成熟シュワン細胞の発生源としての骨髄由来前駆細胞の低酸素プレコンディショニング
Summary
骨髄内には、神経ポテンシャルを有する骨髄間質細胞（MSC）が存在する。我々のプロトコルは、低酸素プレコンディショニングを介してこの細胞集団を濃縮し、その後それらを成熟シュワン細胞にするよう指示する。
Abstract
この原稿は、骨髄間質細胞（MSC）集団から神経前駆細胞を濃縮し、その後それらを成熟シュワン細胞運命に導く手段を記載している。我々はラットおよびヒトのMSCに一時的な低酸素状態（16時間酸素1％）を与え、続いて表皮成長因子（EGF）/塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）補充を伴う低付着層上のニューロスフェアとしての拡大を行った。ニューロスフェアをポリ-D-リシン/ラミニン被覆組織培養プラスチック上に播種し、β-ヘレグリン、bFGFおよび血小板由来増殖因子（PDGF）を含有する膠原性カクテルで培養してシュワン細胞様細胞（SCLC）を生成させた。 SCLCは、E14-15妊娠Sprague Dawleyラットから得られた精製背側根神経節（DRG）ニューロンを用いて、共培養によるコミットメントを2週間行った。成熟シュワン細胞は、S100β/ p75発現の持続性を示し、ミエリンセグメントを形成することができる。このようにして生成された細胞は、脊髄損傷後の自己細胞移植における応用、ならびに疾患モデリングに有用である。
Introduction
神経前駆細胞およびそれらの誘導体の移植は、外傷性神経損傷1,2および神経変性3,4の後の治療戦略として有望であることを示している。臨床応用の前に、i）幹/前駆細胞の自己由来源にアクセスして拡大する方法、およびii）それらを関連する成熟細胞型に導く手段を確実にすることが不可欠である3 。脊髄損傷に対する細胞療法への関心は、成体組織からの神経前駆細胞の堅牢な自己由来の細胞供給源を模索するようになった。
MSCの亜集団は、神経堤に由来し、骨髄腔から容易にアクセス可能である。これらの細胞は、ニューロンおよびグリアを生成し得る神経前駆細胞である。脳虚血の動物モデルは、低酸素症がprolを促進することを実証する脳内の神経前駆細胞の発情と多分化能6 。これは、骨髄由来神経前駆細胞を拡張する手段として低酸素プレコンディショニングを利用するための基礎となった。
損傷した脊髄へのシュワン細胞の移植は、再生を促進する2 。 SCLCは、グリオジェニック因子（ すなわち、 β-ヘレグリン、bFGFおよびPDGF-AA）を補充することによってMSCから生成され得るが、表現型の不安定性を示す。成長因子の回収時に、線維芽細胞様表現型7に戻る 。表現型の不安定性は、異常な分化および発癌のリスクのために、細胞移植において望ましくない。シュワン細胞前駆体は、胚末梢神経8内の軸索束と関連しているので、我々は、精製胚DRGニューロン7を共培養SCLCに導き、ass = "xref"> 9。成熟シュワン細胞は運命決定されており、in vitro 7,9およびin vivo 10で機能を示す 。
MSCからの神経前駆細胞の濃縮に関する我々のプロトコールは、単純かつ効率的であり、その後のアッセイのための細胞数の増加をもたらす。共培養プラットフォームを介した運命決定シュワン細胞の誘導は、グリア分化の研究、および潜在的な臨床適用のための安定かつ機能的なシュワン細胞の生成を可能にする。
Protocol
Representative Results
Discussion
低酸素プレコンディショニングおよびニューロスフェア培養を介して神経前駆細胞を濃縮する前に、MSCの「幹細胞」を保存することが不可欠です。我々の経験から、多分化能MSCは、それらの細長い線維芽様の形態によって確実に同定され得る。対照的に、顕著な細胞骨格ストレスファイバーを有するより平らな四角形形態を採用したMSCは、容易に神経細胞運命を採用せず、廃棄すべきである?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、低酸素室装置を提供してくれたNai-Sum Wong博士と技術サポートのためのAlice Luiさんに感謝したいと思います。
Materials
| αMEM | Sigmaaldrich | M4526 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher scientific | 12400-024 | |
| Neurobasal medium | Thermofisher scientific | 21103-049 | |
| FBS | Biosera | FB-1280/500 | |
| B27 | Thermofisher scientific | 17504-001 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Thermofisher scientific | PHG0313 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B/100UG | |
| Nerve growth factor (NGF) | Millipore | NC011 | |
| Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA) | Peprotech | 100-13A | |
| Heregulin beta-3, EGF domain (β-Her) | Millipore | 01-201 | |
| Uridine | Sigmaaldrich | U3003 | |
| 5-Fluro-2' – deoxyuridine (FDU) | Sigmaaldrich | F0503 | |
| Poly-D-lysine (PDL) | Sigmaaldrich | P7886-1G | |
| Laminin | Thermofisher scientific | 23017015 | |
| GlutaMAX | Thermofisher scientific | 35050061 | |
| Penicillin / streptomycin (P/S) | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| TrypLE Express | Thermofisher Scientific | 12604-013 | |
| 10 cm plate for adherent culture | TPP | 93100 | Used for selection of MSCs by tissue culture adherence |
| 6-well plate for adherent culture | TPP | 92006 | Used for expansion of MSCs following passaging |
| UltraLow 6-well plate for non-adherent culture | Corning | 3471 | Used for neural progenitor enrichment |
| anti-human CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 555593 | |
| anti-human CD73 | BD Biosciences | 550256 | |
| anti-human/rat STRO-1 | R&D Systems | MAB1038 | |
| anti-human nestin | R&D Systems | MAB1259 | |
| anti-human CD45 | BD Biosciences | 555480 | |
| anti-rat CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 554895 | |
| anti-rat CD73 | BD Biosciences | 551123 | |
| anti-rat nestin | BD Biosciences | MAB1259 | |
| anti-rat CD45 | BD Biosciences | 554875 | |
| Anti-S100β | Dako | Z031101 | |
| Anti-p75 | Millipore | MAB5386 | |
| Anti-GFAP | Sigmaaldrich | G3893 | |
| Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| Anti-Human nuclei | Millipore | MAB1281 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | |
| HEPES buffer | Sigmaaldrich | H4034-100G |
Referências
- Wiliams, R. R., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation: a repair strategy for spinal cord injury?. Prog Brain Res. 201, 295-312 (2012).
- Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: its significant therapeutic potential and prospectus. Rev Neurosci. 26 (2), 121-128 (2015).
- Lindvall, O., Kokaia, Z. Stem cells in human neurodegenerative disorders–time for clinical translation?. J Clin Invest. 120 (1), 29-40 (2010).
- Terzic, D., et al. Directed Differentiation of Oligodendrocyte Progenitor Cells From Mouse Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Transplant. 25 (2), 411-424 (2016).
- Takashima, Y., et al. Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation. Cell. 129 (7), 1377-1388 (2007).
- Felling, R. J., et al. Neural stem/progenitor cells participate in the regenerative response to perinatal hypoxia/ischemia. J Neurosci. 26 (16), 4359-4369 (2006).
- Shea, G. K., Tsui, A. Y., Chan, Y. S., Shum, D. K. Bone marrow-derived Schwann cells achieve fate commitment–a prerequisite for remyelination therapy. Exp Neurol. 224 (2), 448-458 (2010).
- Jessen, K. R., Mirsky, R. The origin and development of glial cells in peripheral nerves. Nat Rev Neurosci. 6 (9), 671-682 (2005).
- Mung, K. L., et al. Rapid and efficient generation of neural progenitors from adult bone marrow stromal cells by hypoxic preconditioning. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 146 (2016).
- Ao, Q., et al. The regeneration of transected sciatic nerves of adult rats using chitosan nerve conduits seeded with bone marrow stromal cell-derived Schwann cells. Biomaterials. 32 (3), 787-796 (2011).
- Tondreau, T., et al. Isolation of BM mesenchymal stem cells by plastic adhesion or negative selection: phenotype, proliferation kinetics and differentiation potential. Cytotherapy. 6 (4), 372-379 (2004).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Jirsova, K., Sodaar, P., Mandys, V., Bar, P. R. Cold jet: a method to obtain pure Schwann cell cultures without the need for cytotoxic, apoptosis-inducing drug treatment. J. Neurosci. Methods. 78 (1-2), 133-137 (1997).
