Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

Fabrice Gorrec; Jan L&#246;we

doi:10.3791/55790

JoVE Journal > Biochemistry

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Bioquímica

Automatizzato di protocolli per cristallizzazione macromolecolare al MRC Laboratorio di biologia molecolare

Published: January 24, 2018

doi:

10.3791/55790

Fabrice Gorrec¹, Jan Löwe¹

¹Laboratory of Molecular Biology,Medical Research Council

Summary

Sistemi automatizzati e protocolli per la preparazione sistematica di un gran numero di schermi e goccioline di cristallizzazione nanolitro per gli esperimenti di diffusione del vapore sono descritti e discussi.

Abstract

Quando si ottengono cristalli di alta qualità che diffrangono i raggi x, la struttura di cristallo può essere risolto a vicino a risoluzione atomica. Le condizioni di cristallizzare le proteine, DNA, RNA e loro complessi possono tuttavia non essere previsto. Impiegando un’ampia varietà di condizioni è un modo per aumentare il rendimento dei cristalli di diffrazione di qualità. Due sistemi completamente automatizzati sono stati sviluppati presso il MRC Laboratorio di biologia molecolare (Cambridge, Inghilterra, MRC-LMB) che facilitano la selezione di cristallizzazione contro 1.920 condizioni iniziali di diffusione del vapore in goccioline nanolitro. Inoltre sono stati sviluppati protocolli semi-automatici per ottimizzare le condizioni modificando le concentrazioni dei reagenti, il pH, o con l’introduzione di additivi che potenzialmente migliorare le proprietà dei cristalli risultanti. Tutti i protocolli corrispondenti saranno descritti in dettaglio e brevemente discussi. Presi insieme, esse consentono di cristallizzazione macromolecolari altamente efficiente e conveniente in una struttura multi-utente, dando il users controllo sui parametri chiave dei loro esperimenti.

Introduction

Cristallografia a raggi x si applica estesamente per avanzare ulteriormente la nostra comprensione dei meccanismi biologici e malattia a livello atomico e successivamente assistere approcci razionali di drug discovery¹. Per questo, purificato e campioni macromolecolari (2-50 mg/mL) concentrato di proteine, DNA, RNA, altri ligandi e loro complessi sono sperimentati per la loro propensione a forma ordinato reticoli tridimensionali attraverso cristallizzazione²^,³ ^,⁴. Quando si ottengono cristalli di alta qualità che diffrangono i raggi x, la struttura di cristallo può essere risolto a vicino a risoluzione atomica⁵^,⁶. Fondamentalmente, le condizioni a cristallizzare un romanzo campione non possono essere previsto e la resa dei cristalli di alta qualità è di solito molto bassa. Una ragione di fondo è che molti campioni di interesse hanno proprietà biochimiche impegnativa, che li rendono instabile sulla scala cronologica corrispondente per la cristallizzazione (in genere pochi giorni). Infine, il processo è aggravato dal tempo richiesto per produrre campioni e varianti di campione e per ottimizzare la loro purificazione e cristallizzazione⁷^,⁸.

Una condizione di cristallizzazione è una soluzione con un precipitante che riduce la solubilità del campione e condizioni contengono spesso anche buffer e additivi. Centinaia di tali reagenti è adatti per modificare i parametri degli esperimenti di cristallizzazione come hanno scarsa propensione ad interferire con l’integrità del campione (ad esempio proteine o acidi nucleici dispiegarsi). Mentre testato milioni di combinazioni di reagenti di cristallizzazione non è fattibile, test diversi per molti kit di screening – formulato con varie strategie⁹^,¹⁰ – è possibile con le prove miniaturizzate e protocolli automatizzati. In questa prospettiva, la tecnica più favorevole è probabilmente diffusione del vapore con le goccioline di nL 100-200 che si siede su un piccolo pozzo sopra un serbatoio contenente la condizione di cristallizzazione (25-250 µ l), implementata in cristallizzazione specializzati piastre¹¹ ^, ¹². il campione della proteina e la condizione sono spesso combinati in un rapporto di 1:1 per un volume totale di 200 nL durante l’impostazione le goccioline in superiore-pozzetti. Cristallizzazione della proteina nanolitro robotica può essere implementato con tecniche alternative e piatti come sotto-l’olio lotto¹³ e la fase cubica lipidico¹⁴ (quello più recente applicato specificamente a proteine trans-membrana che sono molto scarsamente solubile in acqua).

L’impianto di cristallizzazione a MRC-LMB è stato avviato all’inizio del 2000 e un riassunto iniziale dei nostri protocolli automatizzati è stato presentato nel 2005¹⁵. Un’introduzione storica alla cristallizzazione della proteina è stata presentata e anche un contorno dei vantaggi della robotica nanolitro approccio (quindi un nuovo approccio alla sperimentazione sistematica). Dal macromolecolare cristallizzazione è essenzialmente un processo stocastico con molto poco o nessun utile informazione preventiva, che impiegano una vasta gamma di condizioni iniziali (adatte) aumentare il rendimento di qualità diffrazione cristalli¹⁶. Inoltre, un vantaggio spesso trascurato di un grande schermo iniziale è quello di ridurre in modo significativo la necessità di ottimizzazione dei campioni e cristalli in molti casi. Naturalmente, uno potrebbe essere ancora necessario procedere con l’ottimizzazione di alcune condizioni iniziali più tardi. In genere, la concentrazione dei reagenti e il pH quindi sono studiato sistematicamente. Altri reagenti possono anche essere introdotto nelle condizioni ottimizzate di modificare ulteriori parametri di cristallizzazione. Certamente, si dovrebbe tentare la cristallizzazione con un campione preparato al momento, quindi i protocolli corrispondenti devono essere semplice e disponibile ogni volta.

Qui, due completamente automatizzato sistemi progettati presso il MRC-LMB (sistemi 1 e 2) e i protocolli corrispondenti sono descritti. L’applicazione principale di questi due sistemi è iniziale di screening di diffusione del vapore nella goccia cristallizzazione piastre di seduta. Sistema 1 integra un gestore di liquido, un carosello automatizzato al magazzino Piastre, una stampante a getto d’inchiostro per l’etichettatura di piastra e un copripiastra adesivo. Sul sistema 1, 72 piastre da 96 pozzetti sono riempite con i kit di screening disponibile in commercio (80 µ l di condizione trasferito al serbatoio da un volume iniziale di 10 mL in provette), etichettate e sigillate. Le piastre vengono quindi archiviate in un’incubatrice di 10 ° C, dove sono disponibili per gli utenti in qualsiasi momento (come schermate iniziali chiamati ‘Piastre LMB’).

Sistema 2 integra un gestore di liquido, un dispenser nanolitro e un copripiastra adesivo. Sul sistema 2, seduta goccioline (nL 100-1.000) per gli esperimenti di diffusione del vapore sono prodotte mediante la combinazione di condizioni e il campione nei pozzetti-superiore di 20 48 o 96 pozzetti piastre pre-riempita con condizioni. Ciò significa 1.920 screening iniziale condizioni sono sperimentate quando si utilizza 20 piastre di LMB sul sistema 2.

Robot sono utilizzati anche singolarmente per l’ottimizzazione delle condizioni selezionate, e inoltre vengono descritti i protocolli semi-automatici corrispondenti. Il metodo 4-angolo¹⁷ è impiegato abitualmente per produrre schermi di ottimizzazione. Il protocollo corrispondente richiede innanzitutto la preparazione manuale di 4 soluzioni (‘A, B, C e D’). Due gradienti lineari delle concentrazioni (per due agenti principali di cristallizzazione) sono poi automaticamente generati direttamente nei serbatoi di una piastra di cristallizzazione. Per questo, un gestore di liquido basato su siringa eroga le soluzioni 4 angolo a differenti rapporti.

Per ottimizzare ulteriormente una condizione, uno può impiegare schermi additivi che potenzialmente migliorare le proprietà di risultante cristalli¹⁸. Due approcci sono disponibili per lo screening di additivo: un protocollo a partire con additivi erogati nei serbatoi delle piastre di cristallizzazione prima dell’impostazione le goccioline (protocollo 1) e un altro protocollo dove viene erogata la schermata additiva direttamente le goccioline (protocollo n. 2).

Altri sviluppi utili che sono stati avviati presso il MRC-LMB per facilitare la cristallizzazione macromolecolari automatizzati, inoltre sono presentati. Essenzialmente, piastre di cristallizzazione e dispositivi associati come un impilabile società di biomolecolari di Screening (SBS) coperchio che minimizza l’evaporazione delle condizioni quando si utilizza il sistema 2.

Per brevità, si presume che gli utenti hanno familiari con le funzioni di base e la manutenzione di dispenser nanolitro, stampante a getto d’inchiostro e il copripiastra adesivo. Salvo diversa indicazione, le piastre sul ponte dei robot sono posizionati tali che il pozzetto A1 (A1-corner) è verso l’angolo posteriore sinistro di un elemento portante del piatto.

Protocol

1. i due sistemi (screening iniziale) completamente automatizzati Sistema 1: preparazione di 72 tavole di 96 pozzetti cristallizzazione riempito con screening Kit (piastre di LMB) Prima di eseguire la procedura, assicurarsi che il robot del sistema vengono inizializzati e il loro software di controllo è aperto. Accendere il refrigeratore del vettore tubo di raffreddamento circa 30 minuti prima che verrà avviato il programma principale. Sistemare una piastra di prova sul supporto motorizzato SBS del copripiastra. Eseguire il copripiastra e controllare che la pellicola viene applicata correttamente. Ripetere questa prova altre due volte per verificare che il copripiastra è pronto. Quindi, aggiungere 20 L di acqua deionizzata al contenitore principale del gestore liquido. Scollegare gli inserti di accoppiamento dal contenitore piccolo (etanolo al 20% soluzione di risciacquo) e collegare gli inserti al contenitore principale. Digitare il nome appropriato (tabella 1) sul touchscreen della stampante a getto d’inchiostro. Quindi, aprire e chiudere lo sportello di carosello per innescare la rotazione della giostra. Aprire la porta quando si presenta la prima pila. Caricare completamente la prima pila con 22 piastre di cristallizzazione, ciascuno con esposto a colonna 1 fuori. Caricare completamente le due pile nello stesso modo. Caricare le rimanenti 6 piastre nelle posizioni più alte dello stack di quarto. Quindi, chiudere lo sportello di carosello. Verificare che il display del refrigeratore indica 14 ° C. Delicatamente e ripetutamente invertono i kit di screening selezionati per 1 minuto. Quindi, aprire il pannello frontale del gestore liquido. Aprire le provette e metterli nel supporto di raffreddamento secondo il layout standard di 96 pozzetti (A1, A2, ecc.). Piazzando ogni tubo nel supporto, posizionare il coperchio su un vassoio nello stesso layout di 96 pozzetti. Controllo incrociato il tubo posizioni e garantire che tutti i tubi sono di livello e si stabilirono nel vettore. Quindi, chiudere il pannello anteriore. Nella finestra del software gestore liquido ‘Avvio’, selezionare ‘Esegui manutenzione’ e aprire il programma di lavaggio. Eseguire il programma per svuotare l’etanolo al 20% dal sistema e per lavare i lati esterni delle punte di erogazione del liquido. Quando lo svuotamento è completo, fare clic su ‘Annulla’ per tornare a ‘Avvio’. Selezionare ‘Esegui un processo esistente’ e fare clic su ‘Avvia la selezione’. Aprire il programma ‘MRC kit dispensing’. Compilare ’18’ per ‘Istanze’ nella configurazione dello schermo ed eseguire il programma. Monitorare il sistema in quanto le prime quattro piastre sono etichettate, riempite e sigillate. Una volta che tutti i 72 tavole sono stati preparati e inseriti nuovamente nella giostra, passare gli inserti di accoppiamento dal contenitore principale per il piccolo contenitore. Eseguire il programma ‘Start up flush’ (Vedi punto 1.1.10). Spegnere il refrigeratore e scartare il vuoto tubi kit di screening. Rimuovere con cautela il 72 tavole preparate dalla giostra. Scartare le piastre riempito in modo errato o mal sigillato. Conservare le piastre di ready-to-use a 10 ° C. Sistema 2: impostazione le goccioline di cristallizzazione (proteina nL 100 + 100 nL condition) da un singolo campione in 20 piastre di LMB In primo luogo, assicurarsi che robot del sistema sono su, il dispenser nanolitro viene inizializzato con il suo software open, e gestione del metodo del gestore dei liquidi è aperto. Accendere il vettore conetti di raffreddamento circa 15 minuti prima che verrà avviato il programma principale. Sistemare una piastra di prova sul supporto motorizzato SBS del copripiastra. Eseguire il copripiastra e verificare che la piastra è opportunamente sigillata. Testare il copripiastra tre volte. Quindi, eseguire il dispenser nanolitro per impostare 100-nL gocce della soluzione di test in una piastra di prova. Controllare al microscopio che le goccioline siano impostate correttamente. Chiudere il software di erogatore nanolitro e rimuovere il blocco striscia-porta dal ponte. Quindi inserire il porta targa personalizzata (vedere Risultati rappresentante: cristallizzazione dispositivi sviluppati presso il LMB) la piastra LMB con il più alta quantità relativa di reagenti volatili nelle sue condizioni (tabella 1). Rimuovere la pellicola adesiva dalla piastra. Aprire il pannello frontale di liquido gestore e posizionare la piastra non bloccata sul ponte, sul retro il primo elemento portante scorrevole (vettori di scorrimento può essere tirato fuori per facilità di accesso). Coprire la piastra con un coperchio di alluminio SBS. Saldare il coperchio verso l’angolo posteriore sinistro del vettore applicando leggera pressione verso l’angolo opposto del coperchio. Rompere il sigillo, caricare i supporti scorrevoli e coprire il restante 19 tavole nello stesso modo, lavorando da più di meno volatile condizioni. Una volta che il vettore conetti di raffreddamento è a 4 ° C, come indicato da una luce verde, togliendo la copertura. Tagliare il coperchio di una microprovetta contenente (almeno) 440 µ l di campione della proteina (tabella 2). Assicurarsi che il campione non abbia schiuma sopra il menisco, come ciò interferirà con il sistema di rilevamento di liquidi. Inserire il tubo nella posizione 1 del vettore conetti di raffreddamento. Posizionare un piatto PCR sul ponte liquido gestore davanti il vettore di movimento piastra adattatore. Quindi, chiudere il pannello anteriore. Dopo aver caricato il deck, assicurarsi che il deck di erogatore nanolitro è chiaro del blocco porta-striscia e che i vettori sul retro gli stack di punta 50-µ l sono chiari dei coperchi in alluminio SBS. Nell’interfaccia liquido gestore ‘Metodo Management’, selezionare ‘Setup piastre’. L’inizializzazione di entrambi i sistemi di controllo e immettere i parametri di esecuzione. Seguire le linee guida dell’interfaccia di gestione del metodo (prompt, figure e un sistema di suggerimento-gestione aiutare con preparazione). Controllare che tutti i necessari componenti sono pronti e quindi avviare il processo. Monitorare il sistema come il dispenser nanolitro imposta le gocce nel primo piatto e il copripiastra successivamente sigilla la piastra. Una volta che tutti i 20 piastre sono state preparate con le goccioline di cristallizzazione e automaticamente restituite ai vettori scorrevoli, aprire il pannello anteriore e rimuovere delicatamente le piastre. Controllare che le piastre siano correttamente sigillate prima di riporli per cristallizzazione. Pulire i coperchi SBS con una soluzione di etanolo al 20% prima di metterli sul lato sinistro del gestore liquido per l’archiviazione. Scartare la piastra PCR e la microprovetta. Spegnere il vettore conetti-raffreddamento e spazzare via l’acqua di condensa. Lasciare un tovagliolo di carta sopra la superficie del radiatore di assorbire ulteriore condensazione. Ricollocare il coperchio del vettore, quindi chiudere il pannello anteriore. 2. ottimizzazione delle condizioni Basato su siringa liquido gestore: producendo due gradienti lineari delle concentrazioni nei serbatoi di una piastra di cristallizzazione (il metodo 4-angolo). In primo luogo, assicurarsi che il gestore di liquido è su e inizializzato con il suo software aperto. La ‘pendenza’ scheda: aprire il programma richiesto, selezionare il tipo di piastra di cristallizzazione e il volume finale nei serbatoi (tabella 3). L’impostazione avanzata per ‘max colpo vol’ dovrebbe essere abbassata da 6.000 a 3.000 quando si utilizzano soluzioni che contengono [isopropanolo] > 10% v/v e [MPD] > 20% v / v. Preparare le siringhe. Mettere un pistone in ogni siringa (estremità appuntite verso il basso) e inserire il retro delle siringhe nelle scanalature designate sotto la testa del robot. Una siringa di torsione in senso orario per bloccarlo in posizione (il programma verrà avviato solo con tutte le siringhe necessarie collegate correttamente). Preparare le depressioni. Rimuovere il telaio in acciaio inox e inserire le depressioni. 4 posizioni a sinistra corrispondono ai 4 angoli A, B, C, D. passare alla scheda di SET UP che Visualizza i volumi delle soluzioni richieste in ogni siringa (in tabella 3, 0,5 mL di volume morto è stato aggiunto per i volumi visualizzati). Versare le soluzioni angolari nel loro rispettivi depressioni e posizionare il telaio torna sul ponte (la cornice tiene in posizione con 2 piccoli magneti che si trova nella parte anteriore del ponte). Un modo alternativo di procedere con questo passaggio è quello di versare le soluzioni in depressioni, quando già si trovano sul ponte. Posizionare la piastra di cristallizzazione del supporto motorizzato di SBS. Fare clic su ‘Aspirare’ e attendere che questo passaggio essere completata (quando pistoni fermato il loro modo). Passare alla scheda ‘Esegui’ ed eseguire il programma. A completamento del programma, torna alla scheda di SET UP e fare clic su ‘Rimuovi’: il sistema elimina l’inceppo le siringhe da avanzi soluzioni e quindi solleva completamente i pistoni. ‘Eliminare’ può essere richiesto invece di ‘Rimuovi’; questo lascerà i pistoni nella posizione inferiore, pronta aspirare più soluzioni con le siringhe stesse. Togliere le siringhe girandole in senso antiorario. Scartare le siringhe e le depressioni nell’apposito contenitore (o sciacquare con acqua deionizzata e poi soluzione al 20% v/v etanolo per il riutilizzo). Sigillare la piastra e posizionatelo sopra il mixer di micropiastre per 3 min a 1.000 giri/min, o 10 min quando soluzioni altamente viscose sono essere mescolati. Il piatto è pronto per l’impostazione di goccioline di cristallizzazione sul dispenser nanolitro. Additivo di screening protocollo n. 1 (impostazione le goccioline di cristallizzazione in una piastra 96 pozzetti cristallizzazione pre-riempita con additivo schermo) In primo luogo, preparare la condizione con concentrazioni iniziali dei reagenti sono aumentate del 10% (min. vol. 15 mL durante il trasferimento la condizione da un contenitore sullo schermo con il gestore di liquido additivo). Assicurarsi che il gestore di liquido è pronto per funzionare. Aprire il programma ‘Aggiungi schermo agli additivi’ per una singola piastra (inserire volume nei serbatoi: ‘µ l 72’). Di richiami, figure e una suggerimento-gestione sistema (punte di 12 x 1.000 µ l richiesti) guida con assicurandosi che il robot è pronto a funzionare secondo le selezioni. Recuperare la schermata additiva dall’incubatrice-20 ° C e rimuovere immediatamente proprio sigillo di alluminio (uso il portatarga), quindi posizionare la piastra sul ponte del gestore liquido. Il programma opera secondo un layout verticale (la piastra è posta con l’A1-angolo situato nella parte anteriore sinistra del vettore). Inoltre posto anche il contenitore riempito con la condizione. Eseguire il programma. Una volta che i serbatoi della piastra sono stati riempiti, posizionatelo sopra l’agitatore per micropiastre ed eseguire il programma. Risciacquare il contenitore della condizione con deionizzata acqua e 20% di etanolo per il riutilizzo. Impostare le goccioline sul dispenser nanolitro. In primo luogo, dissigillare la piastra di cristallizzazione (uso il portatarga). Quindi, posto che la piastra e la proteina di 8 pozzetti striscia nella prima posizione del blocco porta-striscia. La scheda ‘Setup’ sul software di controllo vengono visualizzate le posizioni reali di ciascun componente sul ponte. Caricare ogni bene della striscia con il campione della proteina secondo la dimensione della goccia richiesta (tabella 4). Eseguire il programma per preparare le goccioline. A completamento del programma, rimuovere la piastra dal ponte e sigillarlo immediatamente (utilizzare il foglio sigillante, nastro adesivo largo 3 pollici). Eliminare la striscia nell’apposito contenitore. Valutare la dimensione, forma e centratura delle goccioline sotto il microscopio prima dello stoccaggio. Additivo di screening protocollo 2 (impostazione le goccioline di cristallizzazione in una piastra 96 pozzetti cristallizzazione con uno schermo di additivo riutilizzabile) In primo luogo, preparare lo schermo additivo: lasciare la piastra di coltura congelati 96 pozzetti cella corrispondente a scongelare a temperatura ambiente per 40 min. Poi, centrifugare la schermata additiva a 1.000 x g per 2 min. Preparare la condizione (min. vol. 15 mL durante il trasferimento la condizione da un contenitore sullo schermo con il gestore di liquido additivo). Riempire i serbatoi di una piastra a 96 pozzetti cristallizzazione con la condizione. Il gestore di liquido, procedere nello stesso modo come protocollo n. 1, punto 2.2.2, ma immettere ’80 µ l’ per il volume in serbatoi. Impostare le goccioline sul dispenser nanolitro con 3 componenti sul ponte (la piastra che contiene lo schermo additivo, insieme con la piastra di cristallizzazione e la striscia di 8 pozzetti proteina nella prima posizione del blocco porta-striscia, tabella 4). Sigillare la piastra di coltura cellulare contenente lo schermo con un foglio di alluminio e inserirlo nell’incubatrice-20 ° C. Valutare la dimensione, forma e centratura delle goccioline sotto il microscopio prima dello stoccaggio.

Representative Results

1. sistema 1 e piastre di LMB Figura 1A Mostra il sistema basato su un gestore di liquido di funzionamento con un sistema di liquido (acqua deionizzata) 1. Il liquido-sistema comprende un contenitore, una pompa, tubi, 8 siringhe dotate di valvole e 8 punte fisse. Le impostazioni della classe liquido sono state ottimizzate per aspirato/erogare una vasta gamma di soluzioni e multi-dispensare in 4 piatti (multi-dispensare richiede un relativamente grande eccesso di volume aspirato). Un contenitore di acqua 22 L e un contenitore più piccolo (5 L) con 20% v/v etanolo riposte sotto il sistema per alimentare il sistema di liquido. Ogni contenitore è dotato di due inserti di accoppiamento. Un inserto (colore blu) alimenta il sistema con liquido, l’altro (rosso) è un flusso-back per ridurre la pressione in eccesso. Dopo l’uso, lavaggio con acqua e poi soluzione 20% v/v etanolo previene la crescita microbica. Un’unità di raffreddamento (anche situata sotto il sistema) è collegata ad un trasportatore di raffreddamento tubo su misura. Sistema 1 è 2050 mm di larghezza, tra cui il carosello, 760 mm di profondità e 88 mm di altezza. Nella parte anteriore per il piano di lavoro che contiene l’unità di controllo della stampante a getto d’inchiostro e il copripiastra adesivo è necessaria un’ulteriore 550 mm. Spazio aggiuntivo è necessario anche accanto al sistema per il PC di controllo. Il programma per produrre 72 tavole pre-riempite (cioè 18 turni di 4 piatti) prende 3 h e 50 min. Figura 1B è un primo piano del ponte principale che è attrezzato con 8 fisse consigli (Figura 1) montati su un braccio di pipettaggio automatizzato, un secondo braccio con una pinza, una stazione di lavaggio di punta, i vettori di 2 x 4 posizioni per piastre di Small Business Server e il supporto tubo di raffreddamento. Il programma principale elabora 4 piastre in un momento che vengono prelevati automaticamente il carosello e inseriti sul ponte dove sono pieni di condizioni di cristallizzazione (80 µ l in serbatoi, Figura 1). Livelli dei liquidi vengono rilevati automaticamente come le punte sono conduttive. Mentre il gestore liquido eroga condizioni in una serie di piastre, un altro set di piatti vuoti è tolto dalla giostra, etichettato e collocato sul ponte principale. Un supporto su misura piccolo e nel pannello posteriore del gestore liquido erano tenuti a posizionare la testina della stampante e il suo sensore sul retro del ponte principale. 8 punte sono svuotate e lavate con acqua dal contenitore principale dopo ogni passaggio di erogazione che si compone di 4 aliquote nelle colonne corrispondenti dei serbatoi. Dopo che sono stati riempiti 4 piastre, sono automaticamente sigillati e collocati nella loro posizione originale nel carosello. Il copripiastra è innescato da un driver specifico (chiamato dal software di controllo). Il sigillante utilizza un rotolo di 3 pollici largo nastro adesivo che viene applicato ad una piastra con rulli sotto pressione meccanica. A completamento del programma, le piastre preriempite sono rimossi manualmente dalle pile carosello e memorizzate in un incubatore di 10 ° C che si trova all’interno dell’impianto. Figura 1 : Riempito i serbatoi con kit di screening iniziale. Panoramica (A) il sistema completamente automatico 1. La giostra è un’unità separata automatizzata con stack di piastra ed è ospitato in un pozzo fatto di acrilici trasparente fogli sul lato destro del ponte principale. (B), il ponte principale del gestore liquido in funzionamento con (a) il vettore tubo di raffreddamento (collegato ad un’unità agghiacciante sotto, non mostrato), (b), il digiuno stazione lavaggio (collegato al drenaggio, non mostrato), (c), il braccio di pipettaggio riempito 8 serbatoi di una piastra 96 pozzetti cristallizzazione, (d) il braccio pinza portando un piatto pieno sulla (e) il supporto SBS motorizzato del copripiastra. Nella parte posteriore del ponte è testa (f) la stampa della stampante a getto d’inchiostro collegato a (g) l’unità di controllo a getto d’inchiostro sotto il sigillante. (C) A etichettato piastra (nome dello schermo) e data di produzione siano riempite con condizioni di cristallizzazione da 8 conduttori fissata suggerimenti politetrafluoroetilene-rivestito in acciaio inox. (D) sezione trasversale di una cristallizzazione sigillata bene. Il serbatoio contiene 80 µ l di condizione di cristallizzazione (mentre la tomaia ben è vuota). Serbatoio e superiore-pozzo di profondità specifiche sono espresse in millimetri. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. La tabella 1 Mostra le diverse formulazioni per i kit di screening disponibile in commercio in provette. I kit vengono utilizzati per riempire i serbatoi delle piastre a 96 pozzetti cristallizzazione (LMB01-LMB22) su base regolare con il sistema 1. Nome del piatto Nome Kit fornitore numero di catalogo tubi Descrizione di base LMB01 Schermo di cristallo 1 Ricerca di Hampton HR2-110 48 Matrice sparsa (pH 4.6-8.5) Schermo di cristallo 2 Ricerca di Hampton HR2-112 48 Campionamento stocastico (pH 4.6-9.0) LMB02 Procedura guidata 1 Verian 1009530 48 Campionamento stocastico (pH 4.5-10.5) Mago 2 Verian 1009531 48 Campionamento stocastico (pH 4.5-10.5) LMB03 Solfato di ammonio di griglia schermo Ricerca di Hampton HR2-211 24 Schermata di griglia, [AmS] = 0,8-3,2 M e buffer pH 4.0-9.0 Griglia schermo PEG/LiCl Ricerca di Hampton HR2-217 24 Schermata di griglia, [PEG 6000] = 0-30 %w/v, conc. LiCl = 1,0 M e buffer pH 4.0-9.0 Schermata di rapido Ricerca di Hampton HR2-221 24 Schermata di griglia, [NaKPO4] = 0.8-1.8 M a pH 5.0-8.2 Cloruro di sodio di griglia schermo Ricerca di Hampton HR2-219 24 Schermata di griglia, [NaCl] = 1.0-4.0 M e buffer pH 4.0-9.0 LMB04 Schermata di griglia PEG 6000 Ricerca di Hampton HR2-213 24 Schermata di griglia, [PEG 6000] = 5-30 %w/v e buffer pH 4.0-9.0 Schermata di griglia MPD Ricerca di Hampton HR2-215 24 Schermata di griglia [MPD] = 10-65 %w/v e buffer pH 4.0-9.0 MemFac Ricerca di Hampton HR2-114 48 Matrice sparsa per le proteine di membrana (pH 4.6-8.5) LMB05 PEG-Ion Ricerca di Hampton HR2-126 48 Schermata di griglia, [PEG 3350] = 20 %w/v e vari sali a 0,2 M (nessun buffer) Natrix Ricerca di Hampton HR2-116 48 Fattoriale incompleta (pH 5,6-8.5) LMB06 Schermo a cristalli Lite Ricerca di Hampton HR2-128 48 1 schermo cristallo con metà delle concentrazioni precipitante originale Lite schermo personalizzato Dimensioni molecolari n/a 48 Condizioni supplementari con basse concentrazioni precipitante LMB07 Procedura guidata Cryo 1 Verian 1009536 48 Campionamento stocastico con condizioni prelevate utilizzando basso MW pioli (pH 4.5-9,4) Cryo guidata 2 Verian 1009537 48 Campionamento stocastico con condizioni prelevate utilizzando basso MW pioli (pH 4.5-10.1) LMB08 JBS1 JenaBioScience CS – 101L 24 Incompleta fattoriale basata sulle varie spine (pH 4.6-9.0) JBS2 JenaBioScience CS – 102L 24 Incompleta fattoriale basato su PEG 4000 (pH 4.6-8.5) JBS3 JenaBioScience CS – 103L 24 Incompleta fattoriale basato su PEG 4000 (pH 4.6-8.5) JBS4 JenaBioScience CS – 104L 24 Incompleta fattoriale basato su medie MW pioli (pH 6,5-8,5) LMB09 JBS5 JenaBioScience CS – 105L 24 Incompleta fattoriale basato su pesanti MW pioli (pH 6.5-9.5) JBS6 JenaBioScience CS – 106L 24 Incompleta fattoriale basato su AmS (pH 4.6-8.5) JBS7 JenaBioScience CS – 107L 24 Incompleta fattoriale basato su MPD (pH 4.6-8.5) JBS8 JenaBioScience CS – 108L 24 Incompleta fattoriale basato su MPD ed etanolo (pH 4.6-8.5) LMB10 JBS9 JenaBioScience CS – 109L 24 Incompleta fattoriale basata sulla comune sali e 2-propanolo (pH 4.6-8.5) JBS10 JenaBioScience CS – 110L 24 Incompleta fattoriale basata sui sali comuni (pH 4.6-8.5) Chiara strategia Screen 1 pH 4,5 Dimensioni molecolari MD1-16LMB 24 Schermata di griglia con vari piolini Chiara strategia Screen 1 pH 5,5 Dimensioni molecolari MD1-16LMB 24 Schermata di griglia con vari piolini LMB11 Chiara strategia Screen 1 pH 6.5 Dimensioni molecolari MD1-16LMB 24 Schermata di griglia con vari piolini Chiara strategia Screen 1 pH 7.5 Dimensioni molecolari MD1-16LMB 24 Schermata di griglia con vari piolini Chiara strategia Screen 1 pH 8,5 Dimensioni molecolari MD1-16LMB 24 Schermata di griglia con vari piolini Chiara strategia Screen 2 pH 4,5 Dimensioni molecolari MD1-16LMB 24 Schermata di griglia con vari piolini LMB12 Chiara strategia Screen 2 pH 5,5 Dimensioni molecolari MD1-16LMB 24 Schermata di griglia con vari piolini Chiara strategia schermo 2 pH 6.5 Dimensioni molecolari MD1-16LMB 24 Schermata di griglia con vari piolini Chiara strategia Screen 2 pH 7.5 Dimensioni molecolari MD1-16LMB 24 Schermata di griglia con vari piolini Chiara strategia schermo 2 pH 8,5 Dimensioni molecolari MD1-16LMB 24 Schermata di griglia con vari piolini LMB13 Indice Ricerca di Hampton HR2-144 96 Piccoli schermi sparsi matrix e griglia (pH 3.0-9.0) LMB14 SaltRX 1 Ricerca di Hampton HR2-107 48 Sali di schermo di griglia tra cui 22 unico contro concentrazione salina e pH (4.1-9.0) SaltRX 2 Ricerca di Hampton HR2-109 48 Sali di schermo di griglia tra cui 22 unico contro concentrazione salina e pH (4.1-9.0) LMB15 MemStart Dimensioni molecolari MD1-21 48 Matrice sparsa per le proteine di membrana (pH 4,0-10,0) MemSys Dimensioni molecolari MD1-25 48 Schermata di griglia per le proteine di membrana (principalmente pioli, pH 3,5-9,5) LMB16 JCSG + Qiagen 130720 96 Matrice sparsa (pH 4,0-10,0) LMB17 Schermo di MORPHEUS Dimensioni molecolari MD1-46 96 Schermata di griglia tra cui miscele di additivi e prelevate le condizioni (pH 6,5-8,5) LMB18 Schermo minimo pi JenaBioScience CS-127 96 Fattoriale incompleta (pH 4.0-9.5) LMB19 Pi-PEG schermo JenaBioScience CS-128 96 Fattoriale incompleta per proteine di membrana (pH 4.8-8.8) LMB20 Schermo di MORPHEUS II Dimensioni molecolari MD1-91 96 Schermata di griglia tra cui miscele di additivi (atomi pesanti) e prelevate le condizioni (pH 6,5-8,5) LMB21 Schermo di cristallizzazione di LMB Dimensioni molecolari MD1-98 96 Matrice sparsa tra cui condizioni selezionate da pubblicazioni di LMB LMB22 Schermo di MORPHEUS III Dimensioni molecolari n/a 96 Schermata di griglia tra cui miscele di additivi (composti farmaceutici) e prelevate le condizioni (pH 6,5-8,5) Tabella 1: formulazioni dei kit trovato in placche LMB. Ogni kit di screening commerciale consiste di 24/48/96 condizioni inizialmente in provette. Le piastre LMB sono immagazzinate in incubatrici di 10 ° C che si trova all’interno della struttura dove sono disponibili per gli utenti in qualsiasi momento. 2. sistema 2 e requisiti per l’impostazione le goccioline La Figura 2A Mostra il sistema 2 Basato su un gestore liquido19 operanti con puntali monouso e volumetrici. I puntali monouso sono forniti in impilabile rack adatto per movimentazione automatizzata. Un mazzo di 3 posizioni nanolitro erogatore20 è stato integrato sul lato destro del sistema. Aspirato/erogare sul dispenser nanolitro opera anche con spostamento positivo utilizzando microsyringes USA e getta (forniti in grandi bobine). Come un robot autonomo, un blocco di striscia porta estraibile viene utilizzato per caricare il campione della proteina. Per il processo completamente automatizzato, una piastra PCR a 384 pozzetti sostituisce lo striscia-titolare. Un simile copripiastra adesivo al sistema 1 è stato integrato sul lato sinistro. Il sigillante e il dispenser di nanolitro stare su tabelle di lavoro costruito su misura, sollevate in modo che la pinza principale raggiungere i vettori di piastra di questi due robot integrato (una finestra doveva essere tagliato in entrambi i pannelli laterali del gestore liquido per la pinza ottenere l’accesso di fuori il ponte principale). Il programma principale chiama driver specifici a grilletto nanolitro erogazione programmi e il sigillante a suo tempo. Il sistema 2 è 2.850 mm di larghezza, profondità 800 mm e 800 mm di altezza. Spazio aggiuntivo è necessario accanto il robot per la visualizzazione del controllo PC. Due bidoni dei rifiuti si trovano sotto il sistema di suggerimenti e di microsyringes scartati durante il processo (il PC di controllo viene memorizzato anche sotto). Una caratteristica importante del sistema 2 è il layout generale, che conserva permette di raggiungere facilmente i tre robot, in modo che possono essere utilizzati singolarmente per i protocolli di ottimizzazione descritti in precedenza, o altri protocolli descritti altrove come cristallizzazione delle proteine di membrana lipidica mesofasi21 e matrice casuale microseed22di screening. Figura 2B è un primo piano del mazzo che è dotato di un singolo braccio robotico. Il braccio si integra 12 sonde di pipettaggio indipendente e la pinza di controllo principale. Le posizioni delle sonde possono essere controllate individualmente in una direzione al fine di accedere ai diversi percorsi lungo l’asse tra le sonde o addirittura singoli tubi. Le sonde possono raccogliere o puntali monouso (1-12) o una coppia di piastra-spostamento adattatori. Due set di 4 pile contenenti 50 puntali monouso µ l sono inizialmente caricati. Livelli dei liquidi vengono rilevati automaticamente come le punte sono conduttive. Gli adattatori movimento piatto sono progettati con 2 perni tagliente sulla parte interna che formano una pinza opzionale quando necessario. Sul ponte principale è situata una microprovetta 24 posizioni raffreddamento carrier per il campione, anche se solo 1-2 posizioni sono usate qui. Inoltre, c’è un elemento portante per la piastra PCR e anche 2 vettori di deposito per coperchi SBS impilabile, Custom-Built (Figura 2). Infine, ci sono 4 vettori scorrevoli, ognuna con 5 posizioni per piastre di cristallizzazione (4 x 5 = 20 piastre). Figura 2 : Creazione di goccioline per gli esperimenti di diffusione del vapore. (A) Panoramica del sistema completamente automatizzato 2. (B), il ponte principale del gestore liquido in funzionamento con (un) il deposito vettori per pile di coperchi SBS, (b) l’impilabile suggerimenti, (c) il vettore di raffreddamento con un campione in conetti, (d) vettore per 2 piastra-movimento adattatori, (e), la piastra PCR per il trasferimento di piastre di proteina per il robot di movimentazione nanolitro, (f) 9 sigillata che sono stati collocati nelle loro posizioni iniziali, (g) la pinza opzionale rimuovendo il coperchio SBS del 10th piastra su per essere trasportati sul ponte del liquido gestore, (h), i prossimi 10 piastre per essere preparati con coperchi SBS sulla parte superiore, (io) la pinza principale che viene utilizzata per trasportare le piastre PCR e cristallizzazione, (j) il principale automatizzato braccio di integrare 12 sonde di pipettaggio (2 viene utilizzato per operare come pinza opzionale) e la pinza di presa principale e (k) il mazzo del nanolitro dispenser. (C) in-House personalizzato SBS coperchi in alluminio. I coperchi integrano un foglio di gomma per evitare l’evaporazione delle condizioni e due piccoli fori per essere accuratamente prelevati dalla pinza opzionale. (D) sezione trasversale di una cristallizzazione sigillato bene dove il serbatoio è riempito con una condizione e il superiore-pozzo contiene una gocciolina composto da sia il campione della proteina e la condizione. Perché il precipitante nella gocciolina è meno concentrato nella condizione, le concentrazioni di tutti i componenti nella goccia salire attraverso la perdita di acqua durante il processo di equilibrazione di diffusione del vapore (molto schematicamente rappresentato da una freccia). (E) micrografie luce di 100 nL e (F) 200 gocce nL prodotta dal nanolitro dispenser con una soluzione di test (20% v/v polietilenglicol 400, 0.001% w/v safranina come colorante rosso). La dimensione e la forma delle gocce possono variare in base alle proprietà antiolio della condizione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Il programma principale inizia con la pinza opzionale rimuovendo il coperchio SBS dal primo piatto di cristallizzazione. Dopo che il coperchio è stato trasferito al corrispondente vettore di deposito, la piastra di cristallizzazione è trasportata al ponte del nanolitro dispenser. Quindi il braccio di pipettaggio trasferisce la quantità di campione necessaria per l’impostazione le goccioline da provetta normalmente refrigerata alla prima colonna della piastra PCR. Successivamente, la pinza principale si muove la piastra PCR sul ponte del nanolitro dispenser che preparerà le goccioline seguendo le opzioni selezionate dall’utente all’inizio (es. dimensione delle gocce). Per questo, il campione della proteina è innanzitutto aggiunti i superiore-pozzetti (utilizzando un unico set di 8 microsyringes e dispensazione multipla), quindi le condizioni di cristallizzazione sono dispensate sulle goccioline di proteina (ogni riga ora richiede 8 microsyringes nuovo per evitare contaminazione incrociata). Al completamento del programma per impostare la pagina di goccioline, la pinza principale trasporta la piastra corrispondente per il copripiastra, quindi inserisce la piastra PCR torna nella sua posizione originale (più proteine saranno dispensata nella colonna successiva della piastra PCR per la seguente targhetta ). Infine, la piastra di cristallizzazione sigillato viene spostata indietro nella sua posizione originale sul ponte: esperimenti di diffusione del vapore hanno già iniziato in questa piastra (Figura 2D). Questo ciclo viene ripetuto secondo il numero di piatti. Quando necessario, la pinza opzionale consente di rimuovere un rack di punta vuota permettendo il braccio di pipettaggio accedere a ulteriori suggerimenti. Il programma richiede 2 ore e 20 min e 440 µ l di campione per preparare singole goccioline in 20 piastre utilizzando 100 nL campione + 100 condizione nL (Figura 2E e 2F). Quando si utilizza il dispenser nanolitro come stand-alone robot per due piastre supplementari (Vedi protocollo, punto 1.2.3), è possibile impostare l’intero set di piastre di screening iniziale disponibile nell’incubatrice 10 ° C (22 condizioni di piastre x 96 LMB = 2.112 condizioni). Tabella 2 vengono indicati i requisiti per il programma principale secondo le selezioni dell’utente sul sistema 2. Piastre Dimensione goccia (nL) Campione (s) Requisiti di punta Durata Numero Tipo Vol. 1 (µ l) Vol. 2 (µ l) 50 punte di µ l Microsyringes 10 96 pozzetti 100 240 0 80 1040 1 h 12 min 20 96 pozzetti 100 440 0 160 2080 2 h 20 min 10 96 pozzetti 100 240 240 160 2080 1 h 45 min 20 96 pozzetti 100 440 440 320 4160 3 h 05 min 10 48-pozzo 1000 624 0 80 560 1 h 10 min 20 48-pozzo 1000 1208 0 160 1120 2 h 16 min Tabella 2: esempi di opzioni del programma principale disponibile sul sistema 2 per l’impostazione le goccioline cristallizzazione. La quantità necessaria di campione della proteina, le punte e microsyringes variano a seconda del programma. I volumi di campione ‘ Vol. 1’ (goccia 1) e ‘ Vol. 2’ (drop 2) sono calcolati come segue: (8 punte x richiesto volume ogni pozzetto della piastra PCR + 4 µ l perso volume) x numero di piastre di cristallizzazione + 40 µ l di volume morto nella microprovetta. Il volume richiesto per pozzetto della piastra PCR per 100 goccioline di nL in piastra 96 pozzetti cristallizzazione è µ l 2 mentre 6,8 µ l è richiesto per 1.000 goccioline di nL in una piastra a 48 pozzetti (volume morto in pozzetti della piastra PCR: 0,8 µ l). Un volume supplementare del campione è preso in considerazione (‘perdita volume’) a causa dell’evaporazione dalla provetta e altre perdite (ad es. campione attaccare sulle punte). Ad esempio, per 20 piastre di MRC, 100 nL, protocollo 1 goccia, il volume di campione richiesto è: (8 x 2 + 4) x 20 + 40 = 440 µ l (vale a dire, l’equivalente di 22 µ l per piastra). Otto 50 puntali µ l sono necessari per ogni piatto e ogni campione. Ad esempio, per 10 piastre, protocollo 2-drop, il numero di punte richiesto è 8 x 10 x 2 = 160 suggerimenti. Il numero di microsyringes è calcolato come segue: (8 + numero di condizioni per piastra) x numero di campioni x numero di piastre. Ad esempio, per 10 x 48 pozzetti, il numero di punte di gestore di liquido richiesto è: (8 + 48) x 1 x 10 = 560 suggerimenti. 3. formulazione, preparazione e gestione delle soluzioni 4-angolo Entrambe le formulazioni delle soluzioni 4 angolo (‘A, B, C e D’) e la schermata Ottimizzazione corrispondente (Figura 3A) vengono generate automaticamente con un foglio di calcolo Excel. Ci sono diversi fogli di calcolo per un diverso numero di condizioni — essenzialmente 24, 48 e 96 condizioni — e anche fogli di calcolo per preparare due schermi di ottimizzazione differenti in una singola piastra. Uno si prepara in genere un insieme di 4 x 10 mL soluzioni angolari in provette da cui 2 – 3 schermi di ottimizzazione possono essere preparati, a seconda del numero e volume delle condizioni richieste. Le soluzioni vengono versate in depressioni da cui sono aspirati da un gestore di liquido base di siringa e poi dispensati direttamente nelle piastre (Figura 3B). I due gradienti lineari delle concentrazioni derivano da miscelazione A, B, C e D a sistematicamente diversi rapporti (Figura 3). Figura 3: il metodo 4-angolo per la preparazione di schermi ottimizzazione. (A) rappresentazione dei due gradienti di concentrazione attraverso un layout di piastra a 96 pozzetti. (B) il gestore liquido basato su siringa pronto a preparare una schermata con 4 siringhe inseriti nella testa del robot. Un piatto di cristallizzazione si siede nel supporto motorizzato di SBS e 4 avvio delle soluzioni (A, B, C e D) hanno già stato dispensato in loro rispettivi trogoli (le soluzioni sono state colorate di rosso solo a scopo dimostrativo). (C) rapporti delle soluzioni A, B, C e D in tutto 96 serbatoi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. La tabella 3 Mostra i requisiti per i programmi disponibili agli utenti sul liquido-gestore basato su siringa. Tipo di piastra Lol delle condizioni Vol. in piastra (serbatoi, µ l) Vol. nel trogolo (mL) Durata 96 pozzetti 48 80 1.6 2 min 5 sec 96 pozzetti 96 80 2.5 3 min 50 sec 96 pozzetti 2 x 48 80 1.6 2 min 50 sec 48-pozzo 24 200 1.8 2 min 25 sec 48-pozzo 48 200 3 4 min 20 sec Tabella 3: programmi disponibili sul gestore del liquido siringa-base per la preparazione di schermi di ottimizzazione secondo il metodo 4-angolo. La piastra a 96 pozzetti può essere utilizzata per preparare schermo ottimizzazione 96 – o 48-condizione (quando due 48-condizione schermi sono preparati contemporaneamente, il robot deve essere equipaggiato con 8 siringhe e 8 depressioni). Altri programmi consentono l’utilizzo di piastre 48 pozzetti. I volumi elencati in depressioni includono il volume morto richiesto (0,5 mL). 4. l’additivo screening Figura 4 Mostra la procedura per eseguire una proiezione additiva a partire sia con 96 soluzioni additiva già nei serbatoi della piastra cristallizzazione (protocollo 1) o in pozzetti di un basso profilo cella piastra di coltura utilizzato come additivo riutilizzabili schermo ( protocollo n. 2). La tabella 4 elenca i programmi disponibili sul dispenser nanolitro secondo i due tipi di protocolli. Figura 4: I due tipi di protocolli per lo screening additivo. Le schermate di 96-additivo sono conservate a-20 ° C. Seguendo il protocollo 1, la schermata di additiva è aggiunto inizialmente ai serbatoi delle piastre cristallizzazione (e idealmente rifornita questo modo). Un gestore di liquido o multipipette viene utilizzato per erogare la condizione nei serbatoi contenenti soluzioni additivi (il volume dello schermo additivo rappresenta il 10% del volume finale in serbatoi: 8 µ l di volume finale di 80 µ l). Dopo la miscelazione le condizioni di un mixer per micropiastre (non mostrato), il distributore basato su microsiringa nanolitro viene utilizzato per impostare le goccioline (tabella 4). Seguendo il protocollo 2, lo schermo additivo viene aggiunto solo più tardi durante l’impostazione le goccioline di cristallizzazione. Questa volta il dispenser nanolitro è impiegato per preparare le goccioline con un componente aggiuntivo sul suo ponte (la piastra di coltura cellulare riutilizzabili contenenti l’additivo schermo). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Protocollo Dimensione goccia (nL) Tipo di striscia Vol. campione (µ l) Lol di microsyringes Durata Tipo Fonte di additivi Proteina Condizione Additivo In ogni pozzetto (striscia) Totale 1 piastra 96 pozzetti cristallizzazione 100 100 0 2 Μ l 2 16 104 2 min 1 piastra 96 pozzetti cristallizzazione 200 200 0 5 Μ l 3.8 31 104 2min 10 sec 2 piastra di coltura cellulare di 96 pozzetti 200 200 100 5 Μ l 3.8 31 200 3min 45 sec 2 piastra di coltura cellulare di 96 pozzetti 500 500 100 5 Μ l 7.4 60 200 4min 15 sec Tabella 4: programmi disponibili sul dispenser per lo screening di additivo basato su microsiringa nanolitro. Il volume di campione in ciascun pozzetto della striscia 8 pozzetti è calcolato come segue: volume morto + 12 x dimensione goccia. Ci sono 2 tipi di strisce (2 µ l e 5 µ l). I volumi morti sono 0,8 µ l per i pozzi di µ l 2 (che in realtà può contenere max 3,2 µ l.) e 1,4 µ l per i pozzi di 5 µ l (max 7,5 µ l.). Il volume totale di proteina necessaria è: volume 8 x nel pozzo della striscia (valore round-up). Il volume morto dei pozzi a forma di V della piastra di coltura cellulare di 96 pozzetti è 2,5 µ l. Il numero richiesto di microsyringes varia a seconda del programma selezionato (8 + 96 = 104; o 8 + 2 x 96 = 200). A causa della diluizione della condizione con l’additivo durante protocollo 1, la condizione deve essere preparato ad una concentrazione proporzionalmente superiore rispetto inizialmente. L’aumento nelle concentrazioni finali è più facilmente ottenibile riducendo l’aggiunta finale di acqua per il volume finale calcolato. Dopo questo, uno semplicemente procede con il normale set up di goccioline che mescolano la condizione e il campione (ad es., proteina nL 100 + 100 nL condition, già miscelato con additivi). Protocollo n. 2 (ad es., proteina nL 200 + 200 nL stato + additivo nL 100) facilita lo screening a differenti concentrazioni di additivi variando semplicemente il volume dello schermo additivo aggiunto. Protocollo 2 implica più o meno diluizione delle goccioline (che possono alterare la cristallizzazione). Il gestore liquido dal sistema 2 può essere utilizzato per aspirare sufficiente condizione in 12 suggerimenti e dispensare 8 aliquote nei serbatoi di una piastra a 96 pozzetti (Vedi protocollo, punto 2.2.2), anche se questo passaggio può naturalmente essere fatto manualmente con una pipetta multicanale ( Figura 4). Diversi piatti possono essere riempiti contemporaneamente con la stessa condizione di quando si utilizza il gestore di liquido (per testare diversi schermi additivi più tardi). Durante la preparazione di 2 piastre, riempire il contenitore di reagente con almeno 23 mL. Quando si prepara 3 piastre, riempire il contenitore di reagente con almeno 31 mL. 5. cristallizzazione piastre e dispositivi associati Il design di entrambi piastre di cristallizzazione diffusione di MRC seduta-goccia vapor (96 pozzetti 2-drop e 48-pozzo 1-goccia, Figura 5A e 5B figura) fornisce caratteristiche che gli permettono di esperimenti di cristallizzazione automatizzata affidabile ed efficiente, con in particolare la forma sferica della tomaia-pozzetti e una leggera forma a V dei serbatoi che facilitano l’erogazione esatta e anche centrifugazione quando centratura delle goccioline è necessaria. Inoltre, i superiore-pozzi hanno un effetto lente per un’illuminazione ottimale sotto un microscopio stereoscopico (il polimero è trasmissibile per la rilevazione di cristalli ad assorbimento UV o a fluorescenza23UV). Una guarnizione su misura (Figura 5) consente l’impostazione up appeso esperimenti di cristallizzazione di goccia all’interno di entrambi i tipi di piastre usando un erogatore nanolitro (protocolli non mostrati). Infine, entrambe le piastre MRC hanno le stesse dimensioni esterne e rim. Il cerchio si inserisce nelle scanalature del nostro portatarga su misura (Figura 5), che viene utilizzato per la rimozione manuale di immissione/nastro sigillante senza spruzzi. Figura 5: The MRC cristallizzazione piastre e dispositivi associati sviluppato presso il LMB. (A) A1-angolo della piastra 96 pozzetti. Il serbatoio (oblungo) è sul lato sinistro del pozzo cristallizzazione, i due sferici superiore-pozzi sulla destra. Le dimensioni sono in millimetri. (B) A1-angolo della piastra 48 pozzetti. Il serbatoio è sul lato destro del pozzo (1 grande superiore-bene solo). (C) MRC appeso goccia seal. Titolare (D), targa personalizzata in-House. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 6. cristalli di proteine Figura 6 Mostra esempi di cristalli utili ottenuti con nostri protocolli automatizzati. Figura 6: luce micrografie di goccioline contenenti cristalli ottenuti seguendo i protocolli automatici. (A, B) Sistemi automatizzati di cristalli dalla schermata iniziale di OmpF e MreB nei piatti preparati con i 2 completamente (Vedi protocollo sezioni 1.1 e 1.2, condizioni: A4 ben LMB07 e LMB20 bene D12, rispettivamente, dimensione delle goccioline è proteina nL 100 + 100 nL condition, lavoro di Andrzej Szewczak, LMB)24. (C, D) Bar cristalli di dominio prima e dopo l’ottimizzazione delle condizioni iniziali con il metodo 4-angolo (punto 2.1, LMB02 B6, 1.000 nL + 1.000 nL, inedito lavoro di Leonardo Almeida-Souza, LMB). (E, F) Catena pesante della dineina umano 1 cristalli di dominio N-terminale prima e dopo l’ottimizzazione delle condizioni iniziali con il metodo 4-angolo (LMB20 E6, 200 nL + 200 nL, poi 500 nL + 500 nL, inedito lavoro di Edgar Morales-Ríos, LMB). (G, H) Completano i cristalli di fattore D prima e dopo l’ottimizzazione della condizione con proiezione additivo (punto 2.2, condizione iniziale da schermo personalizzato in-House, 200 nL + 200 nL, additivo D6 dalla schermata additiva 96-condizione, inedito lavoro di Matthias Bauer, LMB). (I, J) Cristalli di25 glicoproteina envelope virale prima e dopo l’ottimizzazione della condizione con proiezione additivo (punto 2.3, LMB20 A2, 150 nL + 150 nL, quindi 200 nL + 200nL + 100 nL additivo E5 dalla schermata additiva 96-condizione, inedito lavoro di Yorgo Modis, Università di Cambridge, UK). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

1 – preparazione e uso di schermate iniziali archiviati in piastre

Kit di screening devono essere miscelati prima erogazione in piastre perché luce precipitazione o fase di separazione si verifica in alcuni tubi durante la conservazione. Quando uno schermo è composto di due kit (2 x 48 tubi), il primo tubo del kit secondo è collocato posizione E1 del vettore raffreddamento. Quando uno schermo è composto di 4 Kit (4 x 24 tubi), il primo tubo del kit secondo è collocato in posizione C1, il primo tubo del terzo kit è collocato in posizione E1 e il tubo primo del quarto kit è collocato in posizione G1. Inserire le provette nel loro elemento portante di raffreddamento, coperchi sono collocati su un vassoio seguendo il layout orizzontale 96 pozzetti standard. Poiché i numeri ben sono indicati sopra i coperchi da parte dei produttori, in questo modo incrociato se tutti i tubi sono stati inseriti nel giusto ordine. Questo aiuta anche a sostituire i coperchi corretti sui tubi durante la compilazione di un ridotto numero di piastre.

Memorizziamo le piastre pre-riempite a 10 ° C, un compromesso per evitare il congelamento e la conservazione a 4 ° C che possono provocare il deterioramento delle condizioni e problemi con il sigillamento. Piastre sono conservati per fino a parecchi mesi normalmente senza evidente formazione di condensa sulla faccia interna della guarnizione. Questo è meno vero per piastre LMB05, LMB06, LMB09 e LMB10 come questi contengono condizioni con concentrazioni relativamente alte di reagenti volatili (tabella 1). Piccola quantità di condensa sul lato interno della guarnizione riduce l’efficienza di tenuta e può causare la contaminazione incrociata tra pozzi mentre sigilli le piastre. Per contribuire a prevenire la formazione di condensa durante il raffreddamento iniziale, piastre possono essere trasferiti in primo luogo dalla giostra in un pic-nic isolati più fresco che viene memorizzata nella cella frigorifera a 4 ° C durante la notte. Il raffreddamento molto lento minimizza lo sviluppo di gradienti di temperatura all’interno dei pozzetti sigillati e quindi riduce la condensa complessiva¹⁵. Inoltre, una volta che le piastre vengono memorizzate nell’incubatrice 10 ° C, un coperchio in polistirolo di SBS personalizzato in-House è disposto sul piatto nella parte superiore di ogni stack (non mostrato).

L’intero set dei nostri piatti pre-riempite può essere utilizzato come un grande schermo iniziale contro un campione della proteina del romanzo, solubile in acqua. In alternativa, è possibile selezionare un minor numero di piastre per abbinare i requisiti specifici. Ad esempio, LMB15 e LMB19 sono schermi formulati specificamente per membrana proteina campioni²⁶^,²⁷, o LMB20 è uno schermo formulato con pesanti-atomi per facilitare la graduale sperimentali di diffrazione dati²⁸ (veda inoltre : Formulazione delle schermate di cristallizzazione della proteina di MORPHEUS).

2. impostazione le goccioline di cristallizzazione

Quando si utilizza il sistema 2, kit con una notevole quantità di reagenti volatili di screening dovrebbe essere elaborato per primo. Questo evita la condensa la gomma dei coperchi SBS, che potrebbero influenzare la gestione coperchio e guarnizione piastra. Un coperchio SBS ha un po’ di spazio quando sulla cima di una piastra, che è per questo che hanno bisogno di essere allineati inizialmente (Vedi protocollo, punto 1.2.6). I volumi morti di proteine nei pozzetti della piastra PCR sono relativamente generoso (0,8 µ l, Vedi legenda della tabella 2). Si noti che altrettanto generosi volumi morti sono impiegati quando si utilizza il dispenser nanolitro individualmente con proteina a strisce da 8 pozzetti (tabella 4). Più piccoli volumi morti potrebbe funzionare, tuttavia alcuni campioni aderiscono alle punte, calibrazione di un robot può diventare leggermente imprecise, la camera potrebbe essere più calda rispetto al solito, ecc. Tutti portare a perdite di esempio rientrano i generosi volumi morti al fine di consolidare l’approccio.

Recenti sviluppi abilitato ulteriore miniaturizzazione degli esperimenti e quindi il volume di campione richiesto per condizioni di cristallizzazione di screening può essere ridotto integrando la corrispondente tecnologia²⁹^,la³⁰. Tuttavia, alcuni aspetti di ulteriore miniaturizzazione bisogno un’attenta considerazione, come ad esempio l’evaporazione delle goccioline³¹ e la manipolazione di microcristalli³².

Infine, centrifugazione della piastra (2.000 giri/min, 1 min) potrebbe essere integrata come passaggio finale ordinaria quando si impostano le goccioline di cristallizzazione (a sferico superiore-wells). Una più consistente dimensione e forma di goccioline risultanti da centrifugazione può ridurre la riproducibilità problemi³³^,³⁴. Sicuramente, centrati gocce faciliterà la successiva valutazione degli esperimenti utilizzando un microscopio, come la lunghezza focale necessaria sarà simile in tutta l’intera piastra.

3. i vantaggi del metodo 4-angolo

Il vantaggio più significativo del metodo 4-angolo è la sua semplicità, che riduce al minimo gli errori e facilita protocolli automatici semplici. Ad esempio, le soluzioni di 4 angolo inserirà sempre sul ponte di un gestore di liquido seguendo lo stesso layout. Inoltre, tutti i programmi si basano su rapporti fissi tra le soluzioni (Figura 3).
Preparazione manuale delle soluzioni 4 angolo è preferito al trattamento automatizzato di soluzioni ad alte concentrazioni che possono essere altamente viscose. Relativamente veloce ed accurata aspirazione/erogazione è poi possibile sulla maggior parte dei tipi di gestori liquidi con requisiti minimi per l’ottimizzazione delle classi liquide. Tuttavia, alcune soluzioni di angolo possono essere ancora troppo viscosi per un robot operano con un sistema di liquido per operare in modo efficiente. Questo è il motivo per cui abbiamo optato per un gestore di liquido di funzionamento con spostamento positivo (Figura 3B).

Oltre i 2 gradienti lineari delle concentrazioni, una terza componente (cioè, un set di buffer/additivi) possa essere testata ad una concentrazione costante in modo conveniente. Per questo, un volume relativamente grande di un insieme di soluzioni ad angolo ad una concentrazione superiore opportunamente, escludendo il componente per essere variata, è preparato prima. Quindi, soluzioni di riserva tra cui questo componente viene aggiunto per regolare le concentrazioni finali. Ad esempio, 50 mL di un insieme di 4 soluzioni angolari vengono preparati al 10% più alte concentrazioni che inizialmente. Questo set di base è quindi divisa in 5 sottoinsiemi più piccoli di 4. Infine, il 10% in volume di soluzioni tampone pH diversi viene aggiunto a ogni sottoinsieme.

4. formati e tipi di schermi additivi

Gli schermi sono normalmente memorizzati a-20 ° C (Figura 4), poiché non sono usati regolarmente e contengono composti volatili/instabile. L’uso di un schermo congelato additivo memorizzato in un pozzo profondo blocco (1 mL a wells) dovrà essere pianificata presto perché ci vorranno 12-24 ore per tutte le soluzioni additiva scongelare completamente a temperatura ambiente. Inoltre, una moltitudine di utenti condividono lo stesso schermo additivo, potenzialmente causando problemi con contaminazione incrociata. Infine, l’altezza del pozzi profondo blocchi li rende inadatti per la maggior parte dei distributori di nanolitro. Come una soluzione conveniente per aggirare questi problemi, lo schermo deve essere trasferito dal pozzo profondo blocco piastre di basso profilo (Figura 4).

Storicamente, schermate di additivi che includono un’ampia varietà di singoli reagenti (con singole concentrazioni) sono state molto popolari³⁵^,³⁶. Tuttavia, sono stati sviluppati altri tipi di schermi additivi che integrano le miscele di additivi³⁷ o un ridotto numero di singoli additivi trovato alle concentrazioni differenti³⁸. Infine, un approccio complementare è quello di studiare l’effetto degli additivi su campioni prima cristallizzazione³⁹^,⁴⁰.

5. altre considerazioni

Buone pratiche: La maggior parte delle schermate contengono sostanze dannose o addirittura tossiche e quindi un’adeguata protezione personale deve essere impiegata durante i protocolli. Ugualmente, parti dei robot in movimento possono causare lesioni, soprattutto quando si cerca di interferire manualmente mentre un programma è in esecuzione (anche se la maggior parte dei robot hanno sistema/pulsante di arresto di emergenza). A causa della complessità tecniche coinvolte, regolare il controllo di robot, schermi e programmi con precedentemente caratterizzato campioni del test sono importanti per alti livelli continui di riproducibilità.

Velocità di trasmissione: A titolo indicativo, tra 4.000-8.000 LMB piatti vengono prodotti annualmente con il sistema 1 (e successivamente impiegati dagli utenti per lo screening iniziale). Esso non è adatto a magazzino una grande quantità di piatti pre-riempite a 10 ° C, quando il fatturato atteso è molto più basso, come dopo 4-5 mesi, alcune condizioni inizierà a deteriorarsi e far evaporare. Diversi approcci ai protocolli di automazione sono stati implementati per laboratori di piccole-medie dimensioni⁴¹.

Memorizzazione e valutazione esperimenti: Dopo aver preparato le goccioline, piastre vengono memorizzati sugli scaffali di basso-vibrazione in una camera a 4 o 18 ° C con temperatura strettamente controllata (+ /-0,5 ° C massima deviazione). Gli esperimenti sono valutati utilizzando microscopi di fonte di luce fredda. Vari sistemi di imaging automatici sono disponibili in commercio, tuttavia uno deve considerare attentamente tutti gli aspetti: la velocità necessaria per eseguire la scansione una piastra sarà sufficiente per alta velocità effettiva? Oggetti diversi dai cristalli interferirà con autofocus? La qualità delle immagini sarà sufficiente per spot cristalli molto piccoli (soprattutto intorno al bordo delle goccioline)? ⁴² ^, ⁴³ ^, ⁴⁴

Confronto di condizioni di cristallizzazione: Dopo un’attenta indagini circa la natura dei cristalli ottenuti inizialmente, si può analizzare tendenze e somiglianze attraverso condizioni utilizzando il database di LMB schermo o il C6 Strumento Web⁴⁵.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

L’impianto di cristallizzazione di MRC-LMB è gentilmente sostenuta dal Consiglio di ricerca medica (UK). Si ringraziano i membri del LMB per il loro sostegno: Olga Perisic (PNAC), Tony Warne, Fusinita Van den Ent e Pat Edwards (studi strutturali), Steve Scotcher e gli altri membri dell’officina meccanica, Neil Grant e Jo Westmoreland (visivi), Paul Hart e Tom Pratt (IT). Vorremmo anche ringraziare Steve Elliot (Tecan, UK), Mitchell Stuart e Heather Ringrose (robotica di Hamilton, Regno Unito), Paul Thaw, Robert Lewis e Joby Jenkins (TTP Labtech, UK), Paul Reardon (Swissci AG, Svizzera), George Stephens e Donald Ogg (Alphabiotech, UK), Neil Williams (Markem-Imaje, UK) e Graham Harris (The Cleveland Agency) per assistenza tecnica.

Materials

Robots
Freedom EVO®	Tecan	n/a	Liquid handler (System 1). Aspiration/Dispense based on system liquid. Integrates an automated carousel. EVOware plus controlling software v.2.4.12.0.
Microlab® STAR™	Hamilton	n/a	Liquid handler (System 2). Aspiration/Dispense based on positive displacement (CO-RE™ technology). Hamilton STAR controlling software v.4.3.5.4785 with method management interface.
Mosquito®	TTP Labtech	n/a	Microsyringe-based nanoliter dispenser used to set up droplets (System 2 and stand-alone), 3-position deck. Controlling software v.3.11.0.1422.
Dragonfly®	TTP Labtech	n/a	Syringe-based liquid handler used to produce optimization screens (4-corner method). Controlling software v.1.2.1.10196.
Adhesive plate sealer	Brandel	n/a	Integrated to Systems 1 and 2 (also used as stand-alone robot).
Inkjet printer 9232	Markem-Imaje	n/a	Integrated to System 1. Touchscreen interface.
Crystallization screens
Crystal Screen™ 1	Hampton Research	HR2-110	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01
Crystal Screen 2™	Hampton Research	HR2-112	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01
Wizard™ Classic 1	Rigaku	1009530	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02
Wizard™ Classic 2	Rigaku	1009531	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02
Grid Screen™ Ammonium Sulfate	Hampton Research	HR2-211	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Grid Screen™ PEG/LiCl	Hampton Research	HR2-217	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Quick Screen™	Hampton Research	HR2-221	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Grid Screen™ Sodium Chloride	Hampton Research	HR2-219	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Grid Screen™ PEG 6000	Hampton Research	HR2-213	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04
Grid Screen™ MPD	Hampton Research	HR2-215	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04
MemFac™	Hampton Research	HR2-114	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04
PEG/Ion™	Hampton Research	HR2-126	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05
Natrix™	Hampton Research	HR2-116	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05
Crystal Screen Lite™	Hampton Research	HR2-128	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06
Custom Lite screen	Molecular Dimensions Ltd	n/a	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06
Wizard™ Cryo 1	Rigaku	1009536	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07
Wizard™ Cryo 2	Rigaku	1009537	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07
JBS1	JenaBioScience	CS-101L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS2	JenaBioScience	CS-102L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS3	JenaBioScience	CS-103L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS4	JenaBioScience	CS-104L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS5	JenaBioScience	CS-105L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS6	JenaBioScience	CS-106L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS7	JenaBioScience	CS-107L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS8	JenaBioScience	CS-108L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS9	JenaBioScience	CS-109L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
JBS10	JenaBioScience	CS-110L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 4.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 5.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 6.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 1 pH 7.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 1 pH 8.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 2 pH 4.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 2 pH 5.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Clear Strategy™ Screen 2 pH 6.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Clear Strategy™ Screen 2 pH 7.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Clear Strategy™ Screen 2 pH 8.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Index™	Hampton Research	HR2-144	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB13
SaltRX™ 1	Hampton Research	HR2-107	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14
SaltRX™ 2	Hampton Research	HR2-109	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14
MemStar™	Molecular Dimensions Ltd	MD1-21	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15
MemSys™	Molecular Dimensions Ltd	MD1-25	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15
JCSG-plus™ Suite	Qiagen	130720	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB16
MORPHEUS® screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-46	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB17
Pi minimal screen	JenaBioScience	CS-127	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB18
Pi-PEG screen	JenaBioScience	CS-128	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB19
MORPHEUS® II screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-91	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB20
LMB crystallization screen™	Molecular Dimensions Ltd	MD1-98	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB21
Additive screens
HT additive screen	Hampton Research	HR2-138	Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).
MORPHEUS® additive screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-93-500	Frozen in 96-well deepwell block (500 µL per well).
ANGSTROM additive screen™	Molecular Dimensions Ltd	MD1-100	Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).
MORPHEUS® additive screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-93	Frozen in 96-well cell culture Costar® plate with V-shaped wells (100 µL per well).
ANGSTROM additive screen™	Molecular Dimensions Ltd	MD1-100-FX	Frozen in 96-well cell culture Costar® plate with V-shaped well (100 µL per well).
HIPPOCRATES additive screen	Molecular Dimensions Ltd	n/a	48 single additives (drug compounds found in MORPHEUS® III).
Other consumables
96-well MRC 2-drop plate	Swissci	MRC 96T-UVP	Sitting-drop, vapor diffusion plate. Reservoir recommended volume: 80 µL. Range of useful droplet volumes: 10-1000 nL. UV transmissible.
48-well MRC 1-drop plate ('MAXI plate')	Swissci	MMX01-UVP	Sitting-drop, vapor diffusion plate for scale-up/optimization. Reservoir recommended volume: 200 µL. Range of useful droplet volumes: 0.1-10 µL. UV transmissible.
MRC hanging drop seal	Swissci	n/a	Hanging-drop, compatible with both MRC vapor diffusion plates (MRC 96T-UVP and MMX01-UVP ). UV and X-ray transmissible.
Adhesive sealing tape	Hampton Research	HR4-50	3-inch wide Duck® HD Clear™ for sealer and manual sealing.
Adhesive aluminium sheet	Beckman Coulter	538619	Used to reseal additive screens.
Ink cartridge	Markem-Imaje	9651	System 1 (inkjet printer).
Solvent cartridge	Markem-Imaje	8652	System 1 (inkjet printer).
50 µL tips	Hamilton	235947	System 2 (STAR™ liquid handler). Box of 6 sets with 1920 x CO-RE™ tips in disposable stacks.
Reagent container	Hamilton	194052	Used to dispense a condition into plate(s) during additive screening protocols.
PCR plate	Thermo Scientific™	AB-2150	System 2 (contains protein to be transfer to the Mosquito®). Abgene Diamond ultra, 384 V-shaped wells.
microsyringes	TTP Labtech	4150-03020	Spool of 26,000 microsyringes for the Mosquito® nanoliter dispenser (9mm spacing).
strip-holder block	TTP Labtech	3019-05013	SSB device for the Mosquito® strips, aka '4-way Reagent Holder'.
2 µL 8-well strip	TTP Labtech	4150-03110	Contains protein on the deck of the Mosquito®. Box of 40 strips, max. vol. in well is 3.2 µL.
5 µL 8-well strip	TTP Labtech	4150-03100	Contains protein on the deck of the Mosquito®. Box of 40 strips, max. vol. in well is 7.5 µL.
5 mL syringes	TTP Labtech	4150-07100	Syringe body and piston for the Dragonfly® liquid handler. Pack of 100.
Troughs/Reservoirs	TTP Labtech	4150-07103	Contains stock solutions on the deck of the Dragonfly®. Pack of 50.
Orbital microplate shaker	CamLab Limited	n/a	Variomag® for mixing conditions in a single plate (0-2000 rpm).
Microplate mixer	TTP Labtech	3121-01015	MxOne. Mixing condition in a single plate with 96 vibrating pins.

Referências

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Gorrec, F., Löwe, J. Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology. J. Vis. Exp. (131), e55790, doi:10.3791/55790 (2018).

Automatizzato di protocolli per cristallizzazione macromolecolare al MRC Laboratorio di biologia molecolare

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Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

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Materials

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