Mikrotubuli (MTs) er polymerer af α – og β-tubulin, samles til lineære protofilaments, hvoraf flere kombinere til at danne et hult rør^1,2. MTs er polariseret strukturer, med hurtigtvoksende plus ender og langsomt voksende minus ender, der er forankret på centrosome eller andre organisering af mikrotubulus center (MTOC)³. De novo MT dannelse er initieret af Nukleering på γ-tubulin ring kompleks (γ-TURC), som indeholder en skabelon til MT forsamling⁴. I en given celle, kan to populationer af MTs skelnes der tur til forskellige priser. Dynamisk MTs udforske deres cellulære miljø ved at skifte mellem faser af vækst og svind i en proces kendt som dynamiske ustabilitet⁵. I modsætning til dynamisk MTs, stabil MTs er ikke-voksende og har en længere halveringstid end dynamisk MTs⁶.

Årtiers forskning i cellebiologi har leveret en avanceret vifte af værktøjer til at studere MT struktur og funktion og resulterede i en omfattende viden om disse cytoskeletal elementer. For eksempel, MTs spiller en central rolle i etablering og vedligeholdelse af celle polaritet, som ikke kun kan tilskrives deres iboende polaritet, men også til en differentieret subcellulært fordeling af stabil versus dynamiske MTs^{7, 8}. derimod langt mindre forstås om MT arkitektur og funktion i mere komplekse tredimensionale (3D) miljøer, såsom hvirveldyr embryoner, delvis på grund af udfordringen af imaging MT cytoskelettet med høj opløsning. Trods denne begrænsning, den seneste generation af normal god landbrugspraksis-udtrykker transgene linjer at mærke MTs eller forbigående udtryk af fluorescently markeret MT markører har øget vor forståelse af de dynamiske ændringer, som MTs gennemgå og deres cellulære og udviklingsmæssige rolle i zebrafisk embryo. Hele MT netværket kan være afbildet i transgene linjer i hvilke tubulin er enten direkte mærket⁹ eller tubulin polymerer er indirekte mærket ved hjælp af MT-associerede proteiner Doublecortin-lignende-kinase (Dclk) eller Ensconsin (EMTB)^{10, 11}. Andre linjer (og konstruktioner) er blevet genereret, aktiverer vurdering af MT iboende polaritet ved specielt mærkning MT plus ender eller centrosome-forankrede minus ender^{11,12,13, 14}. magt af disse værktøjer ligger i evnen til at studere MT dynamics i live, udvikle organismer. Sådanne undersøgelser har for eksempel afsløret den rumlige og dynamisk fordeling af MTs i specifikke cellepopulationer, orientering af mitotiske spindler i væv gennemgår morfogenese (en indikator af flyet af celledeling), polariteten af MT polymer da det drejer sig om processer såsom celle strækforlængelse og migration, og MT vækst bestemmes af comet hastighed^9,13,15. Begrænsning af disse værktøjer er, at de ikke let diskriminerer mellem stabile og dynamiske MT populationer.

Tegning fra de rige celle biologi litteratur, er immunolabeling metoder til billede stabile og dynamiske MTs i zebrafisk embryo beskrevet her, der er komplementær til brugen af transgene linjer. Den udbredte brug af sådanne immunolabeling metoder i zebrafisk er blevet lidt hæmmet af vanskeligheden i at bevare MT integritet under proceduren fiksering. Protokol 1 beskriver en optimeret metode til immunolabeling samlet, dynamisk, og stabil MTs i cross dele af den tredje zebrafisk baghjernen. Derudover er en ligetil metode ved hjælp af kommercielt tilgængelige software beskrevet for at kvantificere disse MT populationer. Stabil MTs adskiller sig fra dynamiske MTs baseret på flere posttranslationelle modifikationer af α-tubulin, som acetylation og detyrosination, der akkumulerer på stabil MTs over tid^16,17. I zebrafisk embryo opstår acetylation ciliaere og cytoskeletale MTs, men ikke stabilt interphase MTs¹⁸, begrænse nytten af denne markør til en delmængde af stabiliseret MTs. Derimod synes detyrosination at forekomme på alle stabile MTs i zebrafisk embryo¹⁸. Denne posttranslationel modifikation udsætter carboxy-terminal glutaminsyre α-tubulin (detyrosinated tubulin)¹⁸ og kan påvises ved hjælp af anti-Glu-tubulin¹⁹. Selv om detyrosination sker fortrinsvis på stabil MTs, angiver eksperimentelle bevismateriale, at denne posttranslationel modifikation er et resultat af, snarere end en årsag til MT stabilitet¹⁶. Den gensidige MT befolkning, sammensat af dynamiske MTs, udmærker sig ved hjælp af en antistof, anti-Tyr-tubulin, der specifikt genkender tyrosinated form af α-tubulin¹⁹. Efter immunolabeling med disse markører og konfokal imaging, kvantitativ analyse af MTs (længde, antal og relativ overflod) kan udføres i definerede regioner i udviklingslandene neuralrøret. En strømlinet metode er fastsat her til at udføre denne analyse ved hjælp af 3D-billedbehandling software. Denne metode kan anvendes til løsning af spørgsmål vedrørende morfogenese og etablering eller modning af celle polaritet²⁰. Faktisk, udarbejdelse af polariseret arrays af stabil MTs ledsager mange udviklingsmæssige begivenheder, herunder fotoreceptor morfogenese²¹, epithelialization af celler i udviklingslandene neurale rør¹⁸ og axon dannelse⁸.

Protokol 2 beskriver en i vivo tilpasning af en celle biologi analyse til at analysere MTs under deres forsamling fase (Nukleering/anchorage og vækst)^22,23. Spirende MTs er nukleeret på centrosome og efterfølgende forankret til subdistal vedhæng af mor centriole²³. En metode til at analysere spirende MT genvækst efter depolymerization er beskrevet. Denne protokol indeholder oplysninger om nocodazole behandlingen af depolymerize MTs, drug udvaskning procedure og efterbehandling tilbagebetalingsperioden. MT re-vækst overvåges med regelmæssige mellemrums indlæg udvaskning af immunolabeling med markører for samlede MTs (anti-β-tubulin) sammen med markører for centrosome (anti-γ-tubulin) og kerne (4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)), efter de generelle procedurer beskrevet i protokol 1. MT depolymerization trin i denne protokol er afgørende, da det giver mulighed for vurdering af de novo MT vækst og ikke forlængelse af allerede eksisterende MTs. Denne teknik er derfor adskiller sig fra andre offentliggjorte procedurer til at måle MT vækstrater (i mangel af depolymerization) ved hjælp af en plus spids markør såsom end bindende protein 3 sammenvoksede til grøn fluorescerende proteiner (EB3-NGL), som vist i Tran et al., 2012¹¹. Desuden, denne analyse er især nyttig til at analysere embryoner defekt i de novo MT forsamling, som de tidligere rapporterede NEDD1 mutanter, rekruttering af γ-tubulin til centrosome er nedsat, hvilket resulterer i ufuldstændig neuralrøret dannelse og neuronal defekter²⁴.