致不希望的fo蛋白质沉淀物作为极性和脂质相之间的界面,但是从绿色化学的角度来看也是不期望的溶剂15,16 。然而,溶剂甲基叔丁基醚(MTBE)克服了上述两个问题,并且是氯仿的合适替代物。根据这些要求,我们决定建立一个MTBE:甲醇:水基萃取方法,满足上述所有规范,从而成为综合多元分析的理想起点。该协议引导用户逐步通过样品制备的简单,快速和可重复的工作流程,包括常见观察问题的故障排除。此外,我们将简要介绍超高效液相色谱 – 质谱(UPLC-MS)-bas的典型分析数据来自植物组织样品的脂质组学,代谢组学和蛋白质组学分析。即使给出的实施例来源于50mg的拟南芥叶组织样品,该方案已被用于几种其他生物样品和组织,包括藻类17,18 ,昆虫19和哺乳动物细胞,器官和组织20,21 , 22 。提出的提取方案的范围是提供对提取前样品处理和提取程序本身的清楚和详细的描述。尽管我们提供了三个分析应用的简要示例,但是有关分析前和分析后数据处理的详细信息可以从我们以前的出版物16,23,24 , <supclass =“xref”> 25,26。
在本文中,我们描述和说明了一个简单且高度适用的提取方案,用于从单个50 mg叶片样品进行综合脂质体,代谢组学和蛋白质组学分析。这种方法以前已经在几项研究中使用,已经在不同的文章17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,31,32,33,34,35,36,37并证明,除了它的直接工作流程和高适用性要坚固可重复。
这里提供的应用程序显示了复杂生物样品的初步筛选的一些常规方法。这些说明了大规模代谢组学和脂质组学数据集可以提供关于分析的生物系统的代谢的广泛或具体变化的综合信息,而从蛋白质分析获得的数据提供了对定量(丰度)和定性(修饰)酶,结构蛋白或转录因子(TF)的变化,控制细胞功能和机械。因此,通过阐明与特定代谢途径或细胞过程相关的不同分子的分子变化,整合的omics数据具有揭示关于生物系统的遗传或生物和/或非生物扰动诱发的可能变化的初始信息的潜力。
当然从长远来看,对于成功的系统生物学分析来说,最大限度地分析和注释分子实体的数量是非常重要的,从而尽可能完全监测细胞功能和活动。为此,所得到的级分可以额外应用于多种分析方法,靶向其他化合物或化合物类别( 图4 )。
说到这一点,必须提到的是,获取的数据的全球分析策略可以遵循两种不同的策略:一方面,我们一直在强调通过定量已知化合物来阐明细胞功能。另一方面,许多测量的代谢物和脂质尚未知晓或注释。这些尚未注释的复合测量还包含大量有意义的信息,可以通过统计学方法用于分类或鉴别b治疗组或治疗20,21,22 。
然而,这些未知化合物,特别是与组分类有关或用作生物标志物的化合物需要被鉴定。这种识别过程不幸很繁琐,如果没有额外的分析测量或策略,则无法实现。从图4可以看出,未注释化合物的数量相当高(实际上绝大多数)。然而,如上所述,这些色谱峰可以在数据分析中处理,因此显着影响的实体可以被阐明并进行进一步的识别策略。
总之,我们可以得出结论,这里介绍的协议为实验系统生物学和经典统计学应用提供了几个优点ations。
首先,由于从单个样品中提取所有级分,所以不同实验数据集(脂质,代谢物,蛋白质)之间的变化显着减少,因为每个数据集都是从相同的样品等分试样得到的。这显然导致获得的结果的可比性增加。
第二,该方法易于扩展,因此与小到大的样品量高度兼容。我们常规使用10-100毫克的组织样本,但是也可以在20个拟南芥种子上进行成功的脂质学研究31 。特别是与小样品量的相容性使得该方法适用于有限量的生物组织或样品。然而,即使有足够的样品材料可用,这里提出的方法提供了利用这些样品在更大数量的实验重复而不是u的优点为不同的提取程序唱歌。这允许更好和精细化的统计数据分析。
第三,由于该方法基于极性和非极性分子的液 – 液分馏,因此与简单的单相萃取方法( 例如甲醇萃取)相反,该方法在该方法中显着的去络合步骤。这种有效的样品去络合导致由于化学干扰分子彼此分离而导致单个级分的部分纯化。因此,化学分配过程不仅提供了将提取的样品系统地等分为不同化学分类的实际优点,而且改进了各自的分析测量,因为它从不同级分中除去污染化合物。显然,我们可以观察到,特别是脂质被分配到有机相,通常是负面影响的极性化合物的色谱分析将几乎完全不含极性部分。对于分解极性化合物的疏水性脂质也是如此。除了极性和非极性化合物的净化之外,我们从样品中消耗和收集蛋白质和其他大分子,这不仅提供了单独的级分,可用于蛋白质,淀粉和细胞壁分析16 ,而且导致各个部分内的清洁剂样品。这是特别相关的,因为已知大分子的存在导致分析柱的损伤或寿命至少更短。
最后但并非最不重要的一点,MTBE萃取方法依赖于较少危险性和更有利的氯仿置换溶剂15 ,已被我们的几项研究表明,被广泛应用来自植物16 ,藻类17,18 ,苍蝇19的不同生物样品的融合性,还包括几种哺乳动物组织,器官或细胞20,21,22 。
The authors have nothing to disclose.
MS获得GERLS-DAAD计划的完整博士学位奖学金。我们要感谢Andrew Wiszniewski博士对手稿的阅读和评论。我们非常感谢德国戈尔姆马克斯普朗克分子植物生理学研究所的Giavalisco实验室的所有成员的帮助。
Reagents and standards | |||
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
Equipment | |||
Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
Tissue grinding mixer mill | Retsch, Mixer Mill MM 300 | 20.746.0001 | |
Mortar and pestle | Sigma Aldrich | Z247464-1EA | |
Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
MS system | Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo-Fisher, Bremen, Germany). | ||
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
Q ExactivePlus high resolution mass spectrometer connected to an EASY-nLC 1000 system | Thermo-Fisher, Bremen, Germany | Analysis of peptides |