JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

MRC Laboratuvarı moleküler biyolojinin makromoleküllerin kristalizasyon için protokolleri otomatik

Published: January 24, 2018
doi:
10.3791/55790
,
1Laboratory of Molecular Biology,Medical Research Council

Summary

Otomatik sistemler ve ekranlar çok sayıda rutin hazırlanması için protokoller ve nanoliter kristalizasyon damlacıkları buharı difüzyon deneyler için açıklanan ve tartışıldı.

Abstract

Yüksek kaliteli kristaller bu röntgen diffract elde edilen zaman kristal yapısı, atom çözünürlük çözülmüş. Proteinler, DNA’lar, RNA’ların ve kendi kompleksleri kristalize koşullar ancak değil olabilir tahmin. Koşulları geniş bir istihdam kalite kırınım kristalleri verimini artırmak için bir yoldur. İki tam otomatik sistemleri, moleküler kristalizasyon tarama 1920 başlangıç koşullarını karşı kolaylaştıran Biyoloji laboratuarında (Cambridge, İngiltere, MRC-LMB) nanoliter damlacıkları buharı difüzyon tarafından geliştirilmiştir. Yarı otomatik iletişim kuralları da reaktifler, pH, konsantrasyonları değiştirerek veya potansiyel olarak elde edilen kristalleri özelliklerini geliştirmek katkı maddeleri tanıtımı koşulları optimize etmek için geliştirilmiştir. Karşılık gelen tüm iletişim kuralları ayrıntılı olarak açıklanan ve kısaca tartışıldı. Birlikte ele alındığında, onlar onların deneyler anahtar parametreleri üzerinde kontrol kullanıcılar verirken uygun ve yüksek verimli makromoleküllerin kristalizasyon bir çok kullanıcılı tesisi sağlar.

Introduction

X-ışını kristalografisi yoğun daha fazla biyolojik ve hastalık mekanizmaları atomik düzeyde bizim anlayışı ilerletmek için ve daha sonra ilaç keşif1akılcı yaklaşımlar yardımcı olmak için uygulanır. Bunun için saflaştırılmış ve konsantre (2-50 mg/mL) makromoleküllerin protein, DNA, RNA, diğer ligandlar ve kendi kompleksleri örneklerdir yargılandın kristalizasyon2,3 boyutlu duvarlar, Korkuluk onların eğilimi formu için sipariş için ,4. Yüksek kaliteli kristaller bu röntgen diffract elde edilen zaman kristal yapısı, atom çözünürlük5,6çözülmüş. En önemlisi, bir roman örnek kristalize koşulları bilinemez ve genellikle çok düşük kaliteli kristaller verimidir. İlgi birçok örnekleri onları kararsız kristalizasyon (genellikle bir kaç gün) için karşılık gelen zaman ölçeğini yapmak zor biyokimyasal özellikleri vardır bir temel nedenidir. Son olarak, işlem örnekleri ve örnek çeşitleri üretmek ve onların arıtma ve kristalizasyon7,8en iyi duruma getirmek için gereken süreyi tarafından bileşik olduğunu.

Kristalizasyon durumu örnek çözünürlük azaltır bir precipitant ile bir çözümdür ve koşullar kez de arabellekleri ve katkı maddeleri içerir. Böyle reaktifler yüzlerce gibi onlar örnek bütünlüğünü (örneğin, protein veya nükleik asit unfolding) müdahale eğilimi düşük kristalizasyon deneyler parametrelerini değiştirmek için uygundur. Kristalizasyon reaktifler kombinasyonları milyonlarca test mümkün olmasa da, birçok tarama kitleri – çeşitli stratejileri9ile formüle için birkaç test,10 – Mini denemeler ve otomatik protokolleri ile mümkün. Bu açıdan en mükellef muhtemelen buharı difüzyon ile 100-200 nL damlacıkları küçük oldukça özel kristalizasyon tabak11 ‘ uygulanan kristalizasyon koşulu (25-250 µL) içeren bir rezervuar üzerinde oturan bir tekniktir , 12. protein örnek ve koşul kez 200 toplam hacmi için 1:1 oranında birleştirilir üst-Wells damlacıkları ayarlarken nL. Robot nanoliter protein kristalizasyon alternatif teknikleri ve levha altında petrol toplu13 ve Lipidic üçüncü aşama14 (özellikle olan trans-membran proteinlerinin uygulanan en son bir gibi uygulanabilir çok kötü çözünür su).

MRC LMB kristalizasyon tesisinde erken 2000’li yıllarda başladı ve otomatik protokolümüze erken bir özetini 200515dakika içinde sunuldu. Protein kristalizasyon tarihsel bir giriş sunuldu ve ayrıca robot nanoliter avantajları bir taslağını yaklaşım (sonra yeni bir yaklaşımın rutin deneyler için). Beri makromoleküllerin kristalizasyon aslında bir Stokastik süreç (uygun) başlangıç koşullarını geniş bir istihdam çok az veya hiç yararlı önceki bilgilerle artırmak verim kalitesi kırınım kristalleri16. Ayrıca, örnekleri ve birçok durumda kristalleri duruma getirilmesi ihtiyacını önemli ölçüde azaltmak için büyük bir başlangıç ekranı genellikle gözden kaçan bir avantajı olduğunu. Tabii ki, bir-ebilmek hareketsiz lüzum-optimizasyon bazı başlangıç koşullarını ile daha sonra devam etmek. Genellikle, reaktifler ve pH konsantrasyon sonra sistematik olarak incelenmiştir. Daha fazla reaktifler da daha fazla kristalizasyon parametrelerini değiştirmek için en iyi duruma getirilmiş koşulları tanıttı olabilir. Kesinlikle, bir taze hazırlanmış bir örnek ile kristalizasyon denemeniz gerekir, bu nedenle ilgili iletişim kuralları her zaman basit ve kullanılabilir olmalıdır.

Burada, iki MRC-LMB (sistemleri 1 ve 2) tasarlanmış sistemleri otomatiğe ve ilgili protokolleri tam olarak açıklanmıştır. Bu iki sistem ana uygulama tarafından açılan kristalizasyon plakaları defada buharı difüzyon eleme ilk. Sistem 1 sıvı bir işleyici, hisse senedi plakaları için otomatik bir carousel, plaka etiketleme için bir mürekkep püskürtmeli yazıcı ve bir yapışkan plaka mühürleyen entegre. Sistemdeki 1, 72 96-şey plakaları piyasada bulunan tarama kitleri (80 µL koşulun rezervuar için test tüpleri 10 mL başlangıç hacmi transfer) ile dolu, etiketli ve mühürlü. Plakayı daha sonra nerede onlar her zaman (‘LMB plakaları’ adı verilen ilk) kullanıcılarının ekranlardır 10 ° C kuluçka saklanır.

Sistem 2 sıvı işleyicisi, bir nanoliter pınarı ve bir yapışkan plaka mühürleyen entegre. Sistem üzerinde 2, damlacıkları (100-1000 nL) buharı difüzyon deneyler için oturma koşullarını birleştirme tarafından üretilen ve örnek üst-Wells 20 48 veya 96 iyi plakaların ön koşulları ile dolu. Bu 1920 başlangıç tarama koşulları 20 LMB plaka sistemi 2 kullanırken yargılandın olduðu anlamýna gelir.

Robotlar da tek tek Seçilen koşulları optimizasyonu için kullanılır ve karşılık gelen yarı otomatik iletişim kuralları da açıklanmıştır. 4-köşe yöntemi17 düzenli olarak en iyi duruma getirme ekranlar üretmek için istihdam edilmektedir. İlgili iletişim kuralı ilk 4 Çözümleri (‘A, B, C ve D’) el ile hazırlanması gerekir. Konsantrasyonları (iki ana kristalizasyon aracıları için) iki doğrusal degradeleri doğrudan kristalizasyon plaka rezervuar otomatik olarak oluşturulur. Bunun için farklı oranlar 4 köşe Solutions’da şırınga bağlı sıvı işleyici dağıtır.

Daha fazla koşul en iyi duruma getirmek için potansiyel olarak elde edilen kristalleri18özelliklerini geliştirmek katkı ekranlar istihdam edebilirsiniz. Katkı tarama için iki yaklaşım vardır: damlacıkları (Protokolü 1) ayarlamadan önce kristalizasyon plakaları rezervuar reçete katkı maddeleri ile başlayan bir protokol ve başka bir protokol nerede katkı ekran reçete doğrudan damlacıkları (2 iletişim kuralı).

MRC-otomatik makromoleküllerin kristalizasyon kolaylaştırmak için LMB başlatılan diğer yararlı gelişmeler de sunulmaktadır. Esasen, kristalizasyon plakaları ve ilişkili aygıtları gibi bir stackable toplum, biyomoleküler eleme (SBS) bu kapak en aza indirir buharlaşma koşullardan sistemi 2 kullanırken.

Kısalık için bu kullanıcıların temel işlevleri ve bakım nanoliter dağıtıcısı, mürekkep püskürtmeli yazıcı ve yapışkan plaka mühürleyen ile aşina olduğu varsayılır. Aksi belirtilmediği sürece, tabaklar robotlar güvertede konumlandırılmış öyle ki iyi A1 (‘A1-köşe’) bir levha taşıyıcı arka sol köşesine doğru olduğunu.

Protocol

1. iki tam otomatik sistemleri (başlangıç tarama) Sistem 1: 72 96-şey kristalizasyon plakaların hazırlık setleri (LMB plakaları) eleme ile dolu Yordamı gerçekleştirmeden önce sistemin robotlar başlatılır ve kendi kontrol eden yazılım açık olduğundan emin olun. Tüp soğutma taşıyıcı soğutucu üzerinde yaklaşık 30 dakika ana program başlamadan açın. Bir testi plaka plaka mühürleyen motorlu SBS taşıyıcı yerleştirin. Plaka mühürleyen çalıştırın ve film düzgün uygulandığını onaylayın. Plaka mühürleyen hazır olduğunu doğrulamak için bu testi iki kez daha tekrarlayın. Daha sonra 20 litre deiyonize su sıvı işleyicisi ana konteyner için ekleyin. Kaplin ekler küçük kapsayıcıdan (% 20 etanol durulama çözüm) kesmek ve ekler için ana kapsayıcı bağlanın. Uygun ekran adını (Tablo 1) mürekkep püskürtmeli yazıcı dokunmatik ekranda girin. O zaman, açın ve carousel döndürmeyi tetiklemek için carousel kapıyı kapat. Kapıyı açık ne zaman ilk yığın kendini göstermektedir. Tam 22 kristalizasyon levha, her biri 1 sütun bakan ilk yığınıyla yük dışarı. Tam olarak aynı şekilde sonraki iki yığınları yükleyin. Kalan 6 plakaları dördüncü yığın en yüksek konumlarda yükleyin. O zaman, atlıkarınca kapıyı kapat. Chiller görüntü 14 ° C. bulunduğunu doğrulayın Yavaşça ve sürekli olarak seçilen tarama kitleri için 1 dakika tersine çevirin. Sonra ön panelindeki sıvı işleyicisi açın. Tüpler açın ve standart 96-şey düzen (A1, A2, vb) göre soğutma taşıyıcıya yerleştirin. Her tüpün içinde taşıyıcı üzerine yerleştirerek, kapağı aynı 96-şey düzen bir tepsiye yerleştirin. Çapraz kontrol tüp konumlandırır ve tüm tüpler düzeyi ve taşıyıcı olarak yerleşmiş emin olun. Sonra ön paneli kapatın. ‘Başlangıç’ penceresinde sıvı işleyicisi yazılım ‘Çalıştır bakım’ seçin ve reçeteye göre sarf programı açın. % 20 etanol sistemden temizlemek için ve sıvı dağıtımı ipuçları outsides yıkamak için çalıştırın. Kızarma tamamlandığında, ” Başlangıç’ dönmek için İptal’ i tıklatın. ‘Varolan bir işlemi çalıştırmak’ seçip ‘seçiminizi Başlat’ düğmesini tıklatın. ‘MRC seti dağıtımı’ programını açın. ‘Örnekleri’ yapılandırma ekran ve programı çalıştırmak için ’18’ doldurun. İlk dört tabak etiketli, dolu mühürlü ve sistem izlemeniz. Bir kez tüm 72 plakaları hazırlanan ve carousel geri yerleştirilir, kaplin ekler ana kapsayıcıdan küçük kapsayıcıya geçin. ‘Kadar floş Başlat’ programını çalıştırın (bkz. Adım 1.1.10). Chiller açmak ve boş atmak kiti tüpler eleme. Dikkatli bir şekilde 72 hazırlanan tabak atlıkarınca çıkarın. Yanlış dolu veya kötü mühürlü plakalar atmak. Kullanıma hazır plakaları 10 ° C’de depolayın Sistem 2: 20 LMB tabak içinde tek bir örnekten kristalizasyon damlacıkları kadar (100 nL protein + 100 nL condition) ayarlama İlk olarak, sistemin robotlardır yazılımının açık nanoliter dağıtıcısı başlatılır ve sıvı işleyicinin yöntemi Yöneticisi açık olduğundan emin olun. Microtube soğutma taşıyıcı ana program başlamadan 15 dakika kadar çevirin. Bir testi plaka plaka mühürleyen motorlu SBS taşıyıcı yerleştirin. Plaka mühürleyen çalıştırın ve plaka düzgün mühürlü doğrulayın. Plaka mühürleyen test üç kere. Daha sonra test çözüm damlacıkları 100-nL bir testi plaka ayarlamak için nanoliter dağıtıcı çalıştırın. Mikroskop altında damlacıkları doğru şekilde ayarlandığını denetleyin. Nanoliter dağıtıcı yazılım kapatın ve şerit-sahibi blok güverteden kaldır. Ardından, özel tasarlanmış plaka tutucu Ekle ( Temsilcisi sonuçlarıgörmek: kristalizasyon geliştirdiler LMB adlı) kendi koşulları (Tablo 1) geçici reaktifler en yüksek göreli miktarı LMB plakalı. Yapıştırıcı film plaka kaldırın. Sıvı işleyicisi ön panel açmak ve ilk sürgülü taşıyıcı arka güvertede mühürsüz tabak yerleştirin (taşıyıcıları kayma çıkardı kolay erişim için). Plaka bir SBS alüminyum kapaklı kapağı. Taşıyıcı arka sol köşesine doğru kapak kapak karşı köşeye hafif basınç uygulayarak yerleşmek. PIN’i, sürgülü taşıyıcıları yük ve kalan 19 çalışma üzerinden en az uçucu koşulları için aynı şekilde kuruyucu. Microtube soğutma taşıyıcı bir yeşil ışık tarafından belirtildiği şekilde 4 ° C’de olduğunda, onun kapağını çıkarın. Protein örneği (Tablo 2) (en az) 440 µL içeren bir microtube kapağı kesti. Bu sıvı algılama sistemi ile müdahale edecek gibi örnek köpüksüz Menisküs, yukarıda olduğundan emin olun. Tüp pozisyon 1. microtube-soğutma taşıyıcı yerleştirin. Plaka Taşıma bağdaştırıcısı taşıyıcı önünde sıvı işleyicisi güvertede bir PCR tabak koyun. Sonra ön paneli kapatın. Güverte yükledikten sonra nanoliter dağıtıcı güverte şerit-tutucu bloğunu açıktır ve 50 µL ipucu yığınlarının arkasında taşıyıcıları alüminyum SBS kapakları açık olun. Sıvı işleyicisi ‘Yöntemi Yönetimi’ arabirimi ‘tabak kurulum’ seçin. Her iki sistemin başlatma izlemek ve çalışma parametreleri doldurmak. Yöntemi yönetim arabirimi (istemleri, rakamlar ve hazırlık ile yardımcı bir ipucu-yönetim sistemi) yönergeleri izleyin. Tüm bileşenlerin hazır ve o zaman başlamak belgili tanımlık oluşum gerekli bir kez daha denetleyin. Nanoliter dağıtıcı damla ilk plaka ve plaka mühürleyen daha sonra ayarlar gibi Sistem İzleyicisi plaka mühürler. Bir kez tüm 20 plakaları kristalizasyon damlacıkları ile hazırlanan ve otomatik olarak kayar taşıyıcılara iade, ön panel açmak ve yavaşça plakayı çıkarın. Kristalizasyon için depolamadan önce tabakları düzgün mühürlü kontrol edin. % 20 etanol çözüm SBS kapaklı depolama sıvı işleyicisinin sol taraftaki istifleme önce temiz. PCR plaka ve microtube atın. Microtube soğutma taşıyıcı açmak ve uzakta yoğunlaşma silin. Bir kağıt havlu daha fazla yoğunlaşma emmek için soğutucu yüzeyin üstüne bırakın. O zaman, taşıyıcı kapağını ve ön paneli kapatın. 2. optimizasyon koşulları Şırınga bağlı sıvı işleyici: konsantrasyonları kristalizasyon plaka (4-köşe yöntemi) rezervuar içine iki doğrusal gradyanlar üreten. Öncelikle, sıvı işleyicisi açık ve onun bilgisayar yazılımı açık başlatıldı emin olun. ‘GRADYAN’ sekmesi: gerekli program açıkken, kristalizasyon plaka türü ve son hacim rezervuar (Tablo 3) seçin. Gelişmiş ayar ‘maksimum çekim vol’ için 3000 için 6.000 düşürülmelidir [isopropanol] > v/v ve [MPD] > v içeren çözümler kullanırken / v. Şırınga hazır olun. Bir piston her şırınga (sivri uçlu aşağı) yerleştirin ve şırıngaları arkası robot baş altında belirlenmiş oluklar takabilirsiniz. Bir şırınga (program düzgün bağlı sadece tüm gerekli şırıngaları ile başlar) konumda kilitlemek için saat yönünde çevir. Tekneler hazırlayın. Paslanmaz çelik çerçeve çıkarıp tekneler yerleştirin. Soldaki 4 pozisyonlar 4 köşe A, B, C, D. gerekli çözümleri hacimleri her şırınga (üzerinde Tablo 3, 0,5 mL ölü birim görüntülenen birimler eklendi) görüntüleyen ‘SET UP’ sekmesine geçin karşılık gelir. Köşe çözümler onların anılan sıraya göre tekneler dökün ve çerçeve (çerçeve bulunduğu 2 küçük mıknatıslar güverte ön tarafta bulunan tutar) destenin geri yerleştirin. Zaten güvertede yerleştirildiğinde çözümleri kaplar dökmek için bu adım ile devam etmek için alternatif bir yol değil. Kristalizasyon plaka üzerinde motorlu SBS taşıyıcı yerleştirin. ‘Aspire edin’ tıklayın ve bu adımı (pistonlar kadar onların yolda durdu) tamamlanması bekleyin. “Çalıştır” sekmesine geçin ve programı çalıştırın. Üzerinde ikmal-in program, geri ayarla’yı sekmesine gidin ve ‘Kaldır’ ı tıklatın: sistem şırıngaları artık çözümlerinden temizler ve sonra pistons kaldırıncaya kadar. ‘Tasfiye’ istenen ‘Yerine Kaldır’; Bu alt konumda aynı şırınga ile daha fazla çözüm Aspire hazır pistons bırakacaktır. Saat yönünün tersine büküm tarafından şırıngaları kaldırmak. Şırınga ve tekneler uygun depo gözündeki atın (veya deiyonize su ve daha sonra yeniden kullanmak üzere % 20 v/v etanol çözüm ile yıka). Plaka mühür ve yüksek viskoz çözümleri karıştığında Mikroplaka Mikser 3 dk 1000 RPM veya 10 min için üzerine yerleştirin. Plaka kristalizasyon damlacıkları nanoliter dağıtıcı üzerinde oluşturmak için hazırdır. Protokolü (kurma kristalizasyon damlacıkları ile katkı ekran önceden doldurulmuş bir 96-şey kristalizasyon plaka) 1 eleme katkı İlk olarak, koşul ilk (dk. vol. 15 koşul bir konteyner sıvı işleyicisi ile katkı ekrana gelen transfer ederken mL) artışla reaktifler konsantrasyonları ile hazırlayın. Sıvı işleyicisi çalıştırmak hazır olduğundan emin olun. ‘Tek bir tabak için ‘ ekran için katkı maddeleri Ekle programı açın (rezervuar birim girin: ’72 µL’). İster, rakamlar ve robot seçimlere göre çalışmaya hazır olduğundan emin ile uç-yönetim sistemi (12 x 1000 µL ipuçları gerekli) yardım. -20 ° C-kuluçka makinesi katkı ekranını ve onun alüminyum mühür hemen (kullanım plaka sahibi) kaldırmak sonra plaka sıvı işleyicisi güvertede yer. (Taşıyıcı ön sol içinde bulunan A1-köşe plaka yerleştirilir) bir dikey düzen göre program çalışır. Aynı zamanda da koşulu ile dolu kap yerleştirin. Programı çalıştırın. Plaka rezervuarlar doldurduktan sonra Mikroplaka shaker yerleştirin ve programı çalıştırın. Deiyonize su ve % 20 etanol ile durumu yeniden kullanmak üzere konteyner durulayın. Nanoliter dağıtıcı üzerinde damlacıklar ayarlayın. İlk olarak, kristalizasyon plaka (kullanım plaka sahibi) açıldı. O zaman, plaka ve 8-iyi protein Şerit şerit-sahibi blok ilk pozisyonda yer. Kontrol eden yazılım ‘Setup’ sekmesinde her bileşen güvertede gerçek konumlarını görüntüler. Her yük ile protein örnek gerekli damla boyutu (Tablo 4) göre şeridinin de. Damlacıkları hazırlamak için programı çalıştırmak. Üzerinde ikmal-in program, plaka güverteden kaldır ve hemen kapatın (plaka mühürleyen, 3-inç geniş yapışkan bant kullanın). Şeridi’nde uygun depo gözü atın. Boyut, şekil, değerlendirmek ve depolama önce mikroskop altında damlacıkları merkezleme. Protokolü (kurma kristalizasyon damlacıkları bir 96-şey kristalizasyon plaka ile yeniden kullanılabilir bir katkı perde) 2 Eleme katkı İlk, belgili tanımlık katkı perde hazırlamak: 40 dakika oda sıcaklığında erimek için karşılık gelen dondurulmuş 96-şey hücre kültür plaka bırakın. O zaman, 1000 x g 2 min için katkı ekranında santrifüj kapasitesi. Koşul (dk. vol. 15 koşul bir konteyner sıvı işleyicisi ile katkı ekrana gelen transfer ederken mL) hazırlayın. 96-şey kristalizasyon plaka rezervuarlar koşulu ile doldurun. Sıvı işleyicinin, protokolü 1 aynı şekilde devam, 2.2.2 adım ama rezervuar hacmindeki ’80 µL’ girin. Nanoliter dağıtıcı üzerinde damlacıklar (plaka ile birlikte kristalizasyon plaka ve 8-iyi protein Şerit şerit-sahibi blok, Tablo 4ilk pozisyonda katkı ekran içeren) güvertede 3 bileşenleri ile ayarlayın. Bir alüminyum levha ile ekran içeren hücre kültür plaka mühür ve -20 ° C kuluçka makinesine koyun. Boyut, şekil, değerlendirmek ve depolama önce mikroskop altında damlacıkları merkezleme.

Representative Results

1. sistem 1 ve LMB plakaları Şekil 1A sistem işletim bir sıvı sistemi (deionised su) ile sıvı bir işleyici dayalı 1 gösterir. Sıvı sistemi bir kapsayıcı, bir pompa, boru, Vana ve 8 sabit ipuçları ile donatılmış 8 şırınga oluşur. Sıvı sınıf ayarlarını aspiratı/çözümler ve çok geniş bir çeşitlilik dağıtmak için optimize-4 plakaları dağıtmak (multi-dağıtmak emişli birim nispeten büyük bir fazlalığı gerektirir). 22 L su kabı ve % 20 v/v etanol ile daha küçük bir konteyner (5 L) sıvı sistemi beslemek için sistem altında depolanır. Her kapsayıcı iki bağlantı ekler ile donatılmıştır. Bir INSERT (mavi renkli) sistemi ile sıvı beslemeleri, diğeri (kırmızı) aşırı basınç azaltmak için bir akış geri döndü. Kullanımdan sonra su ve % 20 v/v etanol çözüm ile kızarma mikrobiyal büyüme engeller. Bir Soğutma ünitesi (Ayrıca sistem altında bulunur) özel olarak oluşturulmuş bir tüp soğutma gemisine bağlı. 1 2050 mm genişliğinde, carousel, 760 mm derin ve 88 mm yüksek dahil sistemidir. Ek bir 550 mm ön kontrol ünitesi mürekkep püskürtmeli yazıcı ve yapışkan plaka mühürleyen tutan worktable için gereklidir. Ek alan da yanında sistem kontrol PC için gereklidir. (Yani 18 4 plakaları yuvarlar) 72 önceden doldurulmuş kaplamalar üretmek için program 3 saat 50 dk sürer. Şekil 1B monte 8 sabit İpuçları (şekil 1 c) otomatik pipetting kolunu, bir tutma, bir ipucu yıkama istasyonu, 2 x 4-pozisyon taşıyıcıları SBS plakaları için ikinci bir kolla ve tüp soğutma taşıyıcı ile donatılmış ana güverte bir close-up var. Ana program 4 plakaları atlıkarınca otomatik olarak çıkartılır ve güverte üzerinde nerede onlar kristalizasyon koşulları (rezervuarlar, şekil 1 diçinde 80 µL) ile dolu yerleştirilen bir anda işler. İpuçları iletken olarak sıvı düzeyleri otomatik olarak algılanır. Sıvı işleyicisi koşulları plakaları bir dizi içine dağıtır iken, iki boş tabak başka bir set atlıkarınca çıkartılır, etiketli ve ana güverte yerleştirilir. Bir küçük özel olarak oluşturulmuş tutucu ve sıvı işleyicisi arka panel penceresinde yazıcı kafa ve onun sensörü ana güverte arkasında konumlandırmak için gerekli idi. 8 İpuçları temizlendi ve karşılık gelen sütun rezervuarlar içinde 4 aliquots oluşan losyonlu her defasında ana konteyner su ile yıkanır. 4 plakaları doldurduktan sonra bunlar otomatik olarak kapalı ve atlıkarınca özgün konumlarına geri yerleştirilir. Plaka mühürleyen (kontrol eden yazılım tarafından denir) belirli bir sürücü tarafından tetiklenir. Mühürleyen 3-inç geniş yapışkan bant bir tabak mekanik basınç altında silindirleriyle uygulandığı bir rulo kullanır. Program tamamlandıktan sonra önceden doldurulmuş plakaları atlıkarınca yığınlarının el ile kaldırıldı ve tesis içinde yer alan 10 ° C kuluçka depolanır. Resim 1 : Başlangıç tarama kitleri ile rezervuarlar doldurma. Tam otomatik sistem 1(a)genel bakış. Atlıkarınca tabak yığınları ile ayrı bir otomatik ünitesi ve sağ tarafta ana güverte açık Akrilik Levhalar yapılmış bir de yer alır. (B) işlem (bir) tüp soğutma taşıyıcı ile sıvı işleyicisinde ana güverte (altında tüyler ürpertici bir birim gösterilmez bağlı), (b) hızlı yıkama istasyonu, (c) pipetting kol (gösterilmez drenaj için bağlı) 96-şey kristalizasyon plaka, (d) 8 su depoları (e) dolu bir tabağa motorlu SBS taşıyıcı plaka mühürleyen getiren tutma kolu doldurma. Güverte arkasında (f) yazdırma kafasını mürekkep püskürtmeli yazıcı (g) mürekkep püskürtmeli kontrol ünitesi mühürleyen altında bağlı değil. (C) A etiketli plaka (ekran adı) ve üretim tarihi kristalizasyon koşulları ile iletken politetrafloroetilen kaplı paslanmaz çelikten imal ipuçları sabit 8 ile dolu. (D) kesit mühürlü kristalleşme iyi. (Üst de boş iken) rezervuar kristalizasyon durumun 80 µL içerir. Rezervuar ve üst-iyi derinliği belirtme milimetre var. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Tablo 1 test tüplerde piyasada bulunan tarama kitleri için farklı formüller gösterir. Kitleri su depoları 96-şey kristalizasyon plakaların (LMB01-LMB22) düzenli olarak sistemi 1 ile doldurmak için kullanılır. Plaka adı Kit adı Tedarikçi Katalog numarası tüpler temel açıklama LMB01 Kristal perde 1 Hampton araştırma HR2-110 48 Seyrek matris (pH 4.6-8,5) Kristal perde 2 Hampton araştırma HR2-112 48 Stokastik örnekleme (pH 4.6-9.0) LMB02 Sihirbazı 1 Rigaku 1009530 48 Stokastik örnekleme (pH 4.5-10,5) Sihirbazı 2 Rigaku 1009531 48 Stokastik örnekleme (pH 4.5-10,5) LMB03 Kılavuz ekran amonyum sülfat Hampton araştırma HR2-211 24 Kılavuz ekran, [AmS] = 0.8-3,2 M ve arabellekleri pH 4.0-9.0 Kılavuz ekran PEG/LiCl Hampton araştırma HR2-217 24 Kılavuz ekran, [PEG 6000] = 0-30 %w/v, konsantrasyonlu LiCl 1,0 M ve arabellekleri pH 4.0-9.0 = Hızlı ekran Hampton araştırma HR2-221 24 Kılavuz ekran, [NaKPO4] = 0.8-1.8 M pH 5,0-8.2 Kılavuz ekran Sodyum Klorür Hampton araştırma HR2-219 24 Kılavuz ekran, [NaCl] = 1.0-4.0 M ve arabellekleri pH 4.0-9.0 LMB04 Kılavuz ekran PEG 6000 Hampton araştırma HR2-213 24 Kılavuz ekran, [PEG 6000] 5-30 %w/v ve arabellekleri pH 4.0-9.0 = Kılavuz ekran MPD Hampton araştırma HR2-215 24 Kılavuz ekran [MPD] 10-65 %w/v ve arabellekleri pH 4.0-9.0 = MemFac Hampton araştırma HR2-114 48 Seyrek matris için zar proteinleri (pH 4.6-8,5) LMB05 PEG-iyon Hampton araştırma HR2-126 48 Kılavuz ekran, [PEG 3350] = 0.2 M (arabellek) 20 %w/v ve çeşitli tuzlar Natrix Hampton araştırma HR2-116 48 Eksik faktöriyeli (pH 5.6-8,5) LMB06 Kristal perde Lite Hampton araştırma HR2-128 48 Kristal ekran 1 orijinal precipitant konsantrasyonları yarısı ile Özel Lite ekran Moleküler boyutları n/a 48 Düşük precipitant konsantrasyonları ile ek koşullar LMB07 Sihirbazı Cryo 1 Rigaku 1009536 48 Düşük MW mandal (pH 4.5-9,4) kullanarak koşulları cryoprotected ile rassal örnekleme Sihirbazı Cryo 2 Rigaku 1009537 48 Düşük MW mandal (pH 4.5-10,1) kullanarak koşulları cryoprotected ile rassal örnekleme LMB08 JBS1 JenaBioScience CS – 101L 24 Eksik çarpınımını çeşitli mandal (pH 4.6-9.0) dayalı JBS2 JenaBioScience CS – 102L 24 Eksik çarpınımını PEG 4000 (pH 4.6-8,5) dayalı JBS3 JenaBioScience CS – 103 M 24 Eksik çarpınımını PEG 4000 (pH 4.6-8,5) dayalı JBS4 JenaBioScience CS – 104 M 24 Eksik çarpınımını orta MW mandal (pH 6,5-8,5) dayalı LMB09 JBS5 JenaBioScience CS – 105L 24 Eksik çarpınımını ağır MW mandal (pH 6,5-9.5) dayalı JBS6 JenaBioScience CS – 106L 24 Eksik çarpınımını AmS (pH 4.6-8,5) dayalı JBS7 JenaBioScience CS – 107L 24 Eksik çarpınımını MPD (pH 4.6-8,5) dayalı JBS8 JenaBioScience CS – 108L 24 Eksik çarpınımını MPD ve etanol (pH 4.6-8,5) dayalı LMB10 JBS9 JenaBioScience CS – 109L 24 Eksik çarpımını temel alınarak ortak tuzları ve 2-propanol (pH 4.6-8,5) JBS10 JenaBioScience CS – 110L 24 Eksik çarpınımını ortak tuzları (pH 4.6-8,5) dayalı Açık strateji ekran 1 pH 4.5 Moleküler boyutları MD1-16LMB 24 Kılavuz ekran çeşitli mandal Açık strateji ekran 1 pH 5.5 Moleküler boyutları MD1-16LMB 24 Kılavuz ekran çeşitli mandal LMB11 Açık strateji ekran 1 pH 6,5 Moleküler boyutları MD1-16LMB 24 Kılavuz ekran çeşitli mandal Açık strateji ekran 1 pH 7.5 Moleküler boyutları MD1-16LMB 24 Kılavuz ekran çeşitli mandal Açık strateji ekran 1 pH 8,5 Moleküler boyutları MD1-16LMB 24 Kılavuz ekran çeşitli mandal Açık strateji ekran 2 pH 4.5 Moleküler boyutları MD1-16LMB 24 Kılavuz ekran çeşitli mandal LMB12 Açık strateji ekran 2 pH 5.5 Moleküler boyutları MD1-16LMB 24 Kılavuz ekran çeşitli mandal Açık strateji ekran 2 pH 6,5 Moleküler boyutları MD1-16LMB 24 Kılavuz ekran çeşitli mandal Açık strateji ekran 2 pH 7.5 Moleküler boyutları MD1-16LMB 24 Kılavuz ekran çeşitli mandal Açık strateji ekran 2 pH 8,5 Moleküler boyutları MD1-16LMB 24 Kılavuz ekran çeşitli mandal LMB13 Dizin Hampton araştırma HR2-144 96 Küçük seyrek matris ve kılavuz ekranlar (pH 3.0-9.0) LMB14 SaltRX 1 Hampton araştırma HR2-107 48 22 benzersiz dahil olmak üzere kılavuz ekran tuzları tuz konsantrasyonu ve pH (4.1-9.0) karşı SaltRX 2 Hampton araştırma HR2-109 48 22 benzersiz dahil olmak üzere kılavuz ekran tuzları tuz konsantrasyonu ve pH (4.1-9.0) karşı LMB15 MemStart Moleküler boyutları MD1 / 21 48 Seyrek matris için zar proteinleri (pH 4.0-10,0) MemSys Moleküler boyutları MD1-25 48 Kılavuz ekran zar proteinleri (çoğunlukla mandal, pH 3.5-9.5) için LMB16 JCSG + QIAGEN 130720 96 Seyrek matris (pH 4.0-10,0) LMB17 MORPHEUS ekran Moleküler boyutları MD1-46 96 Kılavuz ekran karışımları katkı maddeleri ve cryoprotected koşulları (pH 6,5-8,5) dahil olmak üzere LMB18 PI en az ekran JenaBioScience CS-127 96 Eksik faktöriyeli (pH 4.0-9,5) LMB19 Pi-PEG ekran JenaBioScience CS-128 96 Eksik çarpınımını zar proteinleri (pH 4,8-8.8) için LMB20 MORPHEUS II ekran Moleküler boyutları MD1-91 96 Katkı maddeleri (ağır atomları) ve cryoprotected koşulları (pH 6,5-8,5) dahil olmak üzere kılavuz ekran LMB21 LMB kristalizasyon ekran Moleküler boyutları MD1-98 96 Seyrek matris LMB yayınlardan seçilmiş koşullar da dahil olmak üzere LMB22 MORPHEUS III ekran Moleküler boyutları n/a 96 Katkı maddeleri (uyuşturucu bileşikleri) ve cryoprotected koşulları (pH 6,5-8,5) dahil olmak üzere kılavuz ekran Tablo 1: formülasyonları LMB kalıplara bulundu kitleri. Her ticari tarama kiti 24/48/96 koşullarda test tüpleri başlangıçta oluşur. LMB plakaları 10 ° C İnkübatörler tesis içerisindeki her zaman nerede kullanıcılara açık olduklarını bulunan stocked vardır. 2. sistem 2 ve gereksinimleri damlacıkları ayarlamak için Şekil 2A sistem 2 pozitif yer değiştirmeli ve tek kullanımlık ipuçları ile faaliyet bir sıvı işleyicisi19 tabanlı gösterir. Tek kullanımlık ipuçları stackable raflar için otomatik işleme uygun olarak temin edilmektedir. 3 pozisyonlu güverte nanoliter dispanser20 sistem sağ tarafında entegre edildi. Aspire edin/dağıtmak nanoliter dağıtıcı üzerinde de çalışır ile pozitif deplasmanlı tek kullanımlık microsyringes (büyük makaralar tarafından sağlanan) kullanarak. Tek başına bir robot olarak çıkarılabilir şerit-sahibi blok protein sample(s) yüklemek için kullanılır. Tam otomatik bir süreç için 384-şey PCR plaka şerit-tutucu yerini alır. Benzer bir yapışkan plaka mühürleyen sistemine 1 sol tarafta entegre. Mühürleyen ve nanoliter kesici plaka taşıyıcıları bu iki tümleşik robotlar ulaşmak ana kıskacı (bir pencere içinde her iki yan paneller dışında erişim kazanmak tutma sıvı işleyicisinin kesmek zorunda amacıyla özel olarak oluşturulmuş, yükseltilmiş worktables üzerinde durmak ana güverte). Ana programı belirli sürücüleri tetikleyici nanoliter dağıtım programları ve mühürleyen zamanında aramaları zaman. 2 2850 mm genişliğinde, 800 mm derin ve 800 mm yüksek sistemidir. Ek alan yanındaki robot kontrol PC görüntülenmesi için gereklidir. İki atık kutuları ipuçları ve microsyringes (kontrol PC de altında depolanan) işlemi sırasında atılan için sistem altında yer alır. Onlar daha önce açıklanan optimizasyonu protokolleri veya başka bir bölümünde kristalizasyon gibi diğer protokoller için ayrı ayrı kullanılabilir hangi üç robotlar kolay erişim korur genel düzen 2 sisteminin önemli bir özelliği olduğunu lipidik mesophases21 ve rasgele microseed matris membran proteinlerin22eleme. Şekil 2B bir yakın çekim tek bir robot kolu ile donatılmış güverte olduğunu. Kol 12 bağımsız pipetting sondalar ve ana kıskacı bütünleştirir. Sondalar konumlarını tek tek bir yönde probları veya hatta tek borular arasında eksende farklı konumlara erişmek için kontrol edilebilir. Sondalar tek kullanımlık keyif (1-12) ya da bir çift plaka taşıma kadar alabilirsiniz adaptörler. 4 yığınlarının 50 µL tek kullanımlık ipuçları içeren iki kümesi başlangıçta yüklenir. İpuçları iletken olarak sıvı düzeyleri otomatik olarak algılanır. Plaka taşıma bağdaştırıcıları isteğe bağlı bir tutma gerektiğinde form 2 keskin iğne ile iç dizayn edilmiştir. Ana güverte üzerinde sadece 1-2 pozisyon burada kullanılmasına rağmen taşıyıcı örnek için soğutma bir 24-pozisyon microtube bulunan. Buna ek olarak, işte bir taşıyıcı PCR plaka için ve ayrıca 2 depolama taşıyıcıları için stackable, özel olarak oluşturulmuş SBS kapakları (şekil 2C). Son olarak, 4 sürgülü taşıyıcılar, her biri 5 yerleri kristalizasyon plakaları için vardır (4 x 5 = 20 plaka). Resim 2 : Damlacıkları buharı difüzyon deneyler için kurma. (A) tam otomatik sistem 2 bakış. (B) (bir) depolama taşıyıcıları ile işlem SBS kapakları, (b) stackable ipuçları, (c) soğutma taşıyıcı microtube, (d) bir örnek ile Taşıyıcı 2 deste için sıvı işleyicisinde ana güverte plaka-hareket geri başlangıç konumlarında, (g) 10th SBS kapağını kaldırarak isteğe bağlı tutma verildiğinde mühürlü protein nanoliter işleme robot, (f) 9 plakaları aktarmak için adaptörler, (e) PCR plaka plaka hakkında sıvı işleyicisi, PCR ve kristalizasyon tabak taşıma için kullanılan ana kıskacı SBS kapaklarının üstüne, (Ben) ile hazırlanacak (h) sonraki 10 tabak güverte taşınması için (j) ana otomatik 12 pipetting sonda (2 isteğe bağlı tutma çalıştırmak için kullanılan) ve ana tutma ve (k) entegre nanoliter dağıtıcı deste kol. (C) kurum içi özel SBS kapakları alüminyum. Kapakları buharlaşma koşulların ve doğru bir şekilde aldı tarafından isteğe bağlı kıskacı’lü olmak iki küçük delik önlemek için kauçuk bir örtü entegre. (D) kesit de nerede havzanın bir koşulu ile doldurulur ve üst iyi bir damlacık içerir mühürlü bir kristalleşme protein örnek ve koşul oluşur. Damlacığı precipitant durumda daha az yoğun olduğu için tüm bileşenleri içinde belgili tanımlık damla üzerinden rise konsantrasyonları buharı difüzyon (çok şematik bir okla gösterilen) tarafından denge işlemi sırasında kaybı su. (E) ışık Filmler 100 nL ve (F) 200 nL damlacıkları nanoliter dağıtıcı ile bir test çözüm (v % 20/polietilen glikol 400, v % 0.001 w/v Safranin kırmızı boya olarak) tarafından üretilen. Boyutu ve damla şekil koşulu chemicophysical özelliklerine göre değişiklik gösterebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Ana program SBS kapak ilk kristalizasyon plaka kaldırma isteğe bağlı tutma ile başlar. Sonra kapağı karşılık gelen depolama gemisine transfer edildi, kristalizasyon plaka nanoliter dağıtıcı güverte için taşınır. Sonra pipetting kol örnek damlacıkları kadar normalde soğutulmuş microtube PCR plaka ilk sütun ayarlamak için gerekli miktarda aktarır. Daha sonra ana kıskacı başında kullanıcı tarafından belirtilen seçeneklere takip damlacıkları hazırlayacak nanoliter dağıtıcı deste PCR tabağa taşır (örn. damlacık boyutu). Bunun için protein örnek ilk (tek bir set 8 microsyringes ve multi-dağıtımı kullanarak) üst kuyu reçete, sonra kristalizasyon koşulları (her satır gerektirir şimdi önlemek için 8 yeni microsyringes protein damlacıkları kalmaması sağlanmaktadır Çapraz bulaşma). Üzerinde ikmal-in programı damlacıkları kadar için ana kıskacı plaka mühürleyen karşılık gelen plaka taşıma sonra PCR plaka (daha fazla protein PCR plaka aşağıdaki plaka için bir sonraki sütunda reçete özgün konumuna geri yerleştirir ). Son olarak, mühürlü kristalizasyon plaka geri güvertede özgün konumuna geri taşınır: buharı difüzyon deneyler zaten bu plaka (şekil 2B) başladı. Bu döngü plakaları sayısına göre yinelenir. Gerektiğinde, isteğe bağlı tutma pipetting kol daha fazla ipucu erişmek izin veren bir boş ipucu rafa kaldırır. Program 2 saat 20 dk. ve 440 µL 20 tabaklar 100 nL örnek + 100 nL koşulu (şekil 2E ve 2F) kullanarak tek damlacıkları hazırlamak için örnek alır. Nanoliter dağıtıcı için iki ek tabak (bkz: protokol, adım 1.2.3) tek başına robot olarak kullanırken, başlangıç tarama plakaları 10 ° C kuluçka makinesine kullanılabilir tüm kümesini ayarlanabilir (22 LMB plakaları x 96 koşulları 2,112 koşullar =). Tablo 2 , sistemdeki 2 kullanıcı seçimlerine göre ana program gereksinimlerini gösterir. Plakaları Boyutu (nL) Sample(s) İpucu gereksinimleri Süresi Numarası Türü Vol 1 (µL) Vol 2 (µL) 50 µL ipuçları Microsyringes 10 96-şey 100 240 0 80 1040 1 saat 12 dk 20 96-şey 100 440 0 160 2080 2 saat 20 dk 10 96-şey 100 240 240 160 2080 1 saat 45 dk 20 96-şey 100 440 440 320 4160 3 saat 05 dk 10 48-şey 1000 624 0 80 560 1 saat 10 dk 20 48-şey 1000 1208 0 160 1120 2 saat 16 dk Tablo 2: sistemdeki kristalizasyon damlacıkları ayarlamak için 2 ana program seçeneklere örnek olarak şunlar. Gerekli miktarda protein örnek, ipuçları ve microsyringes programına göre değişir. Örnek hacimleri ‘ vol. 1’ (damla 1) ve ‘ vol. 2’ (damla 2) olarak takip hesaplanır: (8 İpuçları x gerekli PCR plaka + 4 µL kuyu başına birim kaybetmiş) x kristalizasyon levha + 40 µL ölü cilt microtube sayısı. 6.8 µL 1.000 nL damlacıkları 48-şey plaka için gerekli gerekli birim PCR plaka 100 nL damlacıkları 96-şey kristalizasyon plaka için kuyu başına 2 µL iken (PCR plaka Wells ölü Cilt: 0.8 µL). Örnek ek bir hacmi microtube ve diğer kayıp (örneğin ipuçları yapışmasını örnek) (‘buharlaşma nedeniyle kaybetmiş’) dikkate alınır. Örneğin, 20 MRC Kaplamalar, 100 nL, 1 damla protokolü, gerekli örnek hacmi olduğunu: (8 x 2 + 4) 20 + 40 = 440 x µL (Yani, plaka başına 22 µL eşdeğeridir). Sekiz tek kullanımlık 50 µL ipuçları her plaka ve her örnek için gereklidir. Örneğin 10 levha, 2 damla protokolü, gerekli ipuçları sayısı 8 x 10 x 2 dir. 160 ipuçları =. Microsyringes olarak takip hesaplanır: (8 + koşullar plaka başına sayısı) x örnekleri sayısı x sayısı tabaklar. Örneğin, 10 x 48-şey plakalar için gerekli sıvı işleyicisi ipuçları sayısıdır: (8 + 48) 1 x 10 = 560 x ipuçları. 3. formülasyonu, hazırlama ve işleme 4-köşe çözümleri Her iki formülasyonları 4 köşe Çözümleri (‘A, B, C ve D’) ve karşılık gelen en iyi duruma getirme ekran (şekil 3A) tarafından bir Excel elektronik tablosuotomatik olarak oluşturulur. Koşullardan farklı numaralar için farklı elektronik tablolar vardır — aslında 24, 48 ve 96 koşulları — ve ayrıca elektronik tablolar tek bir tabak içinde iki farklı en iyileştirme ekranları hazırlamak için. Biri genellikle köşe çözümleri test tüpleri 2-3 en iyi duruma getirme ekranlar hazırlanabilir, numarası ve gerekli koşulları hacmine bağlı olarak 4 x 10 mL birtakım hazırlar. Belgili tanımlık eriyik hangi onlar bir şırınga tabanlı sıvı işleyicisi tarafından emişli ve daha sonra doğrudan kalıplara (şekil 3B) reçete kaplar içine dökülür. Konsantrasyonları iki doğrusal gradyanlar neden A, karıştırma B, C ve D, sistematik olarak değişen oranlarda (şekil 3 c). Şekil 3: en iyi duruma getirme ekranlar hazırlanması için 4-köşe yöntemi. (A)konsantrasyonları bir 96-şey plaka düzen arasında iki degradeler gösterimi. (B) şırınga bağlı sıvı işleyici robot içimizi eklenen 4 şırınga ile bir ekran hazırlamak hazır. Kristalizasyon plaka motorlu SBS taşıyıcıya oturur ve çözümleri (A, B, C ve D) başlayarak 4 zaten onların anılan sıraya göre tekneler (çözümleri yalnızca gösterim amacıyla kırmızı renkli yapıyor) içine reçete. (C) oranları çözümleri A, B, C ve D 96 rezervuarlar arasında. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Tablo 3 şırınga bağlı sıvı-işleyici olarak kullanıcılara kullanılabilir için gereksinimleri gösterir. Plaka türü No Şartları Vol. plaka (rezervuarlar, µL) Vol. yalak (mL) Süresi 96-şey 48 80 1.6 2 dk 5 sn 96-şey 96 80 2.5 3 dk 50 sn 96-şey 2 x 48 80 1.6 2 dk 50 sn 48-şey 24 200 1.8 2 dk 25 sn 48-şey 48 200 3 4 dk 20 sn Tablo 3: program optimizasyonu ekranlar 4-köşe yöntemine göre hazırlanması için şırınga tabanlı sıvı işleyicinin üzerine. 96-şey plaka 96 ya da 48 durumu en iyi duruma getirme ekran hazırlamak için kullanılan (ne zaman iki 48-durum ekran aynı anda hazır mısın, robot 8 şırınga ve 8 tekneler ile donatılmış olması gerekir). Diğer programlar 48-şey plakaları kullanımını etkinleştirin. Tekneler içinde listelenen birimler gerekli ölü hacmi (0.5 mL) içerir. 4. katkı tarama Adımları ya 96 katkı çözümleri zaten rezervuarlar kristalizasyon plaka (Protokolü 1) veya düşük profilli kuyu ile başlayan bir katkı tarama gerçekleştirmek için kullanılan bir yeniden kullanılabilir katkı ekran (kültür plaka hücre şekil 4 gösterir Protokolü 2). Tablo 4 nanoliter dağıtıcı protokolleri iki tür göre mevcut programları listeler. Şekil 4: iletişim kuralları katkı tarama için iki tür. 96-katkı ekranlar-20 ° C’de depolanan Protokolü 1, katkı ekran başlangıçta kristalizasyon plakaları rezervuarlar için eklenir (ve ideal olarak bu şekilde stoklanmayacaktır). Bir sıvı işleyicisi veya multipipette koşul katkı çözümleri içeren rezervuar dağıtmak için kullanılır (katkı ekran hacmi son rezervuar hacminde yüzde 10’u temsil eder: 80 µL son hacim için 8 µL). (Gösterilmez) Mikroplaka Mikser koşullara karıştırma sonra microsyringe tabanlı nanoliter dağıtıcı damlacıkları (Tablo 4) ayarlamak için kullanılır. 2 iletişim kuralı katkı ekran kristalizasyon damlacıkları kadar ayarlanırken ancak daha sonra eklenir. Bu sefer nanoliter dağıtıcı damlacıkları ile kendi güverte (yeniden kullanılabilir hücre kültür plaka katkı ekran içeren) başka bir bileşen hazırlamak için istihdam edilmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. İletişim kuralı Boyutu (nL) Şerit türü Örnek vol. (µL) No microsyringes Süresi Türü Kaynak katkı Protein Koşul Katkı Her şey (şerit) Toplam 1 96-şey kristalizasyon plaka 100 100 0 2 ΜL 2 16 104 2 dk 1 96-şey kristalizasyon plaka 200 200 0 5 ΜL 3.8 31 104 2 dk 10 sn 2 96-şey hücre kültür plaka 200 200 100 5 ΜL 3.8 31 200 3 dk 45 sn 2 96-şey hücre kültür plaka 500 500 100 5 ΜL 7.4 60 200 4 dk 15 sn Tablo 4: katkı tarama için microsyringe tabanlı nanoliter dağıtıcı üzerinde bulunan programların. Örnek 8-şey şeridi her iyi gerekli hacmi aşağıdaki gibi hesaplanır: ölü cilt + 12 x damla boyutu. Şeritler (2 µL ve 5 µL) 2 tipi vardır. Ölü birimleri (ki aslında 3.2 µL azami içerebilir) 2 µL kuyuları için 0.8 µL ve 1.4 µL 5 µL wells (7,5 µL maks.) için vardır. Gerekli protein toplam hacmi: 8 x birim iyi şeridi (yuvarlak-up değeri). Ölü V şekilli kuyu 96-şey hücre kültür plaka yapımı 2,5 µL birimdir. Microsyringes gereken sayıda seçili programın (8 + 96 = 104; veya 8 + 2 x 96 = 200) göre değişir. Protokol 1 sırasında koşulu katkı ile seyreltme nedeniyle durumu daha başlangıçta nispeten yüksek bir konsantrasyon, hazırlanması gerekir. Son konsantrasyonları artış en kolay su hesaplanan son hacim için son ek azaltarak elde edilir. Bundan sonra biri sadece normal kümesiyle kadar koşul ve örnek (örneğin, 100 nL protein + 100 nL durumu zaten katkı maddeleri ile karışık) karışımı damlacıkları devam eder. Protokolü 2 (örneğin, 200 nL protein + 200 nL durumu + 100 nL katkı) sadece katkı ekran eklendi hacmi değişen tarafından katkı maddelerinin farklı konsantrasyonlarda tarama kolaylaştırır. Protokolü 2 daha fazla veya daha az (hangi kristalizasyon değiştirebilir) damlacıkları seyreltme anlamına gelir. Sistem 2 sıvı işleyicisinden 12 İpuçları yeterli durumda Aspire edin ve 8 aliquots bir 96-şey plaka rezervuar dağıtmak için kullanılabilir (bkz: iletişim kuralı, adım 2.2.2), her ne kadar bu adımı tabii bir çok kanallı pipet ( ile el ile yapılabilir Şekil 4). Birkaç tabak sıvı işleyicisi (daha sonra farklı katkı ekranları test etmek için) kullanırken aynı zamanda dolu olabilir. 2 tabak hazırlanırken, reaktif konteyner en az 23 mL ile doldurun. 3 tabak hazırlanırken, reaktif konteyner en az 31 mL ile doldurun. 5. kristalizasyon plakaları ve ilişkili aygıtları Her iki MRC oturma bırak buharı difüzyon kristalizasyon tabak (96-şey 2 damla ve 48-iyi 1-damla, şekil 5A ve şekil 5B) tasarımını güvenilir ve verimli otomatik kristalizasyon deneyler etkinleştirmek özellikleri sağlar, üst kuyuları özellikle küresel şekli ve hafif V şekli ve aynı zamanda Santrifüjü doğru dağıtımı ne zaman damlacıkları merkezleme kolaylaştırmak rezervuarlar gereklidir. Ayrıca, üst-wells (UV UV emici veya floresan kristalleri23tespiti için bulaşıcı polimerdir) bir stereomicroscope altında en iyi aydınlatma için bir lens etkisi. Özel mühür (şekil 5C) damla kristalizasyon deneyler plakaları bir nanoliter pınarı (protokoller gösterilmez) kullanarak her iki tür içinde asılı yukarı ayarı sağlar. Son olarak, her iki MRC plakaları aynı dış boyutları ve RIM var. RIM el ile yerleştirme/sızdırmazlık bandı sıvı sıçramasına olmadan kaldırmak için kullanılan bizim özel olarak oluşturulmuş plaka sahibi (şekil 5 d), oluklar sığar. Şekil 5: MRC kristalizasyon plakaları ve ilişkili aygıtları geliştirilen LMB. (A)A1-köşesinde 96-şey plaka. Rezervuar (dikdörtgen) kristalizasyon şey, sağdaki iki küresel üst-wells sol tarafında değil. Milimetre boyutlardır. (B) A1-köşesinde 48-şey plaka. Havzanın kuyu (1 büyük üst-de sadece) sağ tarafındadır. (C) MRC asılı damla mühür. (D) kurum içi özel plaka sahibi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 6. protein kristalleri Şekil 6 yararlı kristalleri bizim otomatik iletişim kuralları ile alınan örnekler gösterir. Şekil 6: ışık elde kristalleri otomatik protokolleri takip içeren damlacıklar filmler. (A, B) Kristalleri ile 2 için tamamen hazır plakaları OmpF ve MreB başlangıç ekranından otomasyon sistemleri (1.1 ve 1.2, koşullar protokolü bölümlerine bakın: LMB07 iyi A4 ve LMB20 iyi D12, sırasıyla, damlacıkları boyutudur 100 nL protein + 100 nL durumu, çalışma Andrzej Szewczak, LMB)24. (C, D) Bar etki alanı kristalleri önce ve sonra başlangıç koşullarını duruma getirilmesi 4-köşe yöntemiyle (Adım 2.1, LMB02 B6, 1.000 nL + 1.000 nL, yayınlanmamış eser, Leonardo Almeida-Souza, LMB). (E, F) İnsan dinein 1 N-terminal etki alanı kristaller önce ve sonra 4-köşe yöntemi ile başlangıç koşullarını iyileştirmesi ağır zincir (LMB20 E6, 200 nL + 200 nL, sonra 500 nL + 500 nL, yayınlanmamış eser, Edgar Morales-Ríos, LMB). (G, H) Tamamlayıcı faktör D kristalleri önce ve sonra koşulu ile katkı tarama duruma getirilmesi (Adım 2.2, kurum içi özel ekranında, 200 ilk koşulu nL + 200 nL, 96-koşul katkı ekranından katkı D6 yayınlanmamış Matthias Bauer, çalışmalarını LMB). (Ben, J) Viral zarf glikoprotein25 kristalleri önce ve sonra koşulu ile katkı tarama duruma getirilmesi (Adım 2.3, LMB20 A2, 150 nL + 150 nL, sonra 200 nL + 200nL + 100 nL katkı E5 96-koşul katkı ekranından, yayınlanmamış Yorgo çalışmalarını Modis, Cambridge Üniversitesi, İngiltere). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

1 – hazırlık ve ilk ekranlar levha depolanan kullanımı

Kitleri eleme ışık yağış veya faz ayrımı depolama sırasında bazı tüplerde oluştuğundan kalıplara önce reçete karışık. Ne zaman bir ekran iki kitleri (2 x 48 tüpler) oluşur, ikinci seti ilk tüp soğutma taşıyıcı E1 konumda yer alır. Ne zaman bir ekran 4 setleri (4 x 24 tüpler) oluşur, ikinci seti ilk tüp C1 konumda yerleştirilir, üçüncü seti ilk tüp E1 konuma yerleştirilir ve dördüncü seti ilk tüp G1 konuma yerleştirilir. Tüpler soğutma onların taşıyıcıya eklerken, kapakları standart 96-şey yatay düzen takip bir tepsiye yerleştirilir. Bu yana iyi numaraları üzerine kapakları üreticileri tarafından belirtilir, tüm tüpler doğru sırada verildiğinde bu çapraz kontrol sağlar. Bu da tabak azaltılmış bir dizi doldururken tüpler üzerinde doğru kapakları yerine yardımcı olur.

Önceden doldurulmuş plakaları 10 ° c, donma ve depolama koşulları ve sorunları bozulma ile sızdırmazlık neden olabilir 4 ° C’de önlemek için bir uzlaşma saklıyoruz. Plakalar için depolanır normalde fark yoğunlaşmasız iç yüzünde, mühür ile birkaç ay kadar. LMB05, LMB06, LMB09 ve LMB10 plakalar için bunlar geçici reaktifler (Tablo 1) nispeten yüksek konsantrasyonları ile koşulları içeren daha az gerçek bu. Yoğunlaşma az miktarda mühür iç tarafında bulunan mühürleme verimliliği azaltır ve Çapraz bulaşma wells plakaları getirdiğin süre arasında neden olabilir. İlk Isınma sırasında yoğunlaşma önlenmesi ile yardımcı olmak için tabak ilk 4 ° C soğuk odada gecede depolanan atlıkarınca yalıtılmış bir piknik soğutucusu içine aktarılabilir. Çok yavaş soğutma mühürlü kuyu içindeki sıcaklık degradelerin gelişimi en aza indirir ve dolayısıyla yoğunlaşma azaltır genel15. Buna ek olarak, sonra plakaları 10 ° C kuluçka makinesine saklanır, bir kurum içi özel SBS polistren kapak plaka (gösterilmez) her yığının en üstüne yerleştirilir.

Bizim önceden doldurulmuş plakaları kümesinin tamamını bir roman, suda çözünen, protein örnek karşı büyük bir başlangıç ekranı olarak kullanılabilir. Alternatif olarak, daha az sayıda tabak belirli gereksinimlerini karşılamak için seçilmiş olabilir. Örneğin, LMB15 ve LMB19 özellikle membran protein örnekleri26,27için formüle ekranlar ya da LMB20 bu ağır-atomlar ile deneysel kırınım veri28 ‘ aşamalı kolaylaştırmak için formüle ekran (Ayrıca bkz: : MORPHEUS protein kristalizasyon ekranlar formülasyonu).

2. kristalizasyon damlacıkları kurma

Sistem 2 kullanırken, kitleri ile önemli miktarda geçici reaktifler eleme ilk işlenip. Bu kapak işleme ve plaka sızdırmazlık etkileyecek SBS kapakları lastik üzerinde kalıplama yoğunlaşma önler. Bir SBS kapak izni onlar başlangıçta uyumlu hale getirilmesi gerekir neden olan bir tabak zaman, üst kısmında biraz vardır (bkz: iletişim kuralı, adım 1.2.6). Protein ölü cilt PCR plaka kuyu olarak nispeten cömert (0.8 µL, Tablo 2bkz: efsanesi) vardır. Eşit cömert ölü birimleri ne zaman nanoliter dağıtıcısı kullanarak tek tek 8-şey şeritler (Tablo 4) protein ile istihdam edilmektedir olduğunu unutmayın. Daha küçük ölü birimleri çalışabilir, ancak bazı örnekler ipuçları için uygun, kalibrasyon bir robot-ebilmek var olmak biraz tutarsız, odanın her zamanki gibi vbdaha sıcak olabilir. Tüm yaklaşım pekiştirmek için cömert ölü birimler tarafından örtülü örnek zararlara neden.

Son gelişmeler, daha fazla deney minyatür etkin ve dolayısıyla kristalizasyon koşulları eleme için gerekli örnek hacmi önemli ölçüde karşılık gelen teknoloji29,30 entegre ederek azalır . Ancak, bazı yönlerini daha da minyatür damlacıkları31 buharlaşma ve microcrystals32manipülasyon gibi dikkatli bir değerlendirme gerekir.

Son olarak, plaka (2000 rpm, 1dk) Santrifüjü rutin son bir adım olarak kristalizasyon damlacıkları (içinde küresel üst-wells) ayarlarken entegre olabilir. Daha tutarlı bir boyutu ve şekli Santrifüjü kaynaklanan damlacıkları tekrarlanabilirlik sorunları33,34azaltabilir. Kesinlikle, ortalanmış damla olarak gerekli odak uzaklığı arasında tüm plaka benzer olacak bir mikroskop kullanarak deneyler daha sonra değerlendirilmesi kolay olmayacaktır.

3. 4-köşe yönteminin avantajları

4-köşe yöntemin en önemli avantajı hataları en aza indirir ve basit otomatik protokolleri kolaylaştırır, basitliğidir. Örneğin, 4 köşe çözümler her zaman aynı düzen takip bir sıvı işleyicisi güvertede yer alacak. Ayrıca, tüm programları çözüm (şekil 3 c) arasında sabit oranlar temel alır.
4 köşe çözümleri el ile hazırlık çözümleri çok viskoz olabilen yüksek konsantrasyonlarda otomatik işleme için tercih edilir. Aspirasyon dağıtımı/nispeten hızlı ve doğru sonra üzerinde en tip-in sıvı işleyicileri sıvı sınıfların en iyi duruma getirme için en düşük gereksinimleri ile mümkündür. Yine de, bazı köşe çözümler hala çok yapışkan bir sıvı-verimli bir şekilde çalışmasına ile işletim sistemi bir robot için olabilir. Bu yüzden biz pozitif deplasmanlı (3B rakam) ile çalışan sıvı işleyici için seçti.

Konsantrasyonları 2 doğrusal gradyanlar yanı sıra üçüncü bir bileşen (örneğin, bir küme arabellekleri/katkı) uygun bir şekilde sürekli bir konsantrasyon test edilebilir. Bunun için ilk köşe çözümleri uygun daha yüksek bir konsantrasyon, çeşitlendirilecek için bileşeni hariç olmak üzere, temel bir kümesi nispeten büyük miktarda hazırlanır. O zaman, bu bileşeni içeren stok çözümleri son konsantrasyonları ayarlamak için eklenir. Örneğin, 50 mL 4 köşe çözümler kümesinin daha başlangıçta % 10 daha yüksek konsantrasyonlarda hazırlanıyor. Bu çekirdek kümesi sonra 5 daha küçük alt kümeleri 4 ikiye bölünmüş durumda. Son olarak, farklı tampon-pH çözümleri hacmi % 10 her alt kümesine eklenir.

4. biçimleri ve türleri katkı ekranlar

Ekranları beri düzenli olarak kullanılan değil normalde-20 ° C’de (şekil 4) depolanır ve geçici/kararsız bileşikleri içerir. Çünkü tamamen oda sıcaklığında erimek katkı tüm çözümler için 12-24 saat sürecek bir derin kuyu blok (1 mL Wells) depolanan bir donmuş katkı ekran kullanımı erken planlanması gerekir. Ayrıca, kullanıcılar çok sayıda potansiyel Çapraz bulaşma sorunlara neden aynı katkı ekran paylaşmak. Son olarak, derin kuyu blok yüksekliğini onları uygun olmayan çoğu nanoliter Albümler için yapar. Bu sorunları aşmak için uygun bir çözüm, ekranın düşük profilli tabak (şekil 4) Derin kuyu bloğundan aktarılmalıdır.

Tarihsel olarak, tek reaktifler (ile tek konsantrasyonları) geniş bir çeşitlilik içeren katkı ekranları çok popüler35,36olmuştur. Ancak, diğer türleri katkı ekranlarının karışımları katkı maddeleri37 veya farklı konsantrasyonlarda38, bulunan tek katkı maddeleri azaltılmış bir dizi entegre geliştirilmiştir. Son olarak, bir tamamlayıcı örnekleri kristalizasyon39,40önce katkı maddeleri etkisini araştırmak için bir yaklaşımdır.

5. daha fazla dikkat edilmesi gereken noktalar

İyi uygulama: Çoğu ekranı zararlı veya bile toksik maddeler içerir ve bu nedenle yeterli kişisel koruma sırasında protokolleri istihdam gerekir. Aynı şekilde, hareketli parçalar robotlar için yaralanmaları, özellikle (robotlar çoğunu Acil durdurma düğmesi/sistem olsa) bir program çalışırken el ile müdahale etmeye çalışırken neden olabilir. Teknik karmaşıklığı nedeniyle dahil, düzenli robotlar, ekranlar ve programları ile daha önce karakterize test örnekleri tekrarlanabilirlik sürekli yüksek düzeyde önemlidir kontrol ediyorum.

Üretilen iş: Bir göstergesi olarak 4.000-8.000 LMB arasında yıllık 1 sistemiyle (ve daha sonra başlangıç tarama için kullanıcılar tarafından istihdam) plakalar imal edilmektedir. Beklenen devir oranı 4-5 ay sonra bazı koşullar olarak çok düşük olduğunda 10 ° C’de önceden doldurulmuş tabak büyük miktarda bozulabilir ve buharlaşmasına başlayacak hisse senedi için adapte değildir. Otomasyon iletişim kuralları için farklı yaklaşımlar küçük-orta boy laboratuvarları41için uygulanmıştır.

Saklama ve deneyler değerlendirilmesi: Damlacıkları hazırladıktan sonra plakaları bir odada 4-18 ° C (+/-0,5 ° C maksimum sapma) sıkı kontrol sıcaklık düşük titreşim raflarda depolanır. Deneyler soğuk ışık kaynağı mikroskoplar kullanarak değerlendirilir. Çeşitli otomatik görüntüleme sistemleri piyasada bulunan vardır, ancak bir dikkatle tüm yönleri dikkate almanız gerekir: bir tabak inceden inceye gözden geçirmek için gereken hız için yüksek işlem hacmi yeterli olacaktır? Kristaller dışındaki nesneler ile otofokus müdahale edecek? Elde edilen görüntülerin kalitesini nokta çok küçük kristaller (özellikle kenarındaki damlacıkları) için yeterli olacak mı? 42 , 43 , 44

Kristalizasyon koşullardan karşılaştırma: Başlangıçta elde kristalleri doğası hakkında dikkatli araştırmalar sonra bir eğilimleri ve benzerlikler LMB ekran veritabanı veya C6 Web aracı45kullanarak koşulları çözümleyebilirsiniz.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MRC-LMB kristalizasyon tesis tür tıbbi araştırma Konseyi (İngiltere) tarafından desteklenmektedir. Üyeleri LMB desteklerinden dolayı teşekkür ediyoruz: Olga Perisic (PNAC), Tony Warne, Fusinita Van den KBB ve Pat Edwards (yapısal çalışmalar), Steve Scotcher ve diğer üyeleri mekanik atölye, Neil Grant ve Jo Westmoreland (görsel), Paul Hart ve Tom Pratt (BT). Biz de Steve Elliot (Tecan, Birleşik Krallık), Mitchell Stuart ve Heather Ringrose (Hamilton Robotik, İngiltere), Paul Thaw, Robert Lewis ve Joby Jenkins (TTP Labtech, UK), Paul Reardon (Swissci AG, İsviçre), George Stephens ve Donald Ogg (Alphabiotech, teşekkür etmek istiyorum Birleşik Krallık), Neil Williams (kurulmus Imaje, İngiltere) ve Graham Harris (Cleveland Ajansı) teknik yardım için.

Materials

Robots
Freedom EVO® Tecan n/a Liquid handler (System 1). Aspiration/Dispense based on system liquid. Integrates an automated carousel. EVOware plus controlling software v.2.4.12.0. 
Microlab® STAR™ Hamilton n/a Liquid handler (System 2). Aspiration/Dispense based on positive displacement (CO-RE™ technology). Hamilton STAR controlling software v.4.3.5.4785 with method management interface.
Mosquito® TTP Labtech n/a Microsyringe-based nanoliter dispenser used to set up droplets (System 2 and stand-alone), 3-position deck. Controlling software v.3.11.0.1422. 
Dragonfly® TTP Labtech n/a Syringe-based liquid handler used to produce optimization screens (4-corner method). Controlling software v.1.2.1.10196. 
Adhesive plate sealer Brandel n/a Integrated to Systems 1 and 2 (also used as stand-alone robot).
Inkjet printer 9232 Markem-Imaje n/a Integrated to System 1. Touchscreen interface.
Crystallization screens
Crystal Screen™ 1 Hampton Research HR2-110 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01
Crystal Screen 2™ Hampton Research HR2-112 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01
Wizard™ Classic 1 Rigaku 1009530 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02
Wizard™ Classic 2 Rigaku 1009531 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02
Grid Screen™ Ammonium Sulfate Hampton Research HR2-211 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Grid Screen™ PEG/LiCl Hampton Research HR2-217 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Quick Screen™ Hampton Research HR2-221 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Grid Screen™ Sodium Chloride Hampton Research HR2-219 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Grid Screen™ PEG 6000 Hampton Research HR2-213 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04
Grid Screen™ MPD Hampton Research HR2-215 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04
MemFac™ Hampton Research HR2-114 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04
PEG/Ion™ Hampton Research HR2-126 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05
Natrix™ Hampton Research HR2-116 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05
Crystal Screen Lite™ Hampton Research HR2-128 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06
Custom Lite screen Molecular Dimensions Ltd n/a Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06
Wizard™ Cryo 1 Rigaku 1009536 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07
Wizard™ Cryo 2 Rigaku 1009537 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07
JBS1 JenaBioScience CS-101L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS2 JenaBioScience CS-102L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS3 JenaBioScience CS-103L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS4 JenaBioScience CS-104L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS5 JenaBioScience CS-105L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS6 JenaBioScience CS-106L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS7 JenaBioScience CS-107L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS8 JenaBioScience CS-108L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS9 JenaBioScience CS-109L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
JBS10 JenaBioScience CS-110L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 4.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 5.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 6.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 1 pH 7.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 1 pH 8.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 2 pH 4.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 2 pH 5.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Clear Strategy™ Screen 2 pH 6.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Clear Strategy™ Screen 2 pH 7.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Clear Strategy™ Screen 2 pH 8.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Index™ Hampton Research HR2-144 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB13
SaltRX™ 1 Hampton Research HR2-107 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14
SaltRX™ 2 Hampton Research HR2-109 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14
MemStar™ Molecular Dimensions Ltd MD1-21 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15
MemSys™ Molecular Dimensions Ltd MD1-25 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15
JCSG-plus™ Suite Qiagen 130720 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB16
MORPHEUS® screen Molecular Dimensions Ltd MD1-46 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB17
Pi minimal screen JenaBioScience CS-127 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB18
Pi-PEG screen JenaBioScience CS-128 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB19
MORPHEUS® II screen Molecular Dimensions Ltd MD1-91 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB20
LMB crystallization screen™ Molecular Dimensions Ltd MD1-98 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB21
Additive screens
HT additive screen Hampton Research HR2-138 Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).
MORPHEUS® additive screen Molecular Dimensions Ltd MD1-93-500 Frozen in 96-well deepwell block (500 µL per well).
ANGSTROM additive screen™  Molecular Dimensions Ltd MD1-100 Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).
MORPHEUS® additive screen Molecular Dimensions Ltd MD1-93 Frozen in 96-well cell culture Costar® plate with V-shaped wells (100 µL per well).
ANGSTROM additive screen™  Molecular Dimensions Ltd MD1-100-FX Frozen in 96-well cell culture Costar® plate with V-shaped well (100 µL per well).
HIPPOCRATES additive screen Molecular Dimensions Ltd n/a 48 single additives (drug compounds found in MORPHEUS® III).
Other consumables
96-well MRC 2-drop plate Swissci MRC 96T-UVP Sitting-drop, vapor diffusion plate. Reservoir recommended volume: 80  µL. Range of useful droplet volumes: 10-1000 nL. UV transmissible.
48-well MRC 1-drop plate  ('MAXI plate') Swissci MMX01-UVP  Sitting-drop, vapor diffusion plate for scale-up/optimization. Reservoir recommended volume: 200  µL. Range of useful droplet volumes: 0.1-10 µL. UV transmissible.
MRC hanging drop seal Swissci n/a Hanging-drop, compatible with both MRC vapor diffusion plates (MRC 96T-UVP and MMX01-UVP ). UV and X-ray transmissible.
Adhesive sealing tape Hampton Research HR4-50 3-inch wide Duck® HD Clear™ for sealer and manual sealing.
Adhesive aluminium sheet Beckman Coulter 538619 Used to reseal additive screens.
Ink cartridge Markem-Imaje 9651 System 1 (inkjet printer).
Solvent cartridge Markem-Imaje 8652 System 1 (inkjet printer).
50 µL tips  Hamilton 235947 System 2 (STAR™ liquid handler). Box of 6 sets with 1920 x CO-RE™ tips in disposable stacks.
Reagent container Hamilton 194052 Used to dispense a condition into plate(s) during additive screening protocols. 
PCR plate Thermo Scientific™ AB-2150 System 2 (contains protein to be transfer to the Mosquito®). Abgene Diamond ultra, 384 V-shaped wells.
microsyringes TTP Labtech 4150-03020 Spool of 26,000 microsyringes for the Mosquito® nanoliter dispenser (9mm spacing).
strip-holder block TTP Labtech 3019-05013 SSB device for the Mosquito® strips, aka '4-way Reagent Holder'.
2 µL 8-well strip TTP Labtech 4150-03110 Contains protein on the deck of the Mosquito®. Box of 40 strips, max. vol. in well is 3.2 µL.
5 µL 8-well strip TTP Labtech 4150-03100 Contains protein on the deck of the Mosquito®. Box of 40 strips, max. vol. in well is 7.5 µL.
5 mL syringes TTP Labtech 4150-07100 Syringe body and piston for the Dragonfly® liquid handler. Pack of 100.
Troughs/Reservoirs TTP Labtech 4150-07103 Contains stock solutions on the deck of the Dragonfly®. Pack of 50.
Orbital microplate shaker CamLab Limited n/a Variomag® for mixing conditions in a single plate (0-2000 rpm).
Microplate mixer TTP Labtech 3121-01015 MxOne. Mixing condition in a single plate with 96 vibrating pins.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Rupp, B. . Biomolecular Crystallography: Principles, Practice and Application to Structural Biology. , (2010).
  2. McPherson, A. Introduction to protein crystallization. Methods. 34, 254-265 (2004).
  3. Bergfors, T. M. . Protein crystallization: techniques, strategies, and tips: a laboratory manual. , (1999).
  4. Dessau, M. A., Modis, Y. Protein Crystallization for X-ray Crystallography. J. Vis. Exp. (47), e2285 (2011).
  5. Crick, F. H. C. X-Ray Diffraction of Protein Crystals. Methods Enzymol. 4, 127-146 (1957).
  6. Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits. FEBS J. 281, 3995-4009 (2014).
  7. Chruszcz, M., Wlodawer, A., Minor, W. Determination of Protein Structures-A Series of Fortunate Events. Biophys. J. 95, 1-9 (2008).
  8. Manjasetty, B. A., Büssow, K., Panjikar, S., Turnbull, A. P. Current methods in structural proteomics and its applications in biological sciences. 3 Biotech. 2, 89-113 (2012).
  9. Carter, C. W., Carter, C. W. Protein crystallization using incomplete factorial experiments. J. Biol. Chem. 254, 12219-12223 (1979).
  10. Jancarik, J., Kim, S. H. Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. J. Appl. Cryst. 23, 409-411 (1991).
  11. Stevens, R. C. High-throughput protein crystallization. Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 558-563 (2000).
  12. Berry, I. M., Dym, O., Esnouf, R. M., Harlos, K., Meged, R., Perrakis, A., Sussman, J. L., Walter, T. S., Wilson, J., Messerschmidt, A. SPINE high-throughput crystallization, crystal imaging and recognition techniques: current state, performance analysis, new technologies and future aspects. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1137-1149 (2006).
  13. Luft, J. R., Collins, R. J., Fehrman, N. A., Lauricella, A. M., Veatch, C. K., DeTitta, G. T. A deliberate approach to screening for initial crystallization conditions of biological macromolecules. J. Struct. Biol. 142, 170-179 (2003).
  14. Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. S. Membrane protein structure determination-the next generation. Biochim. Biophys. Acta. 1838, 78-87 (2014).
  15. Stock, D., Perisic, O., Löwe, J. Robotic nanoliter protein crystallisation at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Prog. Biophys. Mol. Biol. 88, 311-327 (2005).
  16. Gorrec, F. The current approach to initial crystallization screening of proteins is under-sampled. J. Appl. Cryst. 46, 795-797 (2013).
  17. Hennessy, D. N., Narayanan, B., Rosenberg, J. M. Automatic implementation of precise grid screens: the four-corners method. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1001-1003 (2009).
  18. Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).
  19. DiLorenzo, M. E., Timoney, C. F., Felder, R. A. Technological Advancements in Liquid Handling Robotics. JALA. 6, 36-40 (2001).
  20. Jenkins, J., Cook, M. Mosquito: An Accurate Nanoliter Dispensing Technology. JALA. 9, 257-261 (2004).
  21. Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. J. Vis. Exp. (67), e4000 (2012).
  22. Till, M., Robson, A., Byrne, M. J., Nair, A. V., Kolek, S. A., Shaw Stewart, P. D., Race, P. R. Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening. J. Vis. Exp. (78), e50548 (2013).
  23. Dierks, K., Meyer, A., Oberthür, D., Rapp, G., Einspahr, H., Betzel, C. Efficient UV detection of protein crystals enabled by fluorescence excitation at wavelengths longer than 300 nm. Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 66, 478-484 (2010).
  24. Szewczak, A. . Structural studies of the bacterial MreBCD complex. , (2016).
  25. Nayak, V., Dessau, M., Kucera, K., Anthony, K., Ledizet, M., Modis, Y. Crystal structure of dengue virus type 1 envelope protein in the postfusion conformation and its implications for membrane fusion. J. Virol. 83, 4338-4344 (2009).
  26. Gorrec, F., Palmer, C. M., Lebon, G., Warne, T. Pi sampling: a methodical and flexible approach to initial macromolecular crystallization screening. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67, 463-470 (2011).
  27. Parker, J. L., Newstead, S. Current trends in α-helical membrane protein crystallization: An update. Protein Sci. 21, 1358-1365 (2012).
  28. Gorrec, F. The MORPHEUS II protein crystallization screen. Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 71, 831-837 (2015).
  29. Yin, X., et al. Hitting the target: fragment screening with acoustic in situ co-crystallization of proteins plus fragment libraries on pin-mounted data-collection micromeshes. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 70, 1177-1189 (2014).
  30. Wu, P., Noland, C., Ultsch, M., Edwards, B., Harris, D., Mayer, R., Harris, S. F. Developments in the Implementation of Acoustic Droplet Ejection for Protein Crystallography. JALA. 21, 97-106 (2015).
  31. Zipper, L. E., et al. A simple technique to reduce evaporation of crystallization droplets by using plate lids with apertures for adding liquids. Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 70, 1707-1713 (2014).
  32. Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. Microcrystal manipulation with laser tweezers. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69, 1297-1302 (2013).
  33. Newman, J. Initial Evaluations of the Reproducibility of Vapor-Diffusion Crystallization. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63, 826-832 (2007).
  34. Reis, N. M., Chirgadze, D. Y., Blundell, T. L., Mackley, M. R. The effect of protein-precipitant interfaces and applied shear on the nucleation and growth of lysozyme crystal. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1127-1139 (2009).
  35. McPherson, A., Koszelak., S., Axelrod, H., Day, J., Robinson, L., McGrath, M., Williams, R., Cascio, D. The effects of neutral detergents on the crystallization of soluble proteins. J. Crystal Growth. 76 (3), 547-553 (1986).
  36. Sauter, C., Ng, J. D., Lorber, B., Keith, G., Brion, P., Hosseini, M. W., Lehn, J. -. M., Giegé, R. Additives for the crystallization of proteins and nucleic acids. J. Crystal Growth. 196, 365-376 (1999).
  37. McPherson, A., Cudney, B. Searching for silver bullets: an alternative strategy for crystallizing macromolecules. J. Struct. Biol. 156, 387-406 (2006).
  38. Gorrec, F. Protein crystallization screens developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Drug Discov. Today. 21, 819-825 (2016).
  39. Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal. Biochem. 357, 289-298 (2006).
  40. Chari, A., et al. ProteoPlex: stability optimization of macromolecular complexes by sparse-matrix screening of chemical space. Nat. Methods. 12, 859-865 (2015).
  41. Newman, J., Egan, D., Walter, T. S., Meged, R., Berry, I., Ben Jelloul, M., Sussman, J. L., Stuart, D. I., Perrakis, A. Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61, 1426-1431 (2005).
  42. Wilson, J. Automated Evaluation of Crystallisation Experiments. Cryst. Rev. 10, 73-84 (2004).
  43. Snell, E. H., et al. Establishing a training set through the visual analysis of crystallization trials. Part I: ∼150 000 images. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64, 1123-1130 (2008).
  44. Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55, 379-386 (2011).
  45. Newman, J., Fazio, V., Lawson, B., Peat, T. The C6 Web Tool: A Resource for the Rational Selection of Crystallization Conditions. Cryst. Growth & Des. 13, 12219-12223 (2010).

Tags

Macromolecular CrystallizationProtein StructureDNARNAVapor DiffusionNanoliter DispenserInkjet PrinterAdhesive Plate SealerLiquid HandlerChillerCarouselScreening Kits96-well Layout

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Gorrec, F., Löwe, J. Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology. J. Vis. Exp. (131), e55790, doi:10.3791/55790 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image