微小管 (MTs) は、ポリマーの α- および β-チューブリン線形原繊維、いくつかを組み合わせて、中空の管^1,2を形成にまとめることです。MTs は、終了プラス成長著しい中心体または他の微小管重合のセンター (脂質)³で固定終了マイナス成長が遅いとの偏波構造です。De novoMT 形成は (γ-テュルク) に複雑な γ-チューブリン環核 MT アセンブリ⁴のテンプレートを提供するによって開始されます。任意の指定されたセルに MTs の二集団区別できるそのターン以上異なるレートで。動的 MTs は、成長の段階と動的不安定⁵として知られているプロセスの収縮の間の切り替えによって、細胞環境を探る。動的 MTs とは異なり安定した MTs 非成長しているし、動的 MTs⁶より長い半減期があります。

細胞生物学の研究の十年は MT の構造と機能を研究するためのツールの高度な配列を提供、これらの細胞骨格要素に関する知識の大きいボディの結果します。例えば、MTs は確立と維持だけでなく安定動的 MTs^7,対の差動細胞内分布にも、本質的な極性に起因する細胞極性の中心的な役割を再生⁸. 対照的に、まで以下について理解される MT アーキテクチャと脊椎動物の胚などのより複雑な三次元 (3 D) 環境で機能の一部高解像度で MT 骨格のイメージングへの挑戦のため。この制限にもかかわらず gfp 発現するトランスジェニックの最近の生成は行ラベル MTs または MT マーカーの蛍光タグの一過性の発現は、MTs を受けるダイナミックな変化と自分の携帯電話の私達の理解を増加しているとゼブラフィッシュ胚の発達の役割。どちらかは、ラベル付きの⁹またはチューブリンのポリマーは、直接 MT 関連タンパク質を使用してを分類しているが直接のチューブリンの形質転換線で視覚化される MT ネットワーク全体 Doublecortin ようなキナーゼ (Dclk) または Ensconsin (EMTB)^{10、 11}。他の線 (および構造体) 生成されている MT プラス終了の具体的分類によって MT 本質的な極性の評価を有効にするまたは終了^11,12,13,マイナス中心体固定¹⁴です。 これらのツールの力を成長の有機体ライブ、MT のダイナミクスを学習する能力であります。このような研究は明らかに、たとえば、特定の細胞集団に MTs の空間と動的配布、形態形成 (細胞分裂面のインジケーター) を受けている組織で細胞分裂の方向のスピンドルは、MT ポリマーの極性細胞の伸長など、移行プロセスに関連と MT 成長率彗星速度^9,13,15によって決まります。これらのツールの制限は、彼らが容易に安定性と動的 MT 集団間に行いません。 ことです。

豊富な細胞生物学文献からの描画、反応メソッド ゼブラフィッシュ胚における安定性と動的な MTs のイメージを説明ここでは、形質転換線の使用を補完するものであります。ゼブラフィッシュのような反応方法の普及はやや固定プロシージャ中に MT の整合性を維持する難しさによって妨げられています。プロトコル 1の反応の合計、ダイナミックな最適化手法の概要を説明し、発展途上のゼブラフィッシュ脳の断面積で安定した Mt。さらに、商業的に使用する直接的な方法利用可能なソフトウェアは、これらの MT 集団を定量化に記載されます。安定した MTs は、α-チューブリンのアセチル化、detyrosination、時間^16,17をかけて安定した MTs の蓄積などのいくつかの翻訳後修飾に基づく動的 MTs と区別されます。ゼブラフィッシュの胚のアセチル化は、毛様体と軸索の MTs の安定した界面 MTs¹⁸、安定した MTs のサブセットにこのマーカーの有用性を制限することではなく、発生します。対照的に、detyrosination は、ゼブラフィッシュ胚¹⁸のすべての安定した MTs で発生するが表示されます。この翻訳後修飾は、α-チューブリン (tubulin detyrosinated)¹⁸のカルボキシ末端のグルタミン酸を公開し、抗グルタミン酸チューブリン¹⁹を使用して検出することができます。Detyrosination は、安定した MTs に優先的に発生しますが、実験的証拠は MT 安定¹⁶の原因ではなく結果、この翻訳後修飾であることを示します。、抗-Tyr-チューブリン, α-チューブリン¹⁹の tyrosinated フォームを特異的に認識する抗体を用いた動的な MTs の構成相互の MT の人口は区別されます。次のこれらのマーカーと共焦点レーザー顕微鏡の反応、MTs (長さ、番号、および相対的な豊かさ) の定量分析は成長の神経管の定義された領域で実行できます。合理化されたメソッドは、3次元画像処理ソフトウェアを使用して分析を実行するためここで提供されます。このメソッドは、形態形成や設立成熟細胞極性²⁰の質問はアドレスに適用できます。確かに、安定した MTs の偏光配列の精緻化に伴う光受容形態²¹、開発途上神経管¹⁸と軸索形成の⁸細胞の上皮化を含む多くの発達的イベント。

プロトコル 2では、そのアセンブリ フェーズ (アンカレッジ/核生成と成長)^22,23中 MTs を分析する細胞生物学試験の生体の適応について説明します。新生 MTs は中心体を核、その後母中心小体²³の subdistal 肢に固定します。次の解重合初期の MT 再生を分析する方法を説明します。このプロトコルは、MTs、薬物のウォッシュ アウト プロシージャおよび治療後の回復期間を耳下腺ノコダゾール処理に関する詳細を提供します。MT の再成長が一定間隔で監視します。合計 MTs のためのマーカーとの反応によって s post ウォッシュ アウト (抗 β-チューブリン) 中心体のマーカーと一緒に (抗 γ-チューブリン) と核 (4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI))、プロトコル 1で説明する一般的な手順によると。De novo MT の評価ではなく既存の MTs の拡張が可能、このプロトコルの MT 解重合ステップは欠かせません。この手法は結合タンパク質 3 チャンらに示すように、緑色蛍光タンパク質 (EB3 GFP) に融合エンドなどプラスのヒント マーカーを使用して、(解重合の不在) の MT の成長率を測定するためその他のパブリッシュされた手順とは異なるため2012¹¹。この試金は胚・ デ ・ ノボMT アセンブリの欠陥を分析する場合に役立ちますまた、不完全なものに終って中心体には γ-チューブリンの募集が障害者である以前に報告したNEDD1変異など神経管形成と神経欠陥²⁴。