Automatisée des protocoles de cristallisation macromoléculaire au laboratoire de biologie moléculaire MRC

1. le système 1 et plaques LMB Figure 1 a montre le système 1 basé sur un gestionnaire liquid fonctionnant avec un système de liquide (eau déminéralisée). Le liquide-système comprend un conteneur, une pompe, tuyau, 8 seringues équipées de soupapes et 8 conseils fixes. Les paramètres de la classe liquide ont été optimisées pour aspirer/dispense une vaste gamme de solutions et multi-répartir dans 4 assiettes (multi-dispense nécessite un relativement grand excès de volume aspiré). Un récipient d’eau 22 L et un plus petit récipient (5 L) avec 20 % v/v d’éthanol sont stockés sous le système pour alimenter le système de liquide. Chaque conteneur est équipé de deux inserts de couplage. Un insert (en bleu) permet d’alimenter le système avec le liquide, l’autre (rouge) est un retour pour réduire l’excès de pression. Après utilisation, rinçage à l’eau, puis la solution à 20 % v/v d’éthanol empêche la prolifération microbienne. Une unité de refroidissement (également située sous le système) est connectée à un support de tube-refroidissement sur mesure. Système 1 est 2050 mm de large, y compris le carrousel, de 760 mm de profondeur et de 88 mm de hauteur. Il faut un supplémentaire 550 mm à l’avant pour la table de travail qui contient l’unité de commande de l’imprimante à jet d’encre et le film adhésif adhésive. Un espace supplémentaire est également nécessaire à côté du système pour le contrôle de PC. Le programme pour produire 72 plaques remplies au préalable (c’est-à-dire 18 tours de 4 assiettes) prend 3 h et 50 min. Figure 1 b est un gros plan du pont principal, qui est équipé de 8 fixes conseils (Figure 1) montés sur un bras de pipetage automatisé, un second bras avec une pince, une station de lavage de pointe, porteuses de 2 x 4 broches pour plaques SBS et le support de tube de refroidissement. Le programme principal traite 4 assiettes à la fois qui sont sortis automatiquement au carrousel et placés sur le pont où ils sont remplis avec des conditions de cristallisation (80 µL dans les réservoirs, Figure 1). Niveaux de liquides sont automatiquement détectés car les pointes sont conductrices. Alors que le gestionnaire liquid distribue des conditions dans un ensemble de plaques, une autre série d’assiettes vides est souscrite au carrousel, étiquetée et placée sur le pont principal. Un petit support sur mesure et la fenêtre dans la paroi arrière du gestionnaire liquide étaient tenus pour positionner la tête de l’imprimante et son capteur à l’arrière du pont principal. Les 8 conseils sont vidées et lavées à l’eau du bac principal après chaque étape de distribution qui se compose de 4 parties aliquotes dans les colonnes correspondantes des réservoirs. Après que 4 assiettes ont été pourvus, ils sont automatiquement scellés et placés dans leur position d’origine dans le carrousel. Le film adhésif est déclenché par un pilote spécifique (appelé par le logiciel de commande). L’utilise un rouleau de ruban adhésif large de 3 pouces, qui est appliqué à une assiette avec des rouleaux sous pression mécanique. À la fin du programme, les plaques remplies au préalable sont retirés manuellement les empilements de carrousel et stockés dans un incubateur à 10 ° C situé à l’intérieur de l’installation. Figure 1 : Remplir les réservoirs avec des kits de dépistage initial. (A) vue d’ensemble du système entièrement automatisé 1. Le carrousel est une entité automatisée avec piles de plaque et il est logé dans un bien fait d’acryliques clair feuilles sur le côté droit du pont principal. (B), le pont principal du gestionnaire en exploitation avec (a) le transporteur tube-refroidissement liquid (reliés à une unité de réfrigération dessous, non illustré), (b), le jeûne station de lavage (reliée au drainage, non illustré), (c), le bras de pipetage le bras de préhension apportant une plaque remplie sur (e) le transporteur motorisé de SBS de l’adhésif de remplissage 8 réservoirs d’une plaque 96 puits cristallisation, (d). À l’arrière de la platine est tête (f) l’impression de l’imprimante à jet d’encre connecté à (g) l’unité de commande de jet d’encre sous le scelleur. (C) A marqué plaque (nom de l’écran) et la date de production étant remplis par des conditions de cristallisation par 8 conducteurs fixé les pointes en acier inoxydable enduit de polytétrafluoroéthylène. (D) coupe transversale d’une cristallisation étanche bien. Le réservoir contient 80 µL de condition de cristallisation (tandis que la partie supérieure est bien vide). Réservoir et les spécifications de la profondeur des puits supérieur sont en millimètres. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Le tableau 1 montre les différentes formulations pour les kits de dépistage disponibles dans le commerce dans des éprouvettes. Les kits sont utilisés pour remplir les réservoirs des plaques de 96 puits cristallisation (LMB01-LMB22) sur une base régulière avec le système 1. Nom de la plaque nom de la trousse fournisseur Numéro de catalogue tubes description fondamentale LMB01 Écran de cristal 1 Recherche de Hampton HR2-110 48 Sparse Matrix (pH 4,6-8,5) Écran de cristal 2 Recherche de Hampton HR2-112 48 Échantillonnage stochastique (pH 4,6-9.0) LMB02 Assistant 1 Rigaku 1009530 48 Échantillonnage stochastique (pH 4,5-10,5) Sorcier 2 Rigaku 1009531 48 Échantillonnage stochastique (pH 4,5-10,5) LMB03 Sulfate d’Ammonium de grille écran Recherche de Hampton HR2-211 24 Écran de la grille, [AmS] = 0,8 à 3,2 M et tampons pH 4,0-9.0 Grille écran PEG/LiCl Recherche de Hampton HR2-217 24 Écran de la grille, [PEG 6000] = 0-30 %p/v, conc. LiCl = 1,0 M et tampons pH 4,0-9.0 Écran rapide Recherche de Hampton HR2-221 24 Écran de la grille, [NaKPO4] = 0,8 à 1,8 M à pH 5.0-8.2 Chlorure de Sodium grille écran Recherche de Hampton HR2-219 24 Écran de la grille, [NaCl] = 1,0 à 4,0 M et tampons pH 4,0-9.0 LMB04 Grille écran PEG 6000 Recherche de Hampton HR2-213 24 Écran de la grille, [PEG 6000] = 5-30 %w/v et tampons pH 4,0-9.0 Grille écran MPD Recherche de Hampton HR2-215 24 Écran de grille MPD] = 10-65 %w/v et tampons pH 4,0-9.0 MemFac Recherche de Hampton HR2-114 48 Sparse Matrix pour les protéines de la membrane (pH 4,6-8,5) LMB05 PEG-Ion Recherche de Hampton HR2-126 48 Écran de la grille, [PEG 3350] = 20 %w/v et divers sels à 0,2 M (pas de tampons) Natrix Recherche de Hampton HR2-116 48 Factorielle incomplète (pH 5,6-8,5) LMB06 Écran de Crystal Lite Recherche de Hampton HR2-128 48 1 écran cristal avec la moitié des concentrations precipitant originales Custom Lite écran Dimensions moléculaires n/a 48 Conditions supplémentaires avec de faibles concentrations precipitant LMB07 Assistant Cryo 1 Rigaku 1009536 48 Échantillonnage stochastique avec des conditions cryoprotected à l’aide de pinces à faible MW (pH 4,5-9,4) Assistant Cryo 2 Rigaku 1009537 48 Échantillonnage stochastique avec des conditions cryoprotected à l’aide de pinces à faible MW (pH 4,5-10.1) LMB08 JBS1 JenaBioScience CS – 101L 24 Factorielle incomplète basée sur divers supports (pH 4,6-9.0) JBS2 JenaBioScience CS – 102L 24 Factorielle incomplète basée sur PEG 4000 (pH 4,6-8,5) JBS3 JenaBioScience CS – 103L 24 Factorielle incomplète basée sur PEG 4000 (pH 4,6-8,5) JBS4 JenaBioScience CS – 104L 24 Factorielle incomplète basée sur moyen MW chevilles (pH 6,5 à 8,5) LMB09 JBS5 JenaBioScience CS – 105L 24 Factorielle incomplète basée sur lourdes chevilles MW (pH 6,5 à 9,5) JBS6 JenaBioScience CS – 106L 24 Factorielle incomplète basée sur AmS (pH 4,6-8,5) JBS7 JenaBioScience CS – 107L 24 Factorielle incomplète basée sur MPD (pH 4,6-8,5) JBS8 JenaBioScience CS – 108L 24 Factorielle incomplète basée sur MPD et éthanol (pH 4,6-8,5) LMB10 JBS9 JenaBioScience CS – 109L 24 Factorielle incomplète basée sur les sels de common et propanol-2 (pH 4,6-8,5) JBS10 JenaBioScience CS – 110L 24 Factorielle incomplète basée sur common sels (pH 4,6-8,5) Désactivez la stratégie écran 1 pH 4.5 Dimensions moléculaires MD1-16LMB 24 Écran de grille avec des pinces à divers Désactivez la stratégie écran 1 pH 5.5 Dimensions moléculaires MD1-16LMB 24 Écran de grille avec des pinces à divers LMB11 Désactivez la stratégie écran 1 pH 6,5 Dimensions moléculaires MD1-16LMB 24 Écran de grille avec des pinces à divers Désactivez la stratégie écran 1 pH 7.5 Dimensions moléculaires MD1-16LMB 24 Écran de grille avec des pinces à divers Désactivez la stratégie écran 1 pH 8,5 Dimensions moléculaires MD1-16LMB 24 Écran de grille avec des pinces à divers Désactivez la stratégie écran 2 pH 4.5 Dimensions moléculaires MD1-16LMB 24 Écran de grille avec des pinces à divers LMB12 Désactivez la stratégie écran 2 pH 5.5 Dimensions moléculaires MD1-16LMB 24 Écran de grille avec des pinces à divers Désactivez la stratégie écran 2 pH 6,5 Dimensions moléculaires MD1-16LMB 24 Écran de grille avec des pinces à divers Désactivez la stratégie écran 2 pH 7.5 Dimensions moléculaires MD1-16LMB 24 Écran de grille avec des pinces à divers Désactivez la stratégie écran 2 pH 8,5 Dimensions moléculaires MD1-16LMB 24 Écran de grille avec des pinces à divers LMB13 Index Recherche de Hampton HR2-144 96 Petits écrans sparse matrix et grille (pH 3.0-9.0) LMB14 SaltRX 1 Recherche de Hampton HR2-107 48 Écran de grille dont 22 unique des sels par rapport à la concentration en sel et pH (4.1 à 9,0) SaltRX 2 Recherche de Hampton HR2-109 48 Écran de grille dont 22 unique des sels par rapport à la concentration en sel et pH (4.1 à 9,0) LMB15 MemStart Dimensions moléculaires MD1-21 48 Matrices creuses pour les protéines de la membrane (pH 4,0 et 10,0) MemSys Dimensions moléculaires MD1-25 48 Écran de la grille pour les protéines de la membrane (pour la plupart, les chevilles, les pH 3.5-9,5) LMB16 JCSG + QIAGEN 130720 96 Sparse Matrix (pH 4,0 et 10,0) LMB17 Écran de MORPHEUS Dimensions moléculaires MD1-46 96 Écran de grille, y compris les mélanges d’additifs et de conditions de cryoprotected (pH 6,5 à 8,5) LMB18 Écran un minimum de pi JenaBioScience CS-127 96 Factorielle incomplète (pH 4,0-9,5) LMB19 Écran de pi-PEG JenaBioScience CS-128 96 Factorielle incomplète des protéines membranaires (pH 4,8-8,8) LMB20 Écran de MORPHEUS II Dimensions moléculaires MD1-91 96 Écran de grille, y compris les mélanges d’additifs (atomes lourds) et les conditions de cryoprotected (pH 6,5 à 8,5) LMB21 Écran de cristallisation LMB Dimensions moléculaires MD1-98 96 Matrices creuses y compris conditions sélectionnées parmi les publications de la LMB LMB22 Écran de MORPHEUS III Dimensions moléculaires n/a 96 Écran de grille, y compris les mélanges d’additifs (composés médicamenteux) et cryoprotected conditions (pH 6,5 à 8,5) Tableau 1 : Formulations des kits trouvés en plaques LMB. Chaque kit de projection se compose de 24/48/96 conditions initialement dans des éprouvettes. Les plaques LMB sont stockés dans des incubateurs de 10 ° C situés à l’intérieur de l’établissement où ils sont accessibles aux utilisateurs à tout moment. 2. système 2 et les exigences pour la mise en place des gouttelettes Figure 2 a montre le système 2 basé sur un gestionnaire liquide19 fonctionnant avec déplacement positif et des embouts jetables. Les embouts jetables sont fournis dans des paniers empilables adaptés à une manutention automatisée. Un pont de 3 positions nanolitres distributeur20 a été intégré sur le côté droit du système. Aspiration/distribuer sur la distributeur nanolitres fonctionne aussi avec déplacement positif, à l’aide de microseringues jetables (fourni en grandes bobines). Comme un robot autonome, un bloc de bande emportable est utilisé pour charger des échantillons de protéines. Pour le processus entièrement automatisé, une plaque PCR 384 puits remplace le titulaire de la bande. Un même film adhésif adhésive au système 1 a été intégré sur le côté gauche. Le scellant et le distributeur nanolitres debout sur des tables de travail sur mesure, surélevées afin que la pince principale atteindre les transporteurs plaque de ces deux robots intégrés (une fenêtre a dû être coupé dans les deux panneaux latéraux du gestionnaire liquid pour la pince accéder à l’extérieur le pont principal). Le programme principal appelle les pilotes spécifiques à gâchette nanolitres distribution programmes et le scellant en bonne heure. Le système 2 est de 2 850 mm de large, profondeur 800 mm et 800 mm de hauteur. Un espace supplémentaire est nécessaire à côté du robot pour l’affichage de l’ordinateur de contrôle. Deux poubelles sont situées sous le système de conseils et de microseringues rejetées au cours du processus (le PC de contrôle est également stocké sous). Une caractéristique importante du système 2 est la mise en page globale, qui conserve un accès facile aux trois robots afin qu’ils peuvent être utilisés individuellement pour les protocoles d’optimisation décrites précédemment, ou autres protocoles décrits ailleurs comme la cristallisation des protéines de la membrane lipidique mésophases21 et matrice aléatoire microseed dépistage22. Figure 2 b est un gros plan sur le pont qui est équipé d’un bras robotisé unique. Le bras intègre 12 sondes indépendantes de pipetage et la pince principale. Les positions des sondes peuvent être contrôlées individuellement dans une seule direction afin d’accéder à différents endroits le long de l’axe entre les sondes ou même de simples tubes. Les sondes peuvent ramasser des embouts jetables (1-12) ou une paire de plaque de terrassement adaptateurs. Deux jeux de 4 piles contenant 50 embouts jetables µL est chargées au départ. Niveaux de liquides sont automatiquement détectés car les pointes sont conductrices. Les adaptateurs de plaque de terrassement sont conçus avec 2 broches tranchants à l’intérieur qui forment une pince facultatif lorsque nécessaire. Sur le pont principal est situé un microtube 24 positions, support pour l’échantillon, de refroidissement, bien que seulement 1-2 positions sont utilisées ici. En outre, il y a un support pour la plaque PCR et également 2 porteurs de rangement pour couvercles SBS empilables, sur mesure (Figure 2). Enfin, il y a 4 supports coulissants, chacune avec 5 emplacements pour les plaques de cristallisation (4 x 5 = 20 plaques). Figure 2 : Mise en place des gouttelettes pour expériences de diffusion de vapeur. (A) vue d’ensemble du système entièrement automatisé 2. (B), le pont principal du gestionnaire liquid en opération avec (a) le stockage des transporteurs pour les cheminées de couvercles SBS, (b) l’empilable conseils, transporteur (c) le refroidissement-transporteur auprès d’un échantillon en microtube, (d) pour les 2 plaque de terrassement adaptateurs, (e), la plaque de la PCR pour le transfert de plaques de protéine pour le robot de manutention nanolitre, (f) 9 scellé qui ont été placées dans leur position initiale, (g) la pince en option retrait du couvercle SBS de la 10ème plaque tout pour être transporté sur le pont du gestionnaire liquid, (h) la prochaine 10 plaques à préparer avec des couvercles SBS sur le dessus, (i) la pince principale qui est utilisée pour transporter les plaques PCR et cristallisation, (j) le principal automatisé bras intégrant 12 sondes de pipetage (2 utilisé pour servir de pince en option) et la pince principal et (k) le pont du distributeur nanolitre. (C) couvercles SBS personnalisés interne en aluminium. Les couvercles d’intégrer une feuille de caoutchouc pour éviter l’évaporation des conditions et deux petits trous pour être exactement ramassés par la pince en option. (D) coupe transversale d’une cristallisation étanche bien où le réservoir est rempli avec une condition et le puits supérieur contient une gouttelette composé de l’échantillon de protéine et de la condition. Parce que le précipitant dans la goutte est moins concentré que dans l’État, les concentrations de tous les composants dans le menu déroulant remontent dans l’eau perte durant le processus d’équilibration par diffusion de la vapeur (très schématiquement représentée par une flèche). (E) micrographes de 100 nL et (F), 200 gouttelettes nL produites par le distributeur nanolitre avec une solution d’essai (20 % v/v polyéthylèneglycol 400, 0,001 % p/v safranine comme colorant rouge). La taille et la forme des gouttes peuvent varier selon physicochimique de la condition. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Le programme principal commence avec la pince en option retrait du couvercle de la SBS de la première plaque de cristallisation. Après que le couvercle a été transféré au transporteur de stockage correspondantes, la plaque de cristallisation est transportée sur le pont du distributeur nanolitre. Le bras de pipetage transfère ensuite la quantité d’échantillon nécessaire pour mettre en place des gouttelettes de microtube normalement réfrigéré à la première colonne de la plaque PCR. Par la suite, la pince principale déplace la plaque PCR sur le pont du distributeur nanolitres qui préparera les gouttelettes suivant les options choisies par l’utilisateur au début (e.g. taille des gouttelettes). Pour ce faire, l’échantillon de protéine est tout d’abord dispensé dans les supérieur-puits (à l’aide d’un seul ensemble de 8 microseringues et multi-distribution), puis les conditions de cristallisation sont distribuées sur les gouttelettes de protéine (chaque ligne requiert maintenant 8 microseringues de nouveau afin d’éviter contamination croisée). Après avoir terminé le programme à mettre en place des gouttelettes, la pince principale transporte la plaque correspondante à l’adhésif, puis place la plaque PCR dans sa position d’origine (plus de protéines sera distribué dans la colonne suivante de la plaque PCR pour cette plaquette ). Enfin, la plaque scellée de cristallisation est déplacée vers sa position d’origine sur le pont : expériences de diffusion de vapeur ont déjà commencé dans cette plaque (Figure 2D). Ce cycle se répète selon le nombre d’assiettes. Lorsque nécessaire, la pince en option supprime un rack vide Astuce permettant le bras de pipetage accéder à plus de conseils. Le programme prend 2 heures et 20 min et 440 µL de l’échantillon pour préparer des gouttelettes unique à 20 plaques à l’aide de 100 nL échantillon + 100 condition nL (Figure 2E et 2F). Lorsque vous utilisez le distributeur nanolitres comme stand-alone robot pour deux plaques supplémentaires (voir le protocole, étape 1.2.3), l’ensemble des plaques de présélection disponibles dans un incubateur à 10 ° C peut être mis en place (22 conditions de plaques x 96 LMB = 2 112 conditions). Le tableau 2 montre les exigences pour le programme principal selon la sélection de l’utilisateur sur le système 2. Plaques Taille des gouttes (nL) Ou les échantillons Exigences de pointe Durée Nombre Type de Vol. 1 (µL) Vol. 2 (µL) 50 embouts µL Microseringues 10 96 puits 100 240 0 80 1040 1 h 12 min 20 96 puits 100 440 0 160 2080 2 h 20 min 10 96 puits 100 240 240 160 2080 1 h 45 min 20 96 puits 100 440 440 320 4160 3 h 05 min 10 48-puits 1000 624 0 80 560 1 h 10 min 20 48-puits 1000 1208 0 160 1120 2 h 16 min Tableau 2 : exemples des options de programme principal disponibles sur le système 2 pour mettre en place des gouttelettes de cristallisation. La quantité d’échantillon de protéine, des conseils et des microseringues nécessaire varient selon le programme. Les volumes d’échantillon “vol. 1′ (1 goutte) et ‘ vol. 2’ (drop 2) sont calculées comme suit : (8 conseils x requis perte de volume / puits de la plaque PCR + 4 µL volume) x nombre de plaques de cristallisation + volume mort de 40 µL dans microtube. Le volume requis / puits de la plaque de PCR pour 100 gouttes de nL en plaque 96 puits cristallisation est 2 µL, tandis que 6,8 µL est requis pour 1 000 gouttelettes nL dans une plaque de 48 puits (volume mort dans le puits de la plaque PCR : 0,8 µL). Un volume supplémentaire d’échantillon est tirée en considération (« volume perdu ») due à l’évaporation le microtube et autres pertes (par exemple l’échantillon coller sur conseils). Par exemple, pour 20 plaques de MRC, 100 nL, 1 goutte protocole, le volume d’échantillon requis est : (8 x 2 + 4) x 20 + 40 = 440 µL (c’est-à-dire, l’équivalent de 22 µL par plaque). Huit pointes µL 50 jetables sont nécessaires pour chaque plaque et chaque échantillon. Par exemple, pour 10 plaques, protocole 2-baisse, le nombre de conseils requis est de 8 x 10 x 2 = 160 conseils. Le nombre de microseringues est calculé comme suit : (8 + certaines conditions par plaque) x nombre d’échantillons x nombre de plaques. Par exemple, pour plaques à puits 10 x 48, le nombre de conseils de gestionnaire liquide requis est : (8 + 48) x 1 x 10 = 560 conseils. 3. formuler, de préparation et de manipulation des solutions 4-coin Les deux formulations des solutions de 4 angle (« A, B, C et D ») et l’écran d’optimisation correspondante (Figure 3 a) sont générées automatiquement par une feuille de calcul Excel. Il y a des feuilles de calcul différentes à différents nombres de conditions — essentiellement de 24, 48 et 96 conditions — et aussi des feuilles de calcul pour préparer deux écrans optimisation différentes en une seule plaque. En général, on prépare un ensemble de 4 x 10 mL des solutions d’angle dans des éprouvettes de 2 – 3 écrans d’optimisation qui peuvent être préparés, selon le nombre et le volume des conditions requises. Les solutions sont versées dans les auges, d’où ils sont aspirés par un gestionnaire liquid axée sur la seringue et plus tard distribués directement dans les plaques (Figure 3 b). Les deux gradients linéaires des concentrations résultent du mélange A, B, C et D à systématiquement divers ratios (Figure 3). Figure 3 : la méthode 4-coin pour la préparation des écrans optimisation. (A) représentation des deux gradients de concentrations à travers une présentation de la plaque à 96 puits. (B) le gestionnaire liquid axée sur la seringue prêt à préparer un écran avec 4 seringues insérés dans la tête du robot. Une plaque de cristallisation se trouve dans le transporteur motorisé de la SBS et le 4 à partir de solutions (A, B, C et D) ont déjà été distribués dans leurs creux respectifs (les solutions ont été couleur rouge uniquement à des fins de démonstration). (C) les rapports des solutions A, B, C et D 96 réservoirs. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Le tableau 3 montre les conditions requises pour les programmes disponibles aux utilisateurs sur le liquide-gestionnaire axée sur la seringue. Type de plaque Lol des conditions Vol. en plaque (réservoirs, µL) Vol. en creux (mL) Durée 96 puits 48 80 1.6 2 min 5 s 96 puits 96 80 2.5 3 min 50 sec 96 puits 2 x 48 80 1.6 2 min 50 s 48-puits 24 200 1.8 2 min 25 sec 48-puits 48 200 3 4 min 20 sec Tableau 3 : programmes disponibles sur le gestionnaire liquid axée sur la seringue pour la préparation des écrans optimisation selon la méthode des 4 coins. La plaque à 96 puits peut être utilisée pour préparer l’écran optimisation 96 – 48-État (lorsque deux écrans de 48-condition sont préparés en même temps, le robot doit être équipé 8 seringues et 8 creux). Autres programmes permettent d’utiliser des plaques de 48 puits. Les volumes répertoriés dans des caniveaux comprennent le volume mort requis (0,5 mL). 4. l’additif dépistage La figure 4 montre les étapes à effectuer un dépistage additif commençant soit avec 96 solutions additives déjà dans les réservoirs de la plaque de cristallisation (protocole 1) ou dans les puits d’un profil bas plaque de culture cellulaire utilisé comme un écran additif réutilisables ( Protocole 2). Le tableau 4 énumère les programmes disponibles sur la distributeur nanolitres selon les deux types de protocoles. Figure 4 : les deux types de protocoles pour le dépistage de l’additif. Les écrans de 96-additif sont stockés à-20 ° C. Suite de protocole 1, l’écran additif est ajouté au départ dans les réservoirs des plaques cristallisation (et idéalement stocké de cette façon). Un gestionnaire liquide ou l’échantillon est utilisé pour distribuer la condition dans les réservoirs contenant les solutions additives (le volume d’écran additif représente 10 % du volume final dans les réservoirs : 8 µL volume final de 80 µL). Après avoir mélangé les conditions sur une table de mixage de microplaque (non illustré), le distributeur axée sur la microseringue nanolitres sert à mettre en place les gouttelettes (tableau 4). À la suite de protocole 2, l’écran additif est ajouté seulement plus tard tout en créant les gouttelettes de cristallisation. Cette fois-ci le distributeur nanolitre est employé pour préparer des gouttelettes avec un composant supplémentaire sur le pont (la plaque de culture cellulaire réutilisable contenant l’additif écran). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Protocole Taille des gouttes (nL) Type de bande Échantillon vol. (µL) Lol des microseringues Durée Type de Source d’additifs Protéine Condition Additif Dans chaque cupule (bande) Total 1 plaque 96 puits cristallisation 100 100 0 2 ΜL 2 16 104 2 min 1 plaque 96 puits cristallisation 200 200 0 5 ΜL 3.8 31 104 2min 10sec 2 plaque de culture cellulaire de 96 puits 200 200 100 5 ΜL 3.8 31 200 3min 45 sec 2 plaque de culture cellulaire de 96 puits 500 500 100 5 ΜL 7.4 60 200 4min 15 sec Tableau 4 : programmes disponibles sur la distributeur nanolitres axée sur la microseringue pour le dépistage de l’additif. Le volume requis de l’échantillon dans chaque puits de la bande de 8 puits est calculé comme suit : volume mort + 12 x drop taille. Il existe 2 types de bandes (2 µL et 5 µL). Les volumes morts sont µL 0,8 pour les 2 puits µL (qui peut en fait contenir 3,2 µL max.) et 1,4 µL pour 5 puits µL (7,5 µL max.). Le volume total de protéine nécessaire : 8 x volume en puits de la bande (valeur de rafles). Le volume mort des puits de la plaque de culture cellulaire de 96 puits en forme de V est 2,5 µL. Le nombre requis de microseringues varie en fonction du programme sélectionné (8 + 96 = 104 ; ou 8 + 2 x 96 = 200). En raison de la dilution de l’état avec l’additif au protocole n° 1, la condition doit être préparé à une concentration proportionnellement supérieure au départ. L’augmentation de la concentration finale est plus facilement atteint en réduisant l’addition finale de l’eau au volume final calculé. Après cela, on simplement part avec le jeu normal vers le haut des gouttelettes qui se mélangent la condition et l’échantillon (par exemple, 100 nL protéine + 100 condition nL déjà mélangée avec des additifs). Protocole 2 (par exemple, 200 nL protéine + condition de nL 200 + 100 additif nL) facilite la projection à différentes concentrations d’additifs en faisant simplement varier le volume d’écran additif ajouté. Protocole 2 implique plus ou moins de dilution des gouttelettes (ce qui peut altérer la cristallisation). Le gestionnaire liquid du système 2 peut être utilisé pour aspirer suffisamment condition dans 12 conseils et diluer 8 aliquotes dans les réservoirs d’une plaque de 96 puits (voir le protocole, étape 2.2.2), bien que cette étape peut bien sûr se faire manuellement avec une pipette multicanaux ( Figure 4). Plusieurs planches peuvent être remplis à la fois avec le même État lorsque vous utilisez le gestionnaire de liquid (pour tester différents écrans additifs plus tard). Lors de la préparation 2 assiettes, remplir le réservoir de réactif d’au moins 23 mL. Lors de la préparation à 3 plateaux, remplissez le réservoir de réactif avec au moins 31 mL. 5. plaques de cristallisation et dispositifs associés La conception des deux plaques de cristallisation de diffusion MRC séance-goutte vapor (96 puits 2-déplacer 48 puits 1-déposer, Figure 5 a et 5 b Figure) fournit des caractéristiques qui permettent des expériences de cristallisation automatique fiable et efficace, avec notamment la forme sphérique des haute-puits et une légère forme en V des réservoirs qui facilitent la distribution précise et aussi centrifugation lorsque des gouttelettes de centrage est nécessaire. En outre, les haut-puits ont un effet de lentille pour un éclairage optimal sous un stéréomicroscope (le polymère est transmissible pour la détection des cristaux absorbeurs UV ou fluorescents23UV). Un sceau personnalisé (Figure 5) permet la mise en place de pendaison des expériences de cristallisation baisse dans les deux types de plaques avec un distributeur nanolitres (protocoles non illustrés). Enfin, les deux plaques MRC ont les mêmes dimensions extérieures et la jante. La jante s’insère dans les rainures de notre support de plaque sur mesure (Figure 5), qui est utilisé pour placer/suppression manuelle ruban d’étanchéité sans éclaboussures de liquides. Figure 5 : plaques de cristallisation de la MRC et dispositifs associés mis au point à la LMB. (A) A1-coin de la plaque à 96 puits. Le réservoir (oblong) est sur le côté gauche de l’évidement de la cristallisation, les deux haut-puits sphériques sur la droite. Les dimensions sont en millimètres. (B) A1-coin de la plaque 48 puits. Le réservoir est sur le côté droit du puits (1 grand haut-puits seulement). Joint suspendu (C), à la MRC. (D), à la plaque personnalisée interne titulaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 6. cristaux de protéine La figure 6 montre des exemples d’utiles cristaux obtenus avec nos protocoles automatisés. Figure 6 : allumer les micrographies de gouttelettes contenant des cristaux obtenus en suivant les protocoles automatisés. (A, B) Cristaux de dépistage initial du FPMO et MreB dans des plats préparés avec les 2 complètement des systèmes automatisés (voir protocole points 1.1 et 1.2, conditions : A4 bien LMB07 et LMB20 bien D12, respectivement, la taille des gouttelettes est 100 protéines nL + 100 nL condition, travail de Andrzej Szewczak, LMB)24. (C, D) Barre de cristaux de domaine avant et après l’optimisation des conditions initiales avec la méthode 4-coin (étape 2.1, LMB02 B6, 1 000 nL + 1 000 nL, œuvre de Leonardo Almeida-Souza, LMB inédite). (E, F) La chaîne lourde de cristaux de domaine N-terminal dynéine humaine 1 avant et après l’optimisation des conditions initiales avec la méthode 4-corner (LMB20 E6, 200 nL + 200 nL, puis 500 nL + 500 nL, œuvre de Edgar Morales-Ríos, LMB inédite). (G, H) Compléter les cristaux facteur D avant et après l’optimisation de la condition avec projection additive (étape 2.2, la condition initiale d’interne écran personnalisé, 200 nL + 200 nL, additif D6 dans l’écran additif 96-condition, œuvre de Matthias Bauer, inédite LMB). (I, J) Cristaux de25 glycoprotéine enveloppe virale avant et après l’optimisation de la condition avec projection additive (étape 2.3, LMB20 A2, 150 nL + 150 nL, puis 200 nL + 200nL + additif de nL 100 E5 depuis l’écran d’additif 96-condition, œuvre de Yorgo inédite MODIS, Université de Cambridge, Royaume-Uni). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.