Mikrotubuli (MTs) är polymerer av α – och β-tubulin att monterar in linjär protofilaments, varav flera kombineras för att bilda ett ihåligt rör^1,2. MTs är polariserade strukturer, med snabbväxande plus ändar och långsamt växande minus ändar som är förankrade på centrosome eller andra mikrotubulära-organisera center (MTOC)³. De novo MT bildandet initieras av kärnbildning på γ-tubulin ring komplexa (γ-TURC), vilket ger en mall för MT församling⁴. I någon cell, i kan två populationer av MTs skiljas det vänden över i olika takt. Dynamiska MTs utforska deras cellulära miljön genom att växla mellan faser av tillväxt och krympning i en process som kallas dynamisk instabilitet⁵. Till skillnad från dynamiska MTs, stabil MTs är icke växande och har en längre halveringstid än dynamisk MTs⁶.

Decennier av forskning i cellbiologi har tillhandahållit ett sofistikerat utbud av verktyg att studera MT struktur och funktion och resulterade i en stor kropp av kunskap om dessa cytoskeletal element. Till exempel, MTs spela en central roll i upprättande och underhåll av cell polaritet, som beror inte bara på deras inneboende polaritet, men också till differential subcellulär fördelningen av stabil kontra dynamiska MTs^{7, 8}. däremot långt mindre förstås om MT arkitektur och funktion i mer komplex tredimensionell (3-D) miljöer, såsom ryggradsdjur embryot, delvis på grund av utmaningen som imaging MT cytoskelettet med hög upplösning. Trots denna begränsning, den senaste generationen av GFP-uttryckande transgena linjer etiketten MTs eller övergående uttryck för fluorescently-taggade MT markörer har ökat vår förståelse av de dynamiska förändringar som MTs genomgå och deras mobilnät och utvecklande roll i zebrafiskar embryot. Hela MT nätverket kan avbildas i transgena linjerna i vilken tubulin är antingen direkt märkt⁹ eller tubulin polymerer märks indirekt genom att använda MT-associerade proteiner Doublecortin-liknande-Kinas (Dclk) eller Ensconsin (EMTB)^{10, 11}. Andra linjer (och konstruktioner) har genererats som möjliggör bedömning av MT inneboende polaritet av specifikt märkning MT plus ändar eller centrosome-förankrade minus slutar^{11,12,13, 14}. kraften i dessa verktyg ligger i förmågan att studera MT dynamik i live, utveckla organismer. Sådana studier visat, till exempel fysisk och dynamisk distribution av MTs i viss cellpopulationer, orienteringen av mitotiska spindlar i vävnader genomgår morfogenes (en indikator på planet av celldelning), polariteten av MT polymeren När det gäller processer såsom cell töjning och migration, och MT tillväxttakt bestäms av komet hastighet^9,13,15. Begränsning av dessa verktyg är att de inte lätt diskriminera mellan stabila och dynamiska MT populationer.

Teckning från rika cellbiologi litteratur, beskrivs immunolabeling metoder att bilden stabil och dynamisk MTs i zebrafiskar embryot här, som är ett komplement till användningen av transgena linjerna. Den utbredda användningen av sådana immunolabeling metoder i zebrafisk har hämmats något av svårigheten att bevara MT under förfarandet för fixering. Protokoll 1 beskriver en optimerad metod för immunolabeling totalt, dynamisk, och stabil MTs i tvärsnitt av utveckla zebrafisk bakhjärnan. Dessutom beskrivs en enkel metod som använder kommersiellt tillgänglig programvara för att kvantifiera dessa MT populationer. Stabil MTs särskiljs från dynamiska MTs baserat på flera post-translationella modifieringar av α-tubulin, såsom acetylering och detyrosination, som ackumuleras på stabil MTs över tid^16,17. I zebrafiskar embryot uppstår acetylering på strålkroppen och axonal MTs men inte på stabil interphase MTs¹⁸, begränsa användbarheten av denna markör till en delmängd av stabiliserad MTs. Däremot verkar detyrosination förekomma på alla stabila MTs i zebrafiskar embryo¹⁸. Denna post-translationella modifieringen exponerar karboxi-terminal glutaminsyra α-tubulin (detyrosinated tubulin)¹⁸ och kan upptäckas med hjälp av anti-Glu-tubulin¹⁹. Även detyrosination förekommer företrädesvis på stabil MTs, indikerar experimentella bevis att denna post-translationella modifieringen är ett resultat av, snarare än en orsak till, MT stabilitet¹⁶. Ömsesidiga MT befolkningen består av dynamiska MTs, utmärks med en antikropp, anti-Tyr-tubulin, som uttryckligen erkänner den tyrosinated formen av α-tubulin¹⁹. Efter immunolabeling med dessa markörer och confocal imaging, kvantitativ analys av MTs (längd, antal och relativa överflöd) kan utföras i definierade regioner i utvecklingsländerna neuralrörsdefekter. En strömlinjeformad metod finns här för att utföra denna analys med hjälp av 3D-bildbehandling programvara. Denna metod kan tillämpas för att hantera frågor om morfogenes och inrättande eller mognaden av cell polaritet²⁰. Faktiskt, utarbetandet av polariserade matriser av stabil MTs medföljer många utvecklande händelser, inklusive ljusmätare morfogenes²¹, epithelialization av celler i utvecklingsländer neuralrörsdefekter¹⁸ och axon bildandet⁸.

Protokoll 2 beskriver en in-vivo -anpassning av en cellbiologi analysen att analysera MTs under deras församlingen fas (kärnbildning/anchorage och tillväxt)^22,23. Begynnande MTs är nucleated på centrosome och därefter förankrade subdistal bihang av mor centriol²³. En metod att analysera begynnande MT återväxt efter depolymerization beskrivs. Detta protokoll ger detaljer om nocodazole behandling till depolymerize MTs, förfarandet drog blekt och efterbehandling återhämtningsperioden. MT re-tillväxt övervakas vid regelbundna intervalls post bortspolning av immunolabeling med markörer för totala MTs (anti β-tubulin) tillsammans med markörer för centrosome (anti γ-tubulin) och nucleus (4′, 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI)), enligt de allmänna förfarandena beskrivs i protokoll 1. MT depolymerization steget i detta protokoll är viktigt eftersom det gör bedömning av de novo MT tillväxt snarare förlängning av redan existerande MTs. Denna teknik skiljer sig därför från andra offentliggjorda förfaranden att mäta MT tillväxttakter (i frånvaro av depolymerization) med hjälp av en plus spets märkaren såsom slutet bindande protein 3 smält till grönt fluorescerande protein (EB3-GFP), som visas i Tran et al., 2012¹¹. Dessutom denna analys är särskilt användbart för att analysera embryon defekt i de novo MT församling, såsom tidigare rapporterade NEDD1 mutanter som rekrytering av γ-tubulin till centrosome är nedsatt, vilket leder till ofullständig neuralrörsdefekter bildandet och neuronala defekter²⁴.