분자 생물학의 MRC 실험실에서 고분자 결정에 대 한 프로토콜을 자동

1. 시스템 1과 좌 판 그림 1A 시스템 1 액체 처리기 액체 시스템 (deionised 물) 운영에 따라 보여 줍니다. 액체-시스템 구성 컨테이너, 펌프, 튜브, 밸브와 8 고정된 팁 8 주사기. 액체 클래스 설정 aspirate/분배 솔루션 및 다중의 광범위 한 다양 한 최적화 했다-4 판으로 분배 (멀티-분배 aspirated 볼륨의 비교적 큰 초과 필요 합니다). 22 L 물 컨테이너 및 20 %v / v 에탄올과 작은 컨테이너 (5 L) 액체 시스템 피드 시스템 아래 저장 됩니다. 각 컨테이너는 두 개의 커플링 삽입을 갖추고 있습니다. 1 삽입 (파란색) 액체 시스템 피드, 다른 하나 (레드) 초과 압력 감소 흐름-다시. 사용 후, 물 그리고 20 %v / v 에탄올 용액과 홍 조 미생물 성장을 방지 합니다. (또한 시스템 아래에 있는) 냉각 장치는 사용자 관 냉각 캐리어에 연결 된다. 시스템 1은 2050 mm 폭, 회전 목마, 깊은 760 mm 높이 88 m m 등 이다. 추가 550 mm 잉크젯 프린터와 접착 판 마감재의 제어 장치를 보유 하 고 작업 테이블에 대 한 전면에 필요 합니다. 또한 제어 PC에 대 한 추가 공간 시스템에 필요 합니다. 프로그램 (즉, 18 4 접시의 라운드) 72 미리 채워진된 접시를 생산 하는 3 h 50 분 걸립니다. 그림 1B 는 8 고정된 팁 (그림 1C) 탑재 자동된 pipetting 팔, 그리퍼, 팁 세척 역, SBS 판에 대 한 2 × 4 위치 사업자와 두 번째 팔과 튜브 냉각 캐리어에 장착 하는 주 갑판의 클로즈업. 주요 프로그램 4 접시는 회전 목마에서 자동으로 촬영 하 고 그들은 결정 화 조건 ( 그림 1D저수지에서 80 µ L)으로 채워진다는 갑판에 배치를 한 번에 처리 합니다. 팁은 전도성 액체 수준 감지 자동으로 됩니다. 액체 처리기는 격판덮개의 집합으로 조건 dispenses, 하는 동안 빈 접시의 또 다른 세트는 회전 목마에서 밖으로, 표시 이며 주 갑판에 배치. 액체 처리기의 후면 패널에 창과 작은 사용자 홀더 프린터 헤드와 메인 데크 뒤쪽의 센서 위치 필요 했다. 8 팁 플러시 고 저수지의 해당 열에 4 aliquots의 구성 된 각 분배 단계 후 주요 컨테이너에서 물으로 세척. 4 접시를 작성 한 후 자동으로 봉인 되며 회전 목마에서 그들의 원래 위치에 다시 배치 됩니다. 플레이트 마감재 (제어 소프트웨어에 의해 호출)는 특정 드라이버에 의해 트리거됩니다. 봉인 자 기계 압력 롤러와 함께 접시에 적용 되는 3 인치 넓은 접착제 테이프 롤을 사용 합니다. 완료 되 면 프로그램, 미리 채워진된 접시 회전 목마 스택에서 수동으로 제거 하 고 시설 내에 있는 10 ° C 인큐베이터에 저장. 그림 1 : 초기 심사 키트와 함께 저수지를 작성. 완전 자동화 된 시스템 1의 (A) 개요. 회전 목마 접시 더미와 별도 자동화 된 단위 이며 그것 오른쪽 메인 덱에 명확한 아크릴 시트의 우물에서 지 내게 된다. (B) (a) 튜브 냉각 캐리어와에서 액체 처리기의 메인 데크 (에 연결 된 아래, 재미 단위 표시 되지 않음), (b) 빠른 세척 역 (배수, 표시 되지 않음에 연결), (c) pipetting 팔 가져 (e)에 채워진된 접시 접시 마감재의 동력된 SBS 캐리어 그리퍼 팔 96 잘 결정 화 접시 (d)의 8 저수지를 채우는. 갑판 뒤에 마감재 아래 잉크젯 제어 장치 (g)에 연결 된 잉크젯 프린터의 (f)는 인쇄 머리 이다. (C) A 표시 판 (스크린 이름) 및 생산의 날짜 결정 화 조건 8 전도성 소계 코팅 스테인레스 스틸 팁 고정 충만. (D) 잘 된 결정의 단면. 저수지 (동안 위 잘 비어) 80 µ L의 결정 화 상태를 포함 합니다. 저수지와 위 잘 깊이 사양 밀리미터에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 표 1 테스트 튜브에 상업적으로 이용 가능한 검사 키트에 대 한 다른 제형을 보여준다. 키트는 시스템 1 정기적으로 결정 화 96 잘 접시 (LMB01-LMB22)의 저수지를 채우는 데 사용 됩니다. 플레이트 이름 장비 이름 공급 업체 카탈로그 번호 튜브 기본 설명 LMB01 크리스털 화면 1 햄튼 연구 HR2-110 48 스파스 매트릭스 (pH 4.6-8.5) 크리스털 화면 2 햄튼 연구 HR2-112 48 확률적 샘플링 (pH 4.6-9.0) LMB02 마법사 1 리가 1009530 48 확률적 샘플링 (pH 4.5 ~ 10.5) 마법사 2 리가 1009531 48 확률적 샘플링 (pH 4.5 ~ 10.5) LMB03 그리드 화면 황산 암모늄 햄튼 연구 HR2-211 24 [AmS] 그리드 화면 = 0.8-3.2 M 및 버퍼 pH 4.0-9.0 그리드 화면 못/LiCl 햄튼 연구 HR2-217 24 그리드 화면, [말뚝 6000] = 0-30 %w / v, 하자마자 LiCl 1.0 M 및 버퍼 pH 4.0-9.0 = 빠른 화면 햄튼 연구 HR2-221 24 [NaKPO4] 그리드 화면 = 0.8-1.8에서 pH 5.0-8.2 M 그리드 화면 염화 나트륨 햄튼 연구 HR2-219 24 그리드 화면, [NaCl] 1.0-4.0 M 및 버퍼 pH 4.0-9.0 = LMB04 그리드 화면이 던지다 6000을 햄튼 연구 HR2-213 24 그리드 화면, [말뚝 6000] 5-30 %w/v 및 버퍼 pH 4.0-9.0 = 그리드 화면 MPD 햄튼 연구 HR2-215 24 그리드 화면 [MPD] = 10-65 %w/v 및 버퍼 pH 4.0-9.0 MemFac 햄튼 연구 HR2-114 48 막 단백질 (pH 4.6-8.5)에 대 한 스파스 매트릭스 LMB05 못-이온 햄튼 연구 HR2-126 48 그리드 화면, [말뚝 3350] = 20 %w/v 및 다양 한 소금 0.2 M (버퍼)에 Natrix 햄튼 연구 HR2-116 48 불완전 한 계승값 (pH 5.6-8.5) LMB06 크리스털 스크린 라이트 햄튼 연구 HR2-128 48 크리스털 스크린 1 원래 precipitant 농도의 절반 사용자 정의 라이트 화면 분자 크기 n/a 48 조건이 낮은 precipitant 농도와 LMB07 마법사 Cryo 1 리가 1009536 48 확률적 샘플링 조건 cryoprotected 낮은 MW 구슬 (pH 4.5-9.4)를 사용 하 여 마법사 Cryo 2 리가 1009537 48 확률적 샘플링 조건 cryoprotected 낮은 MW 구슬 (pH 4.5-10.1)를 사용 하 여 LMB08 JBS1 JenaBioScience CS-101 L 24 다양 한 나무 못 (pH 4.6-9.0)에 따라 불완전 한 계승 JBS2 JenaBioScience CS-102 L 24 불완전 한 계승값 던지다 4000 (pH 4.6-8.5)에 따라 JBS3 JenaBioScience CS-103 L 24 불완전 한 계승값 던지다 4000 (pH 4.6-8.5)에 따라 JBS4 JenaBioScience CS-104 L 24 불완전 한 계승값 중간 MW 구슬 (pH 6.5-8.5)에 따라 LMB09 JBS5 JenaBioScience CS-105 L 24 불완전 한 계승값 무거운 MW 구슬 (pH 6.5-9.5)에 따라 JBS6 JenaBioScience CS-106 L 24 불완전 한 계승값 AmS (pH 4.6-8.5)에 따라 JBS7 JenaBioScience CS-107 L 24 MPD (pH 4.6-8.5)에 기반 하는 불완전 한 계승 JBS8 JenaBioScience CS-108 L 24 불완전 한 계승값 MPD와 에탄올 (pH 4.6-8.5)에 따라 LMB10 JBS9 JenaBioScience CS-109 L 24 불완전 한 계승값 일반 소금에 따라 및 2-프로 판 올 (pH 4.6-8.5) JBS10 JenaBioScience CS-110 L 24 일반 소금 (pH 4.6-8.5)에 기반 하는 불완전 한 계승 명확한 전략 화면 1 pH 4.5 분자 크기 MD1-16LMB 24 다양 한 나무 못으로 표 화면 명확한 전략 화면 1 pH 5.5 분자 크기 MD1-16LMB 24 다양 한 나무 못으로 표 화면 LMB11 명확한 전략 화면 1 pH 6.5 분자 크기 MD1-16LMB 24 다양 한 나무 못으로 표 화면 명확한 전략 화면 1 pH 7.5 분자 크기 MD1-16LMB 24 다양 한 나무 못으로 표 화면 명확한 전략 화면 1 pH 8.5 분자 크기 MD1-16LMB 24 다양 한 나무 못으로 표 화면 명확한 전략 화면 2 pH 4.5 분자 크기 MD1-16LMB 24 다양 한 나무 못으로 표 화면 LMB12 명확한 전략 화면 2 pH 5.5 분자 크기 MD1-16LMB 24 다양 한 나무 못으로 표 화면 명확한 전략 화면 2 pH 6.5 분자 크기 MD1-16LMB 24 다양 한 나무 못으로 표 화면 명확한 전략 화면 2 pH 7.5 분자 크기 MD1-16LMB 24 다양 한 나무 못으로 표 화면 명확한 전략 화면 2 pH 8.5 분자 크기 MD1-16LMB 24 다양 한 나무 못으로 표 화면 LMB13 인덱스 햄튼 연구 HR2-144 96 작은 스파스 매트릭스 및 그리드 화면 (pH 3.0-9.0) LMB14 SaltRX 1 햄튼 연구 HR2-107 48 그리드 화면 22 고유를 포함 하 여 소금 소금 농도 및 pH (4.1-9.0) SaltRX 2 햄튼 연구 HR2-109 48 그리드 화면 22 고유를 포함 하 여 소금 소금 농도 및 pH (4.1-9.0) LMB15 MemStart 분자 크기 MD1-21 48 막 단백질 (pH 4.0-10.0)에 대 한 스파스 매트릭스 키워 분자 크기 MD1-25 48 막 단백질 (주로 나무 못, pH 3.5-9.5)에 대 한 표 화면 LMB16 JCSG + Qiagen 130720 96 스파스 매트릭스 (pH 4.0-10.0) LMB17 모 피어스 화면 분자 크기 MD1-46 96 첨가제 및 cryoprotected 조건 (pH 6.5-8.5)의 믹스를 포함 한 그리드 화면 LMB18 Pi 최소한의 화면 JenaBioScience CS-127 96 불완전 한 계승값 (pH 4.0-9.5) LMB19 Pi-말뚝 화면 JenaBioScience CS-128 96 막 단백질 (pH 4.8-8.8)에 대 한 불완전 한 계승 LMB20 모 피어스 II 화면 분자 크기 MD1-91 96 첨가제 (무거운 원자)와 cryoprotected 조건 (pH 6.5-8.5)의 믹스를 포함 한 그리드 화면 LMB21 LMB 결정 화 화면 분자 크기 MD1-98 96 LMB 간행물에서 선정 하는 조건을 포함 한 스파스 매트릭스 LMB22 모 피어스 III 화면 분자 크기 n/a 96 첨가제 (약 화합물) 및 cryoprotected (pH 6.5-8.5)의 믹스를 포함 한 그리드 화면 표 1: 좌 판에는 키트의 공식. 처음 테스트 튜브에에서 24/48/96 조건 각 상업 검사 키트에 의하여 이루어져 있다. 좌 판 그들이 사용할 수 있는 사용자에 게 언제 든 지 시설 내에 있는 10 ° C incubators에 갖춰져 있습니다. 2. 시스템 2와 방울을 설정 하기 위한 요구 사항 그림 2A 시스템 2 액체 처리기19 긍정적인 변위와 일회용 팁 운영에 따라 보여 줍니다. 일회용 팁 쌓을 선반 자동된 처리를 위해 적당 한에 제공 됩니다. 3-위치 갑판 nanoliter 디스펜서20 시스템의 오른쪽에 통합 되었다. Aspirate/nanoliter 디스펜서에 분배 또한 긍정적인 변위 일회용 microsyringes (큰 스풀에 제공)을 사용 하 여 작동 합니다. 독립형 로봇으로 이동식 스트립 홀더 블록 단백질 sample(s)를 로드 하는 데 사용 됩니다. 완전 자동화 된 프로세스에 대 한 384-잘 PCR 접시는 스트립 홀더를 대체합니다. 비슷한 시스템 1 접착 판 마감재 왼쪽에 통합 되었다. 마감재 및 nanoliter 디스펜서 (창 밖에 서 액세스 그리퍼에 대 한 액체 처리기의 두 측면 패널에서 잘라 했다이 두 통합된 로봇의 플레이트 캐리어를 도달 하는 주요 그리퍼에 대 한 순서에 주문 품, 제기 작업 테이블에 서 서 주 갑판)입니다. 때문에 트리거 nanoliter 분배 프로그램 및 봉인 자에 특정 드라이버를 호출 하는 주요 프로그램 시간. 2 시스템 이며 2,850 m m, 폭 800mm 깊이 높이 800 m m. 로봇 제어 PC의 디스플레이 대 한 다음 추가 공간이 필요 합니다. 2 폐기물 쓰레기통 팁 및 microsyringes (제어 PC는 저장 밑) 과정에서 폐기에 대 한 시스템 아래 있습니다. 시스템 2의 중요 한 특징은 앞에서 설명한 최적화 프로토콜 또는 결정 화 등 다른 곳에서 설명 하는 다른 프로토콜에 대 한 개별적으로 사용할 수 있도록 세 가지 로봇에 쉽게 접근할 수를 유지 전체 레이아웃 막 단백질 lipidic mesophases21 에 임의의 microseed 매트릭스의22를 상영. 그림 2B 는 하나의 로봇 팔을 장착 하는 갑판의 클로즈업입니다. 팔 12 독립 pipetting 프로브 및 주요 그리퍼를 통합합니다. 프로브 위치를 개별적으로 한 방향에서 프로브 또는 심지어 단일 튜브 축 따라 서로 다른 위치에 액세스 하려면 제어할 수 있습니다. 프로브는 일회용 팁 (1-12) 또는 플레이트 이동의 쌍을 선택할 수 있습니다 어댑터. 두 집합이 포함 된 50 µ L 일회용 팁 4 스택 처음 로드 됩니다. 팁은 전도성 액체 수준 감지 자동으로 됩니다. 플레이트 이동 어댑터는 필요할 때 선택적 그리퍼를 형성 하는 내부에 2 날카로운 핀 설계 되었습니다. 메인 데크에만 1-2 위치 여기 사용 샘플, 운반대 냉각 24 위치 microtube 위치 하 고 있습니다. 또한, PCR 플레이트 캐리어 및 또한 2 스토리지 캐리어 쌓을 수 있는, 사용자 SBS 뚜껑 (그림 2C)에 대 한 있다. 마지막으로, 거기 보균자 4 슬라이딩, 각각 5 위치 결정 화 접시 (4 x 5 = 20 접시). 그림 2 : 방울 증기 확산 실험에 대 한 설정. (2 완전 자동화 된 시스템의 개요 A). (B) (는) 저장 사업자 SBS 뚜껑, (b)는 쌓을 수 있는 팁, 2 (c) 냉각 캐리어 microtube, (d)에 샘플 캐리어의 스택을 위해 동작에 액체 처리기의 메인 데크 플레이트 이동 어댑터, (e) PCR 접시 10번째 의 SBS 뚜껑을 제거 하는 옵션 그리퍼 다시 그들의 초기 위치, (g)에 배치 된 봉인 nanoliter 처리 로봇, (f) 9 단백질 접시를 전송 하기 위한 접시에 대 한 액체 처리기, PCR, 결정 화 접시를 전송 하는 데 사용 되는 주요 그리퍼 SBS 뚜껑 위에, (나) 준비를 (h) 다음 10 접시의 갑판에 이송 (j) 주요 자동 팔 12 pipetting 프로브 (2 옵션 그리퍼로 작동 하는 데 사용 되 고) 및 주요 그리퍼 및 (k) 통합 nanoliter 디스펜서의 갑판. (C) 사내 사용자 지정 SBS 뚜껑 알루미늄의 했다. 뚜껑 조건의 증발 될 정확 하 게 고른-옵션 그리퍼에 의해 두 개의 작은 구멍을 피하기 위해 고무 시트 통합. (D) 횡단면 봉인된 결정 화 잘 어디 저수지 조건으로 채워집니다와 위 잘 포함 물방울의 단백질 견본 및 조건에서 구성. 작은 물방울에 비례적 조건에 보다 적게 집중 때문에, 모든 드롭의 구성 요소를 통해 상승의 농도 (매우 개요로 화살표로 표시 되는) 증기 확산에 의해 평형의 과정에서 손실을 물. 100의 (E) 가벼운 현미경 nL와 (F) 200 nL 방울 테스트 솔루션 (20 v/v % 폴 리 에틸렌 글리콜 400, 0.001 %w / v 붉은 염료로 Safranin) nanoliter 디스펜서에 의해 생산. 물방울의 형태와 크기는 chemicophysical 속성의 상태에 따라 달라질 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 주요 프로그램 SBS 뚜껑을 제거 하는 첫 번째 결정 화 접시에서 선택적 그리퍼로 시작 합니다. 뚜껑은 해당 스토리지 캐리어를 후, 결정 화 접시 nanoliter 디스펜서의 갑판에 수송 된다. 다음 pipetting 팔 방울 일반적으로 냉장된 microtube에서 PCR 접시의 첫 번째 열을 설정 하기 위한 필요한 샘플의 양을 전송 합니다. 그 후, 주요 그리퍼 이동 시작에서 사용자가 선택한 옵션에 따라 방울을 준비할 것 이다 nanoliter 분배기의 갑판에 PCR 플레이트 (예. 작은 물방울 크기). 이 위해 단백질 샘플 먼저 위-웰 스 (를 사용 하 여 단일 8 microsyringes 및 다중 분배)에 적절 하 게 다음 결정 화 조건 (각 행 지금 필요 방지 하려면 8 새로운 microsyringes 단백질 방울에 적절 하 크로스-오염)입니다. 완료 되 면 방울을 설정 하는 프로그램, 주요 그리퍼 해당 접시 접시 마감재를 전송 후 PCR 플레이트 (더 많은 단백질은 될 적절 하 게 다음 접시에 대 한 PCR 플레이트의 다음 열에 그것의 원래 위치에 다시 배치 ). 마지막으로, 봉인된 결정 화 접시 이동 다시 원래 위치로 갑판: 증기 확산 실험이이 접시 (그림 2D)에 이미 시작 했습니다. 이 주기는 번호판의 수에 따라 반복 됩니다. 필요한 경우, 선택적 그리퍼 pipetting 팔 더 많은 도움말을 액세스를 허용 하는 빈 팁 랙을 제거 합니다. 프로그램은 2 시간 20 분 및 440 µ L 100 nL 샘플 + 100 nL 조건 (그림 2E 와 2F)를 사용 하 여 20 접시에 한 방울을 준비 하는 샘플의 걸립니다. Nanoliter 디스펜서를 사용 하 여 (프로토콜, 1.2.3 단계 참조)의 추가 접시 두 개에 대 한 독립 실행형 로봇으로 때 초기 심사 접시 10 ° C 배양 기에서 사용할 수의 전체 집합을 설정할 수 있습니다 (22 좌 판 x 96 조건 = 2,112 조건). 표 2 는 2 시스템에 사용자의 선택에 따라 주요 프로그램에 대 한 요구 사항을 보여 줍니다. 플레이트 방울 크기 (nL) Sample(s) 팁 요구 사항 기간 번호 유형 제 1 (µ L) 집. 2 (µ L) 50 µ L 팁 Microsyringes 10 96-잘 100 240 0 80 1040 1 시간 12 분 20 96-잘 100 440 0 160 2080 2 시간 20 분 10 96-잘 100 240 240 160 2080 1 h 45 분 20 96-잘 100 440 440 320 4160 3 h 05 분 10 48-잘 1000 624 0 80 560 1 시간 10 분 20 48-잘 1000 1208 0 160 1120 2 h 16 분 표 2: 결정 화 방울을 설정 하기 위한 시스템 2에서 사용할 수 있는 주요 프로그램 옵션의 예. 필요한 양의 단백질 샘플, 팁 및 microsyringes는 프로그램 마다 다릅니다. 샘플의 볼륨 ‘ vol. 1’ (드롭 1)와 ‘ vol. 2’ (드롭 2)는 다음과 같이 계산 됩니다: (8 팁 x 필요한 PCR 플레이트 + 4 µ L의 당 볼륨 볼륨 손실) x 결정 화 접시 + microtube에서 40 µ L 죽은 볼륨의 수. 96-잘 결정 화 접시에 100 nL 방울에 대 한 PCR 플레이트의 당 필요한 볼륨은 2 µ L 6.8 µ L 48-잘 접시에 1000 nL 방울 필요 (PCR 격판덮개의 우물에 죽은 볼륨: 0.8 µ L). 샘플의 추가 볼륨은 고려 (‘ 볼륨 ‘)으로 인해 잃어버린 증발은 microtube 및 다른 손실 (예: 샘플 팁에 고정). 예를 들어 20 MRC 번호판, 100에 대 한 내셔널 리그, 1 드롭 프로토콜, 필요한 샘플의 볼륨은: (8 x 2 + 4) 20 + 40 = 440 x µ L (즉, 접시 당 22 µ L의 해당). 8 일회용 50 µ L 팁은 각 판과 각 샘플에 대 한 필요. 예 10 접시, 2 드롭 프로토콜을 필요한 팁의 번호는 2 x 10 x 8 = 160 팁. Microsyringes의 수는 다음과 같이 계산 됩니다: (8 + 접시 당 조건의 수) 샘플 수 x x 격판덮개의 수. 예를 들어, 10 x 48-잘 접시, 필요한 액체 처리기 팁의 번호는: (8 + 48) 1 x 10 = 560 x 팁. 3. 배합, 준비 및 4 코너 솔루션의 처리 두 공식 (‘A, B, C, D’) 4 코너 솔루션 및 해당 최적화 화면 (그림 3A)는 Excel 스프레드시트에 의해 자동으로 생성 됩니다. 조건의 다른 숫자에 대 한 다른 스프레드시트는-기본적으로 24, 48 그리고 96 조건-와 또한 스프레드시트 단일 플레이트에서 두 개의 서로 다른 최적화 화면을 준비 하. 하나 일반적으로 코너 솔루션 테스트 튜브는 2-3 최적화 화면 준비 될 수 있다에서 수와 양의 조건에 따라서 4 x 10 mL의 세트를 준비 합니다. 솔루션은 골짜기는 주사기 기반 액체 처리기에 의해 발음 되며 나중 접시 (그림 3B)에 직접 적절 하 게에 부 어. 농도의 2 개의 선형 그라디언트, 혼합에서 결과 B, C 및 D에 체계적으로 다양 한 비율 (그림 3C). 그림 3: 최적화 화면을 준비 하기 위한 4 구석 방법. (A) 농도 96 잘 접시 레이아웃에서의 두 개의 그라디언트의 표현입니다. (B) 4 주사기 로봇의 머리에 삽입과 화면을 준비 준비가 주사기 기반 액체 처리기. 결정 화 접시 동력된 SBS 캐리어에 앉아서 솔루션 (A, B, C 및 D)를 시작 하는 4 (솔루션 데모 용도로 색된 빨간색 되었습니다) 그들의 각각 골짜기에 적절 이미 있다. 96 저수지에 걸쳐 솔루션 A, B, C 및 D의의 (C) 비율 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 표 3 는 주사기 기반 액체 처리기에는 사용자에 게 사용할 수 있는 프로그램에 대 한 요구 사항을 보여 줍니다. 격판덮개 유형 롤 조건 플레이트 (저수지, µ L) 집. 물 (mL) 집. 기간 96-잘 48 80 1.6 2 분 5 초 96-잘 96 80 2.5 3 분 50 초 96-잘 2 x 48 80 1.6 2 분 50 초 48-잘 24 200 1.8 2 분 25 초 48-잘 48 200 3 4 분 20 초 표 3: 4 코너 방법 최적화 화면을 준비 하기 위한 주사기 기반 액체 처리기에서 사용할 수 있는 프로그램. 96 잘 접시 96 또는 48 조건 최적화 화면을 준비 하는 데 사용할 수 있습니다 (두 48 조건 화면을 동시에 준비 하는 때 로봇 갖추고 있어야 합니다 8 주사기와 8 골짜기). 다른 프로그램 48-잘 접시를 사용 하 여를 사용합니다. 골짜기에 나열 된 볼륨 필요한 죽은 볼륨 (0.5 mL)를 포함합니다. 4. 첨가제 심사 그림 4 쇼 중 96 첨가제 솔루션 결정 화 접시 (프로토콜 1)의 저수지에서 이미 나는 로우 프로 파일의 우물에는 첨가제 심사 시작을 수행 하는 단계 세포 문화 접시 재사용할 첨가제 화면 (로 사용 프로토콜 2)입니다. 표 4 는 두 가지 유형의 프로토콜에 따라 nanoliter 디스펜서에서 사용할 수 있는 프로그램을 나열합니다. 그림 4: 두 가지 유형의 첨가제 심사에 대 한 프로토콜. -20 ° c.에 96 추가 화면 저장 1 프로토콜, 다음 추가 화면 처음 결정 화 접시의 저수지에 추가 (이며이 이렇게 이상적으로 방류). 액체 처리기 또는 multipipette 포함 된 첨가제 솔루션 저수지에 상태를 분배 하는 (첨가제 화면의 볼륨 저수지에서 마지막 볼륨의 10%를 나타냅니다: 80 µ L 최종 볼륨 8 µ L). 혼합 후 microplate 믹서 (표시 되지 않음)에 조건, microsyringe 기반 nanoliter 디스펜서는 방울 (표 4)을 설정 하는 데 사용 됩니다. 2 프로토콜, 다음 추가 화면만 나중 결정 화 방울을 설정 하는 동안 추가 됩니다. 이 시간 nanoliter 디스펜서 갑판 (첨가제 화면을 포함 하는 재사용 가능한 셀 문화 접시)에 추가 된 구성 요소와 방울을 준비 하 채택 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 프로토콜 방울 크기 (nL) 스트립 종류 샘플 집 (µ L) 롤 microsyringes의 기간 유형 첨가제의 소스 단백질 조건 첨가제 각 잘 (스트립) 총 1 96-잘 결정 화 접시 100 100 0 2 Μ L 2 16 104 2 분 1 96-잘 결정 화 접시 200 200 0 5 Μ L 3.8 31 104 2 분 10 초 2 96-잘 셀 문화 플레이트 200 200 100 5 Μ L 3.8 31 200 3 분 45 초 2 96-잘 셀 문화 플레이트 500 500 100 5 Μ L 7.4 60 200 4 분 15 초 표 4: 첨가제 검열을 위한 microsyringe 기반의 nanoliter 디스펜서에서 사용할 수 있는 프로그램. 8 잘 스트립의 각 음에 샘플의 필요한 볼륨은 다음과 같이 계산 됩니다: 죽은 볼륨 + 12 x 크기를 드롭. 스트립 (2 µ L 5 µ L)의 2 종류가 있다. 죽은 볼륨은 2 µ L 우물 (포함 하는 수 있습니다 실제로 3.2 µ L 최대) 0.8 µ L 및 1.4 µ L 5 µ L 우물 (7.5 µ L 최대.). 필요한 단백질의 총 볼륨입니다: 8 x 볼륨 스트립 (라운드-최대 값)의 잘. 96-잘 셀 문화 접시의 V 자형 우물의 죽은 볼륨 2.5 µ L입니다. Microsyringes의 필요한 수는 8 + 96 = 104; (8 + 2 x 96 = 200) 선택 된 프로그램에 따라 다릅니다. 프로토콜 1 동안 첨가제와 함께 조건의 희석 때문에 조건이 처음 보다 비례적으로 높은 농도에 준비를 해야 합니다. 최종 농도 증가 계산 된 마지막 볼륨에 물의 최종 추가 감소 함으로써 가장 쉽게 이루어집니다. 이 후, 하나 단순히 진행 정상적인 세트를 상태와 샘플 (예를 들어, 100 nL 단백질 + 이미 첨가제와 혼합 100 nL 조건) 방울의. 프로토콜 (예를 들어, 200 nL 단백질 + 200 nL 조건 + 100 nL 첨가제) 2는 단순히 추가 첨가제 화면의 볼륨 변화 하 여 첨가제의 다른 농도에서 심사를 촉진 한다. 프로토콜 2 방울 (어떤 결정을 변경할 수 있습니다)의 희석 다소 의미 합니다. 시스템 2에서에서 액체 처리기 12 팁에서 충분 한 상태를 발음 하 고 8 aliquots 96 잘 접시의 저수지에 분배 하는 데 사용 수 ( 프로토콜, 단계 2.2.2 참조),이 단계 수 있습니다 물론 멀티 채널 피 펫 ( 와 수동으로 할 수 있지만 그림 4). (나중에 다른 첨가제 스크린 테스트)을 액체 처리기를 사용 하 여 동일한 조건으로 한 번에 여러 접시를 채울 수 있습니다. 2 접시를 준비할 때 적어도 23 mL로 시 약 용기를 채우십시오. 3 접시를 준비할 때 적어도 31 mL로 시 약 용기를 채우십시오. 5. 결정 화 접시와 관련 된 장치 안정적이 고 효율적인 자동된 결정 화 실험을 사용할 수 있는 특성을 제공 하는 두 MRC 앉아 드롭 증기 확산 결정 화 접시 (96-2 드롭 잘하고 48-잘 1-드롭, 그림 5A 와 그림 5B)의 디자인 특히 위 우물의 구형 모양와 방울의 중심으로 하는 경우 정확한 분배 하 고 또한 원심 분리를 용이 하 게 저수지의 약간의 V 자형이 필요 합니다. 또한, 위-웰 스 (폴리머는 자외선 UV 흡수 또는 형광 결정23의 탐지를 위해 전송 가능)는 stereomicroscope에서 최적의 조명 렌즈 효과가 있다. 사용자 지정 인감 (그림 5C) 드롭 결정 화 실험 접시 nanoliter 디스펜서 (프로토콜 표시 되지 않음)를 사용 하 여 두 가지 유형의 내 걸려 설정 수 있습니다. 마지막으로, 모두 MRC 접시 동일한 외부 차원 및 테두리가 있다. 테두리 제거 하기 위해 수동으로 배치/씰링 테이프 튀는 액체 없이 사용 되는 우리의 맞춤식 플레이트 홀더 (그림 5D)의 홈에 맞는. 그림 5: LMB에는 MRC 결정 화 접시와 관련 된 장치 개발. (A) A1-96 잘 접시의 코너. 저수지 (직사각형) 결정 화 음, 두 개의 구면 위 오른쪽에 우물의 왼쪽에 있다. 치수는 밀리미터에 있습니다. (B) A1-48-잘 접시의 코너. 저수지는 잘 (1 큰 위-잘만)의 오른쪽에 있습니다. (C) MRC 매달려 드롭 인감. (D) 사내 사용자 지정 접시 홀더. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 6. 단백질 결정 그림 6 우리의 자동화 프로토콜 얻은 유용한 결정의 예를 보여줍니다. 그림 6: 크리스탈 얻은 다음 자동된 프로토콜을 포함 하는 작은 물방울의 현미경 빛. (A, B) 2와 완벽 하 게 준비 하는 판에 OmpF 및 MreB의 초기 화면에서 크리스탈 자동화 시스템 ( 프로토콜 섹션 1.1과 1.2, 조건을 참조 하십시오: LMB07 잘 a 4와 LMB20 D12, 각각, 방울의 크기는 100 nL 단백질 + 100 nL 조건의 일 Andrzej Szewczak, LMB)24. (C, D) 4 구석 방법으로 초기 조건의 최적화 전후 도메인 결정을 바 (단계 2.1, LMB02 B6, 1000 nL + 1000 nL, 미 발표 작품의 레오나르도 알 메 이다-수 자, 좌). (E, F) 인간 다 1 N 맨끝 도메인 결정 전과 4 코너 방법으로 초기 조건의 최적화 후의 무거운 체인 (LMB20 E6, 200 nL + 200 nL, 다음 500 nL + 500 nL, 미 발표 작품의에 드가 모 랄 레 스-리오스, 좌). (G, H) 첨가제 검 조건의 최적화 전후 요소 D 크리스탈을 보완 (단계 2.2, 사내 사용자 정의 화면, 200에서에서 초기 조건 nL + 200 nL, 96-조건 추가 화면에서 추가 D6 되지 않은 마 티아 스 바 우 어의 작품 LMB)입니다. (I, J) 바이러스 성 봉투 당단백질25 결정 첨가제 검 조건의 최적화 전후 (단계 2.3, LMB20 a 2, 150 nL + 150 nL, 다음 200 nL 200nL + 100 nL 첨가제 E5 96 조건 추가 화면에서 되지 않은 Yorgo의 작품 Modis, 캠브리지 대학, 영국). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.