分子生物学实验室中大分子结晶的自动化协议
Summary
本文介绍和讨论了用于蒸汽扩散实验的大量屏幕和 nanoliter 结晶液滴的常规制备的自动化系统和协议。
Abstract
当高质量的晶体得到衍射 X 射线时, 晶体结构可以在近原子分辨率下解决。但不能预测蛋白质、dna、rna 及其配合物的结晶条件。采用多种条件是提高质量衍射晶体成品率的一种方法。两个全自动系统已经开发了在湄公河医学实验室的分子生物学 (剑桥, 英国, 湄公河 LMB), 以促进结晶筛选的1920初始条件的蒸气扩散的 nanoliter 液滴。还开发了半自动化协议, 通过改变试剂浓度、pH 值或引入可能增强所产生晶体性能的添加剂来优化条件。所有相应的协议将被详细描述和简要讨论。两者结合在一起, 在多用户设施中实现了方便高效的大分子结晶, 同时使用户能够控制实验的关键参数。
Introduction
x 射线晶体学被广泛应用于进一步提高我们对原子级生物和疾病机制的理解, 并随后协助对药物发现的合理方法1。为此, 纯化和浓缩 (2-50 毫克/毫升) 大分子样品的蛋白质, DNA, RNA, 其他配体, 及其配合物是试用的倾向, 形成有序的三维晶格通过结晶2,3 ,4。当获得高品质的晶体衍射 X 射线, 晶体结构可以解决在近原子分辨率5,6。关键的是, 不能预测新样品的结晶条件, 而高质量晶体的产量通常很低。一个潜在的原因是, 许多感兴趣的样品具有挑战性的生物化学性质, 这使得他们在相应的时间刻度的结晶 (通常是几天) 不稳定。最后, 该过程由生产样品和样品变型所需的时间合成, 并优化其纯化和结晶7,8。
结晶条件是一种沉淀的溶液, 它可以降低样品的溶解度, 而且条件通常也含有缓冲器和添加剂。数以百计的这种试剂非常适合于改变结晶实验的参数, 因为它们有低的倾向, 干扰样品的完整性 (如蛋白质或核酸的展开)。虽然测试数百万个结晶试剂的组合是不可行的, 测试几个到许多筛选套件-制定与各种策略9,10 -是可能的微型试验和自动化协议。在这个角度, 最适合的技术可能是蒸气扩散与 100-200 nL 液滴坐在一个小井之上包含结晶条件 (25-250 µL), 实施在专业结晶板11,12. 当在上井中设置液滴时, 蛋白质的样品和条件通常以1:1 的比率组合为 200 nL 的总体积。机器人 nanoliter 蛋白质的结晶可以采用替代技术和板块, 如油下批次13和脂立方相14 (最近一个被专门应用于跨膜蛋白水中溶解性极差)。
在2000s 代初开始了LMB 的结晶装置, 并在 2005年15中介绍了我们的自动化协议的早期摘要。介绍了蛋白质结晶的历史介绍, 同时也概述了机器人 nanoliter 方法的优点 (然后是一种新的常规实验方法)。由于大分子结晶实质上是一个随机过程, 很少或没有有用的先验信息, 采用了广泛的 (合适的) 初始条件, 提高了质量衍射晶体的成品率16。此外, 一个大的初始屏幕经常被忽视的优势是大大减少了对样品和晶体的优化需要在许多情况下。当然, 你可能仍然需要继续优化一些初始条件后。通常情况下, 试剂的浓度和 pH 值, 然后系统地调查。更多的试剂也可以引入到优化条件 (s) 进一步改变结晶的参数。当然, 一个人应该尝试用刚准备好的样品进行结晶, 因此相应的协议必须是直接的, 并且随时可用。
在这里, 两个全自动系统设计的 LMB (系统1和 2) 和相应的协议被充分描述。这两种系统的主要应用是在坐滴结晶板上进行蒸汽扩散初始筛选。系统1集成了一个液体处理程序, 一个自动旋转到股票板, 一个喷墨打印机的车牌标签和一个胶粘剂板封口机。在系统 1, 72 96-井板充满了商业可用的筛选套件 (80 µL 的条件转移到水库从10毫升的起始量在试管), 标签和密封。然后, 这些盘子被储存在一个10° c 的恒温箱里, 用户可以随时使用它们 (最初的屏幕叫做 “LMB 板”)。
系统2集成了一个液体处理器, 一个 nanoliter 分配器, 和一个胶粘剂板封口机。在系统2上, 通过结合条件和试样在 20 48-或 96-井板预填充条件下的上部井中, 产生了蒸汽扩散实验的坐液滴 (100-1、000 nL)。这意味着在系统2上使用 20 LMB 板时, 会试用1920初始筛选条件。
机器人也被单独用于优化选定的条件, 并描述了相应的半自动化协议。通常使用4角方法17来生成优化屏幕。相应的协议首先需要手动准备4解决方案 (“A、B、C 和 D”)。两个线性梯度的浓度 (两个主要结晶剂), 然后自动生成直接进入储层的结晶板。为此, 以注射器为基础的液体处理程序在不同的比率下免除了4角解。
为了进一步优化条件, 可以使用可增强结果晶体属性的加性屏幕18。有两种方法可用于加性筛选: 一种协议, 在设置液滴 (协议 1) 和附加屏幕的另一种协议开始之前, 在结晶板的储层中加入添加剂 直接放到水滴上 (协议 2)。
还提出了其他有益的发展, 在湄公河 LMB, 以促进自动化大分子结晶, 也介绍了。从根本上说, 结晶板和相关的设备, 如一个可堆叠的生物分子筛选 (SBS) 盖子, 最大限度地减少蒸发的条件时使用系统2。
为简洁起见, 假定用户熟悉 nanoliter 分配器、喷墨打印机和粘板封口机的基本功能和维护。除非另有说明, 在机器人的甲板上的板块定位, 使井 A1 (“A1-corner”) 是朝向后左角的一个板块承运人。
Protocol
1. 两个全自动系统 (初步筛选) 系统 1: 用筛包 (LMB 板) 填充的 72 96-井结晶板的制备 在执行该过程之前, 请确保系统的机器人已初始化, 并且其控制软件处于打开状态。在主程序启动前30分钟, 打开管冷却托架的冷水机。 在平板封口机的机动 SBS 载体上放置一个测试板。运行印版封口机, 检查胶片是否正确应用。重复此测试两次, 以验证板封口机是否已就绪。 然后, 在液体处理器的主容器中加入20升去离子水。从小容器 (20% 乙醇漂洗液) 中断开耦合插入, 并将刀片连接到主容器。 在喷墨打印机触摸屏上输入适当的屏幕名称 (表 1)。然后, 打开并关闭旋转木马的门, 以触发旋转木马。当第一个栈呈现自己时, 打开门。 充分装载第一个堆栈与22结晶板, 每个与专栏1朝向外面。以相同的方式完全加载下两个堆栈。 将剩余的6盘装入第四叠的最高位置。然后, 关闭旋转木马的门。 验证冷却器显示14° c。轻轻地反复翻转所选的筛包1分钟。然后, 打开液体处理程序的前面板。 按照标准的96井布局 (A1、A2、等) 打开管道并将其放置在冷却托架中。将每根管子放置在托架上时, 将其盖子放在同一96井布局中的托盘上。 交叉检查管子的位置, 确保所有的管子都是水平的, 并在托架中固定。然后, 关闭前面板。 在液体处理程序软件的 “启动” 窗口中, 选择 “运行维护” 并打开冲洗程序。运行程序从系统中冲洗20% 乙醇, 并清洗液体配药技巧的外部。 刷新完成后, 单击 “取消” 返回 “启动”。选择 “运行现有进程”, 然后单击 “开始选择”。打开 “工具包配药” 程序。在配置屏幕中为 “实例” 填写 “18”, 然后运行该程序。 监测系统, 因为前四板的标签, 填充和密封。 一旦所有的72板块都准备就绪, 并放回传送带中, 从主容器到小容器的耦合插入。运行 “启动刷新” 程序 (请参见步骤 1.1.10)。 关闭冷却器并丢弃空的屏蔽套件管。小心地从传送带上取下72准备好的盘子。丢弃不正确填充或密封不良的板。在10° c 的时候储存现成的盘子。 系统 2: 在 20 LMB 板中从单一样品中设置结晶液滴 (100 nl 蛋白 + 100 nl 条件) 首先, 确保系统的机器人是开着的, nanoliter 分配器是用其软件打开的, 而液体处理程序的方法管理器是打开的。在主程序启动前15分钟打开微冷却托架。 在平板封口机的机动 SBS 载体上放置一个测试板。运行该板封口机, 并验证该板是否正确密封。测试板封口机三次。 然后, 运行 nanoliter 分配器在测试板中设置 100-nL 测试液滴。在显微镜下检查水滴的设置是否正确。关闭 nanoliter 分配器软件, 并从甲板上卸下带座架。 接下来, 在定制设计的平板夹中插入 (请参见代表性结果: 在 LMB 中开发的结晶装置) LMB 板, 其条件中的挥发性试剂的相对数量最高 (表 1)。从板上取下粘合膜。 打开液体处理程序前面板, 并将未密封的板放在甲板上, 在第一滑动托架的背面 (滑动载体可以拉出以便于访问)。 用 SBS 铝盖盖板。通过施加柔和的压力到盖子的对面角落, 解决盖子对托架的后方左角落。 开封, 加载到滑动载体, 并以同样的方式覆盖其余的19板块, 工作从最不稳定的条件。一旦微冷却的载体是在4° c, 如指示由绿灯, 去除它的盖子。 切断含有 (至少) 440 µL 蛋白质样本 (表 2) 的微的盖子。确保样品没有泡沫以上的半月板, 因为这将干扰液体检测系统。将管放置在微冷却托架的1位置。 在平板移动的适配器托架前面的液体处理器甲板上放置一个 PCR 板。然后, 关闭前面板。 在装载甲板之后, 确保 nanoliter 分配器甲板是清楚的条带持有人块, 并且载体在 50-µL 尖叠的后面是清楚的铝 SBS 盖子。 在液体处理程序的 “方法管理” 界面中, 选择 “设置板”。监视两个系统的初始化并填充运行参数。遵循方法管理界面 (提示、数字和提示管理系统帮助准备) 的指导原则。 检查所有必需的组件是否已就绪, 然后启动该进程。 当 nanoliter 分配器将第一个板中的水滴设置为系统时, 对其进行监控, 然后将板封口机封上。 一旦所有20板都已准备好结晶液滴, 并自动返回到滑动载体, 打开前面板, 轻轻地卸下板。在储存结晶之前, 请检查板材是否正确密封。 用20% 乙醇溶液清洗 SBS 盖, 然后将其堆放在液体处理程序的左手边以存放。丢弃 PCR 板和微。 关闭微冷却托架, 然后擦去冷凝。在冷却器表面上留一条纸巾, 以吸收进一步的冷凝。然后, 更换托架盖并关闭前面板。 2. 条件的优化 基于注射器的液体处理: 产生两个线性梯度的浓度到储层的结晶板 (4 角法)。 首先, 确保液体处理程序打开并初始化其软件。 在 “渐变” 选项卡上: 打开所需的程序, 选择储层中的结晶板类型和最终体积 (表 3)。”最大铅球卷” 的高级设置应在使用含有 [异丙醇] > 10% v/v 和 [MPD] > 20% v/五的解决方案时从6000降至 3000 准备注射器在每个注射器中放置一个活塞 (指向末端), 然后将注射器的背部插入机器人头部下面的指定凹槽中。顺时针旋转注射器锁定它的位置 (程序将只启动与所有所需的注射器正确连接)。 准备水槽拆卸不锈钢框架并插入槽。左边的4位置对应于4角 A, B, C, d 切换到 “设置” 选项卡, 显示每个注射器所需的解决方案量 (在表 3中, 0.5 mL 死卷被添加到显示的卷中)。将角部溶液倒入各自的槽中, 然后将车架放回甲板上 (框架保持位置, 2 小磁铁位于甲板前部)。另一种继续执行此步骤的方法是将解决方案倒入槽中, 当它们已经放置在甲板上时. 将结晶板放在机动 SBS 载体上。 点击 ‘ 吸气 ‘, 等待这一步完成 (当活塞停止时, 他们的方式)。 切换到 “运行” 选项卡并运行程序。 程序完成后, 返回 “设置” 选项卡, 然后单击 “删除”: 系统从剩余的解决方案中清除注射器, 然后将活塞向上抬起。可以请求 “清除”, 而不是 “删除”; 这将使活塞处于底部位置, 准备用相同的注射器吸入更多的溶液. 通过逆时针扭转注射器。 在适当的纸盒中丢弃注射器和水槽 (或用去离子水冲洗, 然后用20% 伏/v 乙醇溶液清洗)。 密封板, 并把它放在微搅拌机3分钟 1000 rpm, 或10分钟, 当高度粘性的解决方案是混合。该板准备在 nanoliter 分配器上设置结晶液滴。 加性筛选协议 1 (在96井结晶板上设置结晶液滴, 加装预填充) 首先, 准备的条件与初始浓度的试剂增加了 10% (分钟 vol. 15 毫升时, 从一个容器到添加剂屏幕上的液体处理程序) 的条件。 确保液体处理程序准备好操作。打开程序 ‘ 添加屏幕到添加剂 ‘ 为一个单一的板块 (进入容积在水库: ‘ 72 µL ‘)。提示、数字和提示管理系统 (需要 12 x 1000 µL 提示) 帮助确保机器人可以根据选择进行操作. 从-20 ° c 的恒温箱中取出添加剂屏幕, 并立即取下其铝封 (使用盘架), 然后将板放在液体处理器的甲板上。程序根据纵向布局进行操作 (该板放置在位于托架左前方的 A1-corner)也安置装于情况的容器。运行该程序。 一旦该板块的水库已经填补, 把它放在微振动筛和运行程序。用去离子水和20% 乙醇清洗条件容器以供再利用。 设置 nanoliter 分配器上的液滴。首先, 开封的结晶板 (使用板持有人)。然后, 将该板和8井蛋白带放在带夹座的第一位置。控制软件上的 “设置” 选项卡显示了甲板上每个组件的实际位置。根据所需的放置大小 (表 4), 将带蛋白质样品的长条装入每个井。运行程序以准备液滴. 程序完成后, 将板从甲板上卸下, 并立即将其密封 (使用板封口机, 3 英寸宽的胶带)。在相应的纸盒中丢弃该条。 在贮存前评估显微镜下水滴的大小、形状和定心。 添加剂筛选协议 2 (在96井结晶板中设置具有可重新使用的添加剂屏幕的结晶液滴) 首先, 准备加网: 将相应的冷冻96孔细胞培养板在室温下解冻40分钟。然后, 离心的添加剂屏幕在 1000 x g 为2分钟。 准备条件 (最小 vol. 15 毫升时, 从一个容器转移到添加剂屏幕上的液体处理程序)。 填装一个96井结晶板的水库以情况。在液体处理程序上, 与协议1步2.2.2 相同, 但在储层中输入 “80 µL”。 设置 nanoliter 分配器上的液滴, 在甲板上安装3组件 (包含加性屏幕的板, 以及在带座块的第一个位置的晶板和8井蛋白带,表 4)。 密封的细胞培养板含有的屏幕与铝板, 并把它放回-20 ° c 孵化器。 在贮存前评估显微镜下水滴的大小、形状和定心。
Representative Results
1. 系统1和 LMB 板 图 1A显示了基于液体系统 (去水) 操作的液体处理器的系统1。该液体系统包括一个容器, 一个泵, 油管, 8 注射器装有阀门和8固定的提示。液类设置被优化, 以吸取/免除了广泛的各种解决方案和多分配到4板 (多免除需要一个相对较大的吸气量过剩)。22 l 水容器和一个小容器 (5 l) 与 20% v/v 氨基苯甲酸二被存放在系统之下哺养液体系统。每个容器都装有两个耦合插入。一个插入 (彩色蓝色) 饲料系统与液体, 另一个 (红色) 是回流, 以减少过剩的压力。使用后, 用水冲洗, 然后20% 伏/五乙醇溶液防止微生物生长。冷却装置 (也位于系统下方) 连接到一个定制的管冷却载体。系统1是2050毫米宽, 包括传送带, 760 毫米深和88毫米高。在该工作台的前部还需要额外的 550 mm, 以控制喷墨打印机和粘板封口机的控制器。在控制 PC 的系统旁边还需要额外的空间。该程序生产72预填充板 (即18 轮4板) 需要3ĥ和50分钟。 图 1B是安装在自动移臂上的8固定提示 (图 1C) 的主甲板的关闭, 第二臂与手爪, 尖端洗涤站, 2 x 4 位的运营商 SBS 板和管冷却载体。主程序处理4板的时候, 自动从传送带上, 并放置在甲板上, 他们是充满结晶条件 (80 µL 在水库,图 1D)。液体的水平是自动检测的提示是导电。当液体处理程序将条件放在一组盘子中时, 另一组空盘子从传送带上取出, 贴上标签, 放在主甲板上。在该液体处理器的后面板中, 需要一个小的自定义内置的刀柄和窗口, 以便将打印机头及其传感器放置在主甲板的背面。在每个分配步骤后, 8 个小贴士被冲洗, 并由主容器中的水冲洗, 其中包括4等分在相应的储层柱中。在4盘被填装了之后, 他们自动地被密封并且安置回到他们的原始的位置在传送带。平板封口机是由特定的驱动程序 (由控制软件调用) 触发的。封口机使用一卷3英寸宽的胶带, 适用于在机械压力下的滚筒。程序完成后, 预填充板将从传送带上手动移除, 并存储在位于设备内的10° c 恒温箱中。 图 1: 用初始筛选套件填充水库.(A) 全面自动化系统1概述。旋转木马是一个独立的自动单元与板栈, 它是在一个很好的丙烯酸板在右手边的主甲板。(B) 液体处理器的主甲板与 (a) 管冷却载体 (连接到下面的一个冷装置) 未显示), (B) 快速清洗站 (连接到排水系统, 未显示), (c) 移臂充填8个96井结晶板的储层, (d) 爪臂将填充板带到 (e) 板封口机的机动 SBS 载体上。在甲板背面是 (f) 喷墨打印机的打印头连接到 (g) 的喷墨控制单元下方的封口机。(C) 有标记的板 (屏幕的名称和生产日期) 由聚四氟乙烯涂层不锈钢制成的8导电固定尖端填充结晶条件。(D) 密封结晶的截面很好。储层含结晶条件80µL (上部井为空)。储层和上部井深度规格在毫米。请单击此处查看此图的较大版本. 表 1显示了测试管中可用的商用屏蔽套件的不同配方。该套件是用来填补96井结晶板 (LMB01-LMB22) 的水库定期与系统1。 车牌名称 套件名称 供应商 目录编号 管 基本描述 LMB01 水晶屏风1 汉普顿研究 HR2-110 48 稀疏矩阵 (pH 值 4.6-8.5) 水晶屏风2 汉普顿研究 HR2-112 48 随机抽样 (pH 值 4.6-9.0) LMB02 向导1 Rigaku 1009530 48 随机抽样 (pH 值 4.5-10.5) 向导2 Rigaku 1009531 48 随机抽样 (pH 值 4.5-10.5) LMB03 网格筛硫酸铵 汉普顿研究 HR2-211 24 网格屏幕, [AmS] = 0.8-3.2 M 和缓冲器 pH 值 4.0-9。0 网格屏幕挂钩/氯化 汉普顿研究 HR2-217 24 网格屏幕, [PEG 6000] = 0-30%w/v, 具体. 氯化 = 1.0 M 和缓冲器 pH 值 4.0-9。0 快速屏幕 汉普顿研究 HR2-221 24 网格屏幕, [NaKPO4] = 0.8-1.8 M 在 pH 值 5.0-8。2 网格筛氯化钠 汉普顿研究 HR2-219 24 网格屏幕, [NaCl] = 1.0-4.0 M 和缓冲器 pH 值 4.0-9。0 LMB04 网格屏 PEG 6000 汉普顿研究 HR2-213 24 网格屏幕, [PEG 6000] = 5-30%w/v 和缓冲器 pH 值 4.0-9。0 网格屏幕 MPD 汉普顿研究 HR2-215 24 网格屏幕 [MPD] = 10-65%w/v 和缓冲器 pH 值 4.0-9。0 MemFac 汉普顿研究 HR2-114 48 膜蛋白的稀疏矩阵 (pH 值 4.6-8.5) LMB05 PEG-离子 汉普顿研究 HR2-126 48 网格屏幕, [PEG 3350] = 20%w/v 和各种盐在 0.2 M (没有缓冲器) Natrix 汉普顿研究 HR2-116 48 不完全阶乘 (pH 值 5.6-8.5) LMB06 水晶屏风简装 汉普顿研究 HR2-128 48 水晶屏幕1与原始的沉淀集中的一半 自定义建兴屏幕 分子尺寸 n/a 48 低沉淀浓度的附加条件 LMB07 向导冷冻1 Rigaku 1009536 48 使用低 cryoprotected 钉 (pH 4.5-9.4) 的随机抽样条件 向导冷冻2 Rigaku 1009537 48 使用低 cryoprotected 钉 (pH 4.5-10.1) 的随机抽样条件 LMB08 JBS1 JenaBioScience CS-101L 24 基于各种销子的不完全阶乘 (pH 值 4.6-9.0) JBS2 JenaBioScience CS-102L 24 基于 PEG 4000 (pH 4.6-8.5) 的不完全阶乘 JBS3 JenaBioScience CS-103L 24 基于 PEG 4000 (pH 4.6-8.5) 的不完全阶乘 JBS4 JenaBioScience CS-104L 24 基于中波钉的不完全阶乘 (pH 值 6.5-8.5) LMB09 JBS5 JenaBioScience CS-105L 24 基于重 MW 销子的不完全阶乘 (pH 值 6.5-9.5) JBS6 JenaBioScience CS-106L 24 基于 AmS 的不完全阶乘 (pH 值 4.6-8.5) JBS7 JenaBioScience CS-107L 24 基于 MPD (pH 值 4.6-8.5) 的不完全阶乘 JBS8 JenaBioScience CS-108L 24 基于 MPD 和乙醇的不完全阶乘 (pH 值 4.6-8.5) LMB10 JBS9 JenaBioScience CS-109L 24 基于共盐和 2-丙醇 (pH 4.6-8.5) 的不完全阶乘 JBS10 JenaBioScience CS-110L 24 基于共盐 (pH 值 4.6-8.5) 的不完全阶乘 清晰的策略屏幕 1 pH 4。5 分子尺寸 MD1-16LMB 24 带有各种销子的网格屏幕 清晰的策略屏幕 1 pH 5。5 分子尺寸 MD1-16LMB 24 带有各种销子的网格屏幕 LMB11 清晰的策略屏幕 1 pH 6。5 分子尺寸 MD1-16LMB 24 带有各种销子的网格屏幕 清晰的策略屏幕 1 pH 7。5 分子尺寸 MD1-16LMB 24 带有各种销子的网格屏幕 清晰的策略屏幕 1 pH 8。5 分子尺寸 MD1-16LMB 24 带有各种销子的网格屏幕 清晰的策略屏幕 2 pH 4。5 分子尺寸 MD1-16LMB 24 带有各种销子的网格屏幕 LMB12 清晰的策略屏幕 2 pH 5。5 分子尺寸 MD1-16LMB 24 带有各种销子的网格屏幕 清晰的策略屏幕 2 pH 6。5 分子尺寸 MD1-16LMB 24 带有各种销子的网格屏幕 清晰的策略屏幕 2 pH 7。5 分子尺寸 MD1-16LMB 24 带有各种销子的网格屏幕 清晰的策略屏幕 2 pH 8。5 分子尺寸 MD1-16LMB 24 带有各种销子的网格屏幕 LMB13 索引 汉普顿研究 HR2-144 96 小稀疏矩阵和网格屏幕 (pH 值 3.0-9.0) LMB14 SaltRX 1 汉普顿研究 HR2-107 48 网格屏幕包括22独特的盐与盐浓度和 pH 值 (4.1-9.0) SaltRX 2 汉普顿研究 HR2-109 48 网格屏幕包括22独特的盐与盐浓度和 pH 值 (4.1-9.0) LMB15 MemStart 分子尺寸 MD1-21 48 膜蛋白的稀疏矩阵 (pH 值 4.0-10.0) MemSys 分子尺寸 MD1-25 48 膜蛋白筛网 (主要是钉, pH 值 3.5-9.5) LMB16 JCSG + qiagen 130720 96 稀疏矩阵 (pH 值 4.0-10.0) LMB17 睡眠屏幕 分子尺寸 MD1-46 96 网屏包括添加剂和 cryoprotected 条件的混合 (pH 值 6.5-8.5) LMB18 Pi 最小屏幕 JenaBioScience CS-127 96 不完全阶乘 (pH 值 4.0-9.5) LMB19 Pi 筛 JenaBioScience CS-128 96 膜蛋白的不完全阶乘 (pH 值 4.8-8.8) LMB20 睡眠 II 屏幕 分子尺寸 MD1-91 96 网格屏幕包括添加剂 (重的原子) 和 cryoprotected 情况 (pH 值 6.5-8.5) 的混合 LMB21 LMB 结晶筛 分子尺寸 MD1-98 96 稀疏矩阵, 包括从 LMB 出版物中选择的条件 LMB22 睡眠 III 屏幕 分子尺寸 n/a 96 网格屏幕包括添加剂 (药物化合物) 和 cryoprotected 条件 (pH 值 6.5-8.5) 的混合 表 1: 在 LMB 板中找到的套件的配方。每个商业筛检套件最初包括 24/48/96 条件的测试管。LMB 板储存在10° c 恒温箱内, 可供用户随时使用。 2. 系统2和设置液滴的要求 图 2A显示了基于液体处理程序19的系统 2, 它使用正位移和一次性提示操作。一次性小费是提供的可堆叠机架, 适合自动处理。一个3位的甲板 nanoliter 分配器20被集成在系统的右手边。nanoliter 分配器上的吸气/免除也使用一次性 microsyringes (在大线轴中提供) 的正位移。作为一个独立的机器人, 一个可移动的带座块是用来装载蛋白质样本 (s)。对于全自动的过程, 一个 384-好的 PCR 板取代了带状持有人。一个类似的胶粘剂板封口机的系统1是集成在左手边。封口机和 nanoliter 分配器站在定制的, 提高工作, 以使主爪, 以达到这两个集成的机器人的板块载体 (一个窗口必须削减在两侧板的液体处理程序, 以获取访问外部主甲板)。主要程序调用特定的驱动程序, 以触发 nanoliter 配药程序和封口机在适当的时间。系统2是2850毫米宽, 800 毫米深和800毫米高。在控制 PC 的显示器旁边需要额外的空间。两个垃圾箱位于系统下方的提示和 microsyringes 在过程中丢弃 (控制 PC 也存储在下面)。系统2的一个重要特性是总体布局, 它保留了对三机器人的方便访问, 以便它们可以单独用于前面描述的优化协议, 或者其他其他的协议, 如结晶膜蛋白在脂相21和随机 microseed 矩阵筛选22。 图 2B是一个装有单个机械手的甲板的关闭。arm 集成了12独立的移探头和主爪。探头的位置可以单独控制在一个方向上, 以便在探头或单管之间沿轴线访问不同的位置。探头可以拾取一次性贴士 (1-12) 或一对平板移动的适配器。两套4栈包含50µL 一次性小费最初加载。液体的水平是自动检测的提示是导电。板移动的适配器是设计与2尖锐的针脚在里面, 形成一个可选的手爪时, 需要。在主甲板上是一个24位微冷却载体为样品, 虽然仅1-2 个位置在这里使用。此外, 还有一个载体的 PCR 板和2存储载体的堆叠, 定制内置的 SBS 眼睑 (图 2C)。最后, 有4滑动载体, 每个有5个位置为结晶板材 (4 x 5 = 20 板材)。 图 2: 设置蒸气扩散实验的液滴。(A) 全面自动化系统概述 2.(B) 与 (a) 操作的液体处理程序的主甲板, 用于堆叠 SBS 盖的存储载体, (B) 可堆叠的提示, (c) 冷却载体与样品在微, (d) 载体为2板块移动适配器, (e) 将蛋白质转移到 nanoliter 搬运机器人的 PCR 板, (f) 9 密封板已放回他们的初始位置, (g) 可选的手爪去除 SBS 盖子的 10th盘子将要被运送到液体处理器的甲板上, (h) 接下来的10个盘子要用 SBS 盖在上面, (i) 主要用于传送 PCR 和结晶板的手爪, (j) 的主要自动化arm 集成12移探头 (2 被用来作为可选的手爪) 和主爪, 和 (k) nanoliter 分配器的甲板。(C) 内部定制的 SBS 盖板由铝制成。盖子集成了一个橡胶板, 以避免蒸发的条件和两个小孔, 以准确地拾取由可选的手爪。(D) 密封结晶的横截面, 其中油藏充满条件, 上井包含由蛋白质样本和条件组成的液滴。由于沉淀在液滴中的浓度比在条件下要少, 所以在通过蒸汽扩散平衡过程中, 水滴中所有组分的含量都会上升 (以箭头表示的非常示意性)。(E) 光显微 100 nl 和 (F) 200 nl 小滴由 nanoliter 分配器产生的测试溶液 (20% v/v 聚乙二醇 400, 0.001% 瓦特/v 红为红色染料)。水滴的大小和形状可能因条件的 chemicophysical 特性而异。请单击此处查看此图的较大版本. 主程序从第一个结晶板上取下 SBS 盖的可选夹具开始。在将盖子转移到相应的储存载体后, 将结晶板运到 nanoliter 分配器的甲板上。然后移臂转移所需的样品量, 从通常的冷冻微到 PCR 板的第一列。随后, 主要的手爪将 PCR 板移到 nanoliter 分配器的甲板上, 它将在用户开始时选择的选项 (e. g. 液滴大小) 上准备液滴。为此, 蛋白质样品首先被分配入上部井 (使用一组 8 microsyringes 和多配药), 然后结晶条件被分配到蛋白质小滴 (每列现在需要8新的 microsyringes 避免交叉污染)。当程序完成后, 设置液滴, 主爪将相应的板运送到板封口机, 然后将 pcr 板放回原位 (在下一列的 pcr 板上会有更多的蛋白质用于下盘).最后, 密封的结晶板被移回其在甲板上的原始位置: 蒸气扩散实验已经开始在这个板块 (图 2D)。这个周期根据板材的数量被重覆。当需要时, 可选的手爪删除一个空的尖端机架允许移手臂访问更多的提示。该程序需要2小时, 20 分钟和440µL 的样品, 用 100 nl 样本 + 100 nl 条件 (图 2E和 2F) 在20板中准备单液滴。 当使用 nanoliter 分配器作为独立的机器人为两个额外的板块 (见协议, 步骤 1.2.3), 整套初始筛板可用在10° c 孵化器可以设置 (22 LMB 板 x 96 条件 = 2112 条件)。 表 2根据系统2上的用户选择显示主程序的要求。 板 放置大小 (nL) 样品 (s) 提示要求 时间 数量 类型 Vol. 1 (µL) Vol. 2 (µL) 50µL 提示 Microsyringes 10 96-井 100 240 0 80 1040 1ĥ 12 min 20 96-井 100 440 0 160 2080 2ĥ 20 min 10 96-井 100 240 240 160 2080 1ĥ 45 min 20 96-井 100 440 440 320 4160 3ĥ 05 min 10 48-井 1000 624 0 80 560 1ĥ 10 min 20 48-井 1000 1208 0 160 1120 2ĥ 16 min 表 2: 系统2中可用的主程序选项的示例, 用于设置结晶液滴.必要数量的蛋白质样本, 提示和 microsyringes 根据程序的不同。样品的容量 “vol. 1” (下落 1) 和 “vol. 2” (下落 2) 被计算如下: (8 提示 x 需要的容量每好 PCR 板材 + 4 µL 丢失的容量) x 数字结晶板材 + 40 µL 死的容量在微。96-井结晶板中 100 nl 液滴的 PCR 板所需的体积为2µL, 6.8 µL 为1000井板中的 48 nl 液滴所需量 (pcr 板井中的死体积: 0.8 µL)。由于微和其他损失的蒸发 (例如贴在小费上的样品), 额外的样品量被考虑到 (“丢失的体积”)。例如, 对于20湄公河板, 100 nL, 1 滴协议, 所需的样本量是: (8 x 2 + 4) x 20 + 40 = 440 µL (即, 相当于每板22µL)。每个盘子和每个样品需要八一次性的50µL 小费。例如, 对于10板, 2-下降协议, 所需的提示数量是 8 x 10 x 2 = 160 提示。microsyringes 的数量计算如下: (8 + 每盘的条件数) x 样本数 x 的车牌数。例如, 对于 10 x 48-井板, 所需的液体处理程序提示的数量是: (8 + 48) x 1 x 10 = 560 提示。 3. 4 角解决方案的拟订、准备和处理 4角解决方案 (“A、B、C 和 D”) 和相应的优化屏幕 (图 3A) 的两个公式都是由Excel 电子表格自动生成的。对于不同数量的条件 (实质上是24、48和96条件) 有不同的电子表格, 并且还有电子表格, 用于在一个单板上准备两个不同的优化屏幕。你通常准备一组 4 x 10 毫升的角解决方案, 在试管中的2-3 个优化屏幕可以准备, 根据所需的条件数量和量。这些溶液被倒入槽中, 由注射器为基础的液体处理剂吸入, 然后直接放入盘子 (图 3B)。两个线性渐变的浓度是由混合 A, B, C 和 D 在系统变化的比率 (图 3C)。 图 3: 用于准备优化屏幕的4角方法.(a) 表示两个浓度在 96-井板布局上的渐变。(B) 以注射器为基础的液体处理程序准备在机器人头部插入4注射器的屏幕。一个结晶板位于机动 SBS 载体和4启动解决方案 (A, B, C, 和 D) 已经被分配到各自的低谷 (解决方案已被有色红色为示范目的)。(C) 解决方案 A、B、C 和 D 在96油藏中的比率。请单击此处查看此图的较大版本. 表 3显示了对基于注射器的液体处理程序用户可用的程序的要求。 板型 笑的条件 Vol. 在板材 (水库, µL) Vol. 槽 (毫升) 时间 96-井 48 80 1。6 2分5秒 96-井 96 80 2。5 3分50秒 96-井 2 x 48 80 1。6 2分50秒 48-井 24 200 1。8 2分25秒 48-井 48 200 3 4分20秒 表 3: 根据4角方法准备最优化屏幕的基于注射器的液体处理器上的可用程序.96井板可用于准备96或48条件的优化屏幕 (当两个48条件的屏幕同时准备, 机器人必须配备8注射器和8槽)。其他程序允许使用48井板。在水槽中列出的体积包括所需的死体积 (0.5 毫升)。 4. 添加剂筛选 图 4显示了在结晶板 (协议 1) 的储油层中或在低剖面细胞培养板的井中使用的96添加剂解决方案 (作为可再用的添加剂屏幕) 开始执行加性筛选的步骤 (议定书 2)。表 4根据两种类型的协议列出了 nanoliter 分配器上可用的程序。 图 4: 两种类型的附加筛选协议.96-添加剂屏幕在-20 ° c 被存放。在协议1之后, 添加剂屏幕最初增加到结晶板的储层 (和理想地储备了此方式)。液体处理剂或 multipipette 用于将条件分配到含有加性溶液的储层中 (加成屏幕的体积代表储层中最后体积的 10%: 8 µL 为80µL 最后体积)。在混合微混合器 (未显示) 的条件后, 使用基于微量的 nanoliter 分配器来设置液滴 (表 4)。在协议2之后, 添加的屏幕在设置结晶液滴的时候才会增加。这一次, nanoliter 分配器被用来准备在其甲板上的一个额外的组件 (可再使用的细胞培养板含有添加剂屏幕) 的液滴。请单击此处查看此图的较大版本. 议定书 放置大小 (nL) 条形类型 样品 vol. (µL) 笑的 microsyringes 时间 类型 添加剂的来源 蛋白 条件 添加剂 在每个井 (带) 总 1 96-井结晶板 100 100 0 2µL 2 16 104 2分钟 1 96-井结晶板 200 200 0 5µL 3。8 31 104 2min 10 秒 2 96孔细胞培养板 200 200 100 5µL 3。8 31 200 3min 45 秒 2 96孔细胞培养板 500 500 100 5µL 7。4 60 200 4min 15 秒 表 4: 基于微量的 nanoliter 分配器的程序, 可用于加性筛选.8井带各井中所需的样品量计算如下: 死体积 + 12 x 滴大小。有2种类型的长条 (2 µL 和5µL)。死的容量是0.8 µL 为2µL 井 (实际上可能包含3.2 µL 最大) 和1.4 µL 为5µL 井 (7.5 µL 最大.)。所需的蛋白质总量是: 8 x 体积的小条 (四舍五入值)。96井细胞培养板 V 型井的死体积为2.5 µL。所需的 microsyringes 数量根据所选程序的不同 (8 + 96 = 104; 或 8 + 2 x 96 = 200)。 由于条件的稀释与添加剂在协议1期间, 条件需要准备以比例地更高的集中比最初。最终浓度的增加最容易通过减少最后的水量到计算出的最终体积来达到。在这之后, 你简单地进行与正常设置的液滴混合条件和样本 (例如, 100 nl 蛋白 + 100 nl 条件已经与添加剂混合)。协议 2 (例如, 200 nl 蛋白 + 200 nl 条件 + 100 nl 添加剂) 方便了不同浓度的添加剂的筛选, 只需改变添加加网的体积即可。协议2意味着或多或少的稀释液滴 (可能会改变结晶)。 从系统2的液体处理程序可以用来抽吸足够的条件12提示和分配8等分到水库的 96-井板 (见协议, 步骤 2.2.2), 虽然这一步当然可以做手动与多通道吸管 (图 4)。在使用液体处理器时, 可以在同一条件下填充多个板 (稍后测试不同的添加剂屏幕)。在准备2板时, 用至少23毫升填充试剂容器。在准备3板时, 用至少31毫升填充试剂容器。 5. 结晶板及相关器件 该设计的两个坐滴蒸气扩散结晶板 (96 井 2-下降和48井1滴,图 5A和图 5B) 提供的特点, 使可靠和高效的自动化结晶实验,以突出的球形形状的上层井和一个轻微的 V 形的水库, 以促进精确的配药和离心时, 中心的液滴是必需的。另外, 上部井有透镜作用为最佳的照明在显微镜之下 (聚合物是紫外传染性的为检测紫外吸收或萤光晶体23)。 自定义密封 (图 5C) 可以使用 nanoliter 分配器 (未显示的协议) 在两种类型的板中设置悬挂式结晶实验。最后, 两个湄公河板块具有相同的外维度和边缘。rim 适用于我们定制的板架 (图 5D) 的凹槽, 用于手动放置/拆卸密封胶带而不溅液体。 图 5: 在 LMB 上开发的湄公河结晶板和相关器件.(A) A1-corner 96 井板。储层 (长方形) 是在左手边结晶井, 二个球形上部井在右边。尺寸以毫米为单位。(B) A1-corner 48 井板。水库在井的右手边 (1 只大上部井)。(C) 悬挂滴封条。(D) 内部自定义板架。请单击此处查看此图的较大版本. 6. 蛋白质晶体 图 6显示了使用自动协议获得的有用晶体的示例。 图 6: 在自动协议之后获得的含晶体的水滴的光显微.(A, B)OmpF 和 MreB 的初始屏幕上的晶体由2全自动系统 (参见协议部分1.1 和 1.2, 条件: LMB07 井 A4 和 LMB20 井 D12, 分别, 雾滴的大小是 100 nl 蛋白 + 100 nl 条件, 工作安杰伊·阿布拉谢夫斯基 Szewczak, LMB)24。(C, D)在初始条件优化之前和之后的条形域晶体与4角方法 (步骤 2.1, LMB02 B6, 1000 nl + 1000 nl, 未出版的工作, 索萨, LMB)。(E, F)重链人蛋白 1 N 端域晶体的初始条件优化前后的初始条件与4角法 (LMB20 E6, 200 nl + 200 nl, 然后 500 nl + 500 nl, 未出版的工作埃德加-r, LMB)。(G, H)补充因子 D 晶体的优化之前和之后的条件与添加剂筛选 (步骤 2.2, 初始条件从内部定制屏幕, 200 nl + 200 nl, 添加剂 D6 从96条件的加法屏幕, 未发布的工作 Matthias 鲍尔,LMB)。(I, J)病毒包膜糖蛋白25晶体的优化前后的条件与加性筛选 (步骤 2.3, LMB20 A2, 150 nl + 150 nl, 然后 200 nl + 200nL + 100 nl 添加剂 E5 从96条件的加法屏幕, 未发布的工作 Yorgo英国剑桥大学, Modis。请单击此处查看此图的较大版本.
Discussion
1-存储在板中的初始屏幕的准备和使用
由于在贮存过程中, 在某些管中会出现光沉淀或相分离现象, 所以在将其放入盘子之前, 应先将其混合。当一个屏幕是由两个套件 (2 x 48 管), 第一管的第二个套件是放置在位置 E1 的冷却载体。当一个屏幕由4套件 (4 x 24 管), 第二个套件的第一管放置在位置 C1, 第三个套件的第一管放置在位置 E1 和第四套件的第一管放置在位置 G1。在其冷却托架中插入管时, 将盖子放在标准96井景观布局后的托盘上。由于油井的数量是由制造商在盖子上表示的, 这使得交叉检查, 如果所有的管道已被放置在正确的顺序。这也有助于更换正确的盖子上的管子时, 填补了减少数量的板块。
我们将预填充的钢板储存在10° c 处, 以避免在4° c 处结冰和贮存, 这可能导致条件恶化和密封问题。在密封件的内面上通常没有明显的凝结, 所以板被储存了几个月。这是不正确的 LMB05, LMB06, LMB09 和 LMB10 板, 因为这些包含的条件相对较高的浓度挥发性试剂 (表 1)。密封的内侧有少量的冷凝, 降低了密封效率, 在启封板时会造成井间的交叉污染。为了帮助防止在最初的冷却过程中凝结, 盘子可以首先从传送带转移到一个隔热的野餐冷却器, 这是储存在一个晚上4° c 冷室。非常缓慢的冷却最小化了密封井内温度梯度的发展, 从而减少了整个15的冷凝。此外, 一旦板块被储存在10° c 孵化器, 一个内部定制的 SBS 聚苯乙烯盖放在板上的每个栈顶部 (没有显示)。
我们的整套预填充板可以作为一个大的初始屏幕对一个新的, 水溶性, 蛋白质样本。或者, 可以选择较少的板来满足特定的要求。例如, LMB15 和 LMB19 是专门为膜蛋白样本制定的屏幕26,27, 或 LMB20 是一个用重原子制定的屏幕, 以方便实验性的衍射数据的阶段,28 (参见:睡眠蛋白结晶筛的公式化)。
2. 设置结晶液滴
在使用系统2时, 应首先处理具有大量挥发性试剂的筛分试剂盒。这样可以避免 SBS 盖上的橡胶形成凝结, 从而影响盖子的处理和板的密封。SBS 盖子在板的顶部有一点间隙, 这就是为什么它们最初需要对齐 (参见协议, 步骤 1.2.6)。在 PCR 板的井中的蛋白质死的容量是相对地慷慨的 (0.8 µL, 参见表 2的传奇)。请注意, 当使用 nanoliter 分配器在8井条 (表 4) 中单独用蛋白质时, 也会采用同样慷慨的死卷。更小的死的容量可能工作, 然而有些样品坚持提示, 机器人的定标可能变得轻微地不准确, 房间可能比通常温暖,等。所有这些都导致了慷慨的死卷所涵盖的样本损失, 以巩固这种做法。
最近的发展使实验进一步小型化, 因此, 通过集成相应的技术29,30, 可以大大减少筛选结晶条件所需的样本量..但是, 进一步小型化的某些方面需要仔细考虑, 如水滴31的蒸发和微32的操作。
最后, 在设置结晶液滴 (球形上井) 时, 可以将板材的离心 (2000 rpm, 1 分钟) 整合为常规的最后一步。离心产生的液滴的尺寸和形状越一致, 可能会减少重现性问题33,34。当然, 集中的水滴将会用显微镜来缓解以后的实验评估, 因为在整个板块中, 所需的焦距将是相似的。
3. 4 角法的优点
4角方法最重要的优点是它的简单性, 它使错误最小化, 并方便了简单的自动化协议。例如, 4 角解决方案将始终放置在一个液体处理程序的甲板上, 按照相同的布局。此外, 所有程序都基于解决方案之间的固定比率 (图 3C)。
手动准备4角解决方案是首选的自动化处理的解决方案在高浓度, 可以高度粘性。相对快速和准确的吸入/配药, 然后可能在大多数类型的液体处理, 最低要求的优化液体类。然而, 一些角落的解决方案可能仍然过于粘性的机器人运行的液体系统, 有效地运行。这就是为什么我们选择了一个具有正位移的液体处理程序 (图 3B)。
除了2的浓度线性梯度, 第三个组成部分 (即, 一组缓冲器/添加剂) 可以在一个恒定的浓度在一个方便的方式测试。为此, 一个相对地大容量一组核心的角落解答在适当地更高的集中, 不包括组分要变化, 首先准备。然后, 添加包括此组件的库存解决方案来调整最终的浓度。例如, 50 毫升的一套4角解决方案是准备在10% 以上的浓度比最初。这个核心集合然后被分裂成5更小的子集4。最后, 在每个子集中添加了10% 个不同的缓冲 pH 解的体积。
4. 添加剂屏幕的格式和类型
屏幕通常存储在-20 ° c (图 4) 中, 因为它们不经常使用, 并且含有挥发性/不稳定化合物。在深井区块 (1 毫升) 中储存的冷冻添加剂筛网的使用必须提前计划, 因为所有的添加剂解决方案需要12-24 小时才能完全在室温下解冻。此外, 许多用户共享相同的添加屏幕, 可能导致交叉污染问题。最后, 深井块的高度使它们不适合大多数 nanoliter 分配器。作为绕过这些问题的一种方便的解决方案, 屏幕应该从深井块转移到低剖面板 (图 4)。
从历史上看, 包含多种单一试剂 (单浓度) 的加性屏幕非常受欢迎35,36。然而, 其他类型的添加剂屏幕已经开发, 集成混合的添加剂37或减少数量的单一添加剂发现在不同浓度的38。最后, 一个互补的方法是研究添加剂对样品的影响之前的结晶39,40。
5. 更多的考虑
良好做法:大多数屏幕都含有有害或甚至有毒物质, 因此在协议中必须使用适当的个人保护。同样, 机器人的移动部分可能会导致受伤, 特别是当程序正在运行时 (虽然大多数机器人都有紧急停止按钮/系统), 但在尝试手动干扰时。由于涉及的技术复杂性, 定期检查机器人, 屏幕和程序与以前的特征测试样本是重要的持续高水平的重现性。
吞吐量:作为一个征兆, 在4000到8000之间 LMB 板材年年被生产与系统 1 (和以后使用由用户为初步筛选)。当预期营业额低得多时, 不适合在10° c 下储存大量预填充板, 因为在4-5 月后, 某些条件会开始变质和蒸发。对于中小型实验室, 已经实施了不同的自动化协议方法41。
存储和评估实验:在制备液滴后, 在4或18° c 的室温下, 以严格控制的温度 (+/-0.5 ° c 最大偏差) 将板储存在低振动的货架上。实验用冷光源显微镜进行评估。各种自动化成像系统都是商用的, 但是一个应该仔细考虑所有方面: 扫描一个盘子所需的速度是否足够高吞吐量？除了晶体以外的物体是否会干扰自动对焦？图像的质量是否足以发现非常小的晶体 (特别是在水滴的边缘)？42,43,44
结晶条件比较:在仔细调查了最初获得的晶体的性质之后, 您可以使用LMB 屏幕数据库或 C6 Web 工具45来分析各种情况下的趋势和相似性。
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LMB 结晶设施得到医学研究委员会 (英国) 的支持。我们感谢 LMB 的成员们的支持: 奥尔加佩里希奇 (PNAC), 托尼沃恩, Fusinita 范窝耳鼻喉科和帕特爱德华兹 (结构研究), 史蒂夫 Scotcher 和其他成员的机械车间, 尼尔格兰特和 Jo (视觉教具), 保罗哈特和汤姆普拉特 (它)。我们也要感谢史蒂夫艾略特 (Tecan, 英国), 米切尔和希瑟 Ringrose (汉密尔顿机器人学, 英国), 保罗解冻, 罗伯特刘易斯和 Joby 詹金斯 (Labtech, 英国), 保罗里尔登 (Swissci AG, 瑞士), 乔治斯蒂芬斯和唐纳德 Ogg (Alphabiotech,英国), 尼尔威廉斯 (马肯玛士, 英国) 和格雷厄姆哈里斯 (克利夫兰代办处) 为技术帮助。
Materials
| Robots | |||
| Freedom EVO® | Tecan | n/a | Liquid handler (System 1). Aspiration/Dispense based on system liquid. Integrates an automated carousel. EVOware plus controlling software v.2.4.12.0. |
| Microlab® STAR™ | Hamilton | n/a | Liquid handler (System 2). Aspiration/Dispense based on positive displacement (CO-RE™ technology). Hamilton STAR controlling software v.4.3.5.4785 with method management interface. |
| Mosquito® | TTP Labtech | n/a | Microsyringe-based nanoliter dispenser used to set up droplets (System 2 and stand-alone), 3-position deck. Controlling software v.3.11.0.1422. |
| Dragonfly® | TTP Labtech | n/a | Syringe-based liquid handler used to produce optimization screens (4-corner method). Controlling software v.1.2.1.10196. |
| Adhesive plate sealer | Brandel | n/a | Integrated to Systems 1 and 2 (also used as stand-alone robot). |
| Inkjet printer 9232 | Markem-Imaje | n/a | Integrated to System 1. Touchscreen interface. |
| Crystallization screens | |||
| Crystal Screen™ 1 | Hampton Research | HR2-110 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01 |
| Crystal Screen 2™ | Hampton Research | HR2-112 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01 |
| Wizard™ Classic 1 | Rigaku | 1009530 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02 |
| Wizard™ Classic 2 | Rigaku | 1009531 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02 |
| Grid Screen™ Ammonium Sulfate | Hampton Research | HR2-211 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03 |
| Grid Screen™ PEG/LiCl | Hampton Research | HR2-217 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03 |
| Quick Screen™ | Hampton Research | HR2-221 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03 |
| Grid Screen™ Sodium Chloride | Hampton Research | HR2-219 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03 |
| Grid Screen™ PEG 6000 | Hampton Research | HR2-213 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04 |
| Grid Screen™ MPD | Hampton Research | HR2-215 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04 |
| MemFac™ | Hampton Research | HR2-114 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04 |
| PEG/Ion™ | Hampton Research | HR2-126 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05 |
| Natrix™ | Hampton Research | HR2-116 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05 |
| Crystal Screen Lite™ | Hampton Research | HR2-128 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06 |
| Custom Lite screen | Molecular Dimensions Ltd | n/a | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06 |
| Wizard™ Cryo 1 | Rigaku | 1009536 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07 |
| Wizard™ Cryo 2 | Rigaku | 1009537 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07 |
| JBS1 | JenaBioScience | CS-101L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08 |
| JBS2 | JenaBioScience | CS-102L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08 |
| JBS3 | JenaBioScience | CS-103L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08 |
| JBS4 | JenaBioScience | CS-104L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08 |
| JBS5 | JenaBioScience | CS-105L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09 |
| JBS6 | JenaBioScience | CS-106L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09 |
| JBS7 | JenaBioScience | CS-107L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09 |
| JBS8 | JenaBioScience | CS-108L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09 |
| JBS9 | JenaBioScience | CS-109L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10 |
| JBS10 | JenaBioScience | CS-110L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10 |
| Clear Strategy™ Screen 1 pH 4.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10 |
| Clear Strategy™ Screen 1 pH 5.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10 |
| Clear Strategy™ Screen 1 pH 6.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11 |
| Clear Strategy™ Screen 1 pH 7.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11 |
| Clear Strategy™ Screen 1 pH 8.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11 |
| Clear Strategy™ Screen 2 pH 4.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11 |
| Clear Strategy™ Screen 2 pH 5.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12 |
| Clear Strategy™ Screen 2 pH 6.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12 |
| Clear Strategy™ Screen 2 pH 7.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12 |
| Clear Strategy™ Screen 2 pH 8.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12 |
| Index™ | Hampton Research | HR2-144 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB13 |
| SaltRX™ 1 | Hampton Research | HR2-107 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14 |
| SaltRX™ 2 | Hampton Research | HR2-109 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14 |
| MemStar™ | Molecular Dimensions Ltd | MD1-21 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15 |
| MemSys™ | Molecular Dimensions Ltd | MD1-25 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15 |
| JCSG-plus™ Suite | Qiagen | 130720 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB16 |
| MORPHEUS® screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-46 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB17 |
| Pi minimal screen | JenaBioScience | CS-127 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB18 |
| Pi-PEG screen | JenaBioScience | CS-128 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB19 |
| MORPHEUS® II screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-91 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB20 |
| LMB crystallization screen™ | Molecular Dimensions Ltd | MD1-98 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB21 |
| Additive screens | |||
| HT additive screen | Hampton Research | HR2-138 | Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well). |
| MORPHEUS® additive screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-93-500 | Frozen in 96-well deepwell block (500 µL per well). |
| ANGSTROM additive screen™ | Molecular Dimensions Ltd | MD1-100 | Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well). |
| MORPHEUS® additive screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-93 | Frozen in 96-well cell culture Costar® plate with V-shaped wells (100 µL per well). |
| ANGSTROM additive screen™ | Molecular Dimensions Ltd | MD1-100-FX | Frozen in 96-well cell culture Costar® plate with V-shaped well (100 µL per well). |
| HIPPOCRATES additive screen | Molecular Dimensions Ltd | n/a | 48 single additives (drug compounds found in MORPHEUS® III). |
| Other consumables | |||
| 96-well MRC 2-drop plate | Swissci | MRC 96T-UVP | Sitting-drop, vapor diffusion plate. Reservoir recommended volume: 80 µL. Range of useful droplet volumes: 10-1000 nL. UV transmissible. |
| 48-well MRC 1-drop plate ('MAXI plate') | Swissci | MMX01-UVP | Sitting-drop, vapor diffusion plate for scale-up/optimization. Reservoir recommended volume: 200 µL. Range of useful droplet volumes: 0.1-10 µL. UV transmissible. |
| MRC hanging drop seal | Swissci | n/a | Hanging-drop, compatible with both MRC vapor diffusion plates (MRC 96T-UVP and MMX01-UVP ). UV and X-ray transmissible. |
| Adhesive sealing tape | Hampton Research | HR4-50 | 3-inch wide Duck® HD Clear™ for sealer and manual sealing. |
| Adhesive aluminium sheet | Beckman Coulter | 538619 | Used to reseal additive screens. |
| Ink cartridge | Markem-Imaje | 9651 | System 1 (inkjet printer). |
| Solvent cartridge | Markem-Imaje | 8652 | System 1 (inkjet printer). |
| 50 µL tips | Hamilton | 235947 | System 2 (STAR™ liquid handler). Box of 6 sets with 1920 x CO-RE™ tips in disposable stacks. |
| Reagent container | Hamilton | 194052 | Used to dispense a condition into plate(s) during additive screening protocols. |
| PCR plate | Thermo Scientific™ | AB-2150 | System 2 (contains protein to be transfer to the Mosquito®). Abgene Diamond ultra, 384 V-shaped wells. |
| microsyringes | TTP Labtech | 4150-03020 | Spool of 26,000 microsyringes for the Mosquito® nanoliter dispenser (9mm spacing). |
| strip-holder block | TTP Labtech | 3019-05013 | SSB device for the Mosquito® strips, aka '4-way Reagent Holder'. |
| 2 µL 8-well strip | TTP Labtech | 4150-03110 | Contains protein on the deck of the Mosquito®. Box of 40 strips, max. vol. in well is 3.2 µL. |
| 5 µL 8-well strip | TTP Labtech | 4150-03100 | Contains protein on the deck of the Mosquito®. Box of 40 strips, max. vol. in well is 7.5 µL. |
| 5 mL syringes | TTP Labtech | 4150-07100 | Syringe body and piston for the Dragonfly® liquid handler. Pack of 100. |
| Troughs/Reservoirs | TTP Labtech | 4150-07103 | Contains stock solutions on the deck of the Dragonfly®. Pack of 50. |
| Orbital microplate shaker | CamLab Limited | n/a | Variomag® for mixing conditions in a single plate (0-2000 rpm). |
| Microplate mixer | TTP Labtech | 3121-01015 | MxOne. Mixing condition in a single plate with 96 vibrating pins. |
Referências
- Rupp, B. . Biomolecular Crystallography: Principles, Practice and Application to Structural Biology. , (2010).
- McPherson, A. Introduction to protein crystallization. Methods. 34, 254-265 (2004).
- Bergfors, T. M. . Protein crystallization: techniques, strategies, and tips: a laboratory manual. , (1999).
- Dessau, M. A., Modis, Y. Protein Crystallization for X-ray Crystallography. J. Vis. Exp. (47), e2285 (2011).
- Crick, F. H. C. X-Ray Diffraction of Protein Crystals. Methods Enzymol. 4, 127-146 (1957).
- Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits. FEBS J. 281, 3995-4009 (2014).
- Chruszcz, M., Wlodawer, A., Minor, W. Determination of Protein Structures-A Series of Fortunate Events. Biophys. J. 95, 1-9 (2008).
- Manjasetty, B. A., Büssow, K., Panjikar, S., Turnbull, A. P. Current methods in structural proteomics and its applications in biological sciences. 3 Biotech. 2, 89-113 (2012).
- Carter, C. W., Carter, C. W. Protein crystallization using incomplete factorial experiments. J. Biol. Chem. 254, 12219-12223 (1979).
- Jancarik, J., Kim, S. H. Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. J. Appl. Cryst. 23, 409-411 (1991).
- Stevens, R. C. High-throughput protein crystallization. Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 558-563 (2000).
- Berry, I. M., Dym, O., Esnouf, R. M., Harlos, K., Meged, R., Perrakis, A., Sussman, J. L., Walter, T. S., Wilson, J., Messerschmidt, A. SPINE high-throughput crystallization, crystal imaging and recognition techniques: current state, performance analysis, new technologies and future aspects. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1137-1149 (2006).
- Luft, J. R., Collins, R. J., Fehrman, N. A., Lauricella, A. M., Veatch, C. K., DeTitta, G. T. A deliberate approach to screening for initial crystallization conditions of biological macromolecules. J. Struct. Biol. 142, 170-179 (2003).
- Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. S. Membrane protein structure determination-the next generation. Biochim. Biophys. Acta. 1838, 78-87 (2014).
- Stock, D., Perisic, O., Löwe, J. Robotic nanoliter protein crystallisation at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Prog. Biophys. Mol. Biol. 88, 311-327 (2005).
- Gorrec, F. The current approach to initial crystallization screening of proteins is under-sampled. J. Appl. Cryst. 46, 795-797 (2013).
- Hennessy, D. N., Narayanan, B., Rosenberg, J. M. Automatic implementation of precise grid screens: the four-corners method. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1001-1003 (2009).
- Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).
- DiLorenzo, M. E., Timoney, C. F., Felder, R. A. Technological Advancements in Liquid Handling Robotics. JALA. 6, 36-40 (2001).
- Jenkins, J., Cook, M. Mosquito: An Accurate Nanoliter Dispensing Technology. JALA. 9, 257-261 (2004).
- Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. J. Vis. Exp. (67), e4000 (2012).
- Till, M., Robson, A., Byrne, M. J., Nair, A. V., Kolek, S. A., Shaw Stewart, P. D., Race, P. R. Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening. J. Vis. Exp. (78), e50548 (2013).
- Dierks, K., Meyer, A., Oberthür, D., Rapp, G., Einspahr, H., Betzel, C. Efficient UV detection of protein crystals enabled by fluorescence excitation at wavelengths longer than 300 nm. Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 66, 478-484 (2010).
- Szewczak, A. . Structural studies of the bacterial MreBCD complex. , (2016).
- Nayak, V., Dessau, M., Kucera, K., Anthony, K., Ledizet, M., Modis, Y. Crystal structure of dengue virus type 1 envelope protein in the postfusion conformation and its implications for membrane fusion. J. Virol. 83, 4338-4344 (2009).
- Gorrec, F., Palmer, C. M., Lebon, G., Warne, T. Pi sampling: a methodical and flexible approach to initial macromolecular crystallization screening. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67, 463-470 (2011).
- Parker, J. L., Newstead, S. Current trends in α-helical membrane protein crystallization: An update. Protein Sci. 21, 1358-1365 (2012).
- Gorrec, F. The MORPHEUS II protein crystallization screen. Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 71, 831-837 (2015).
- Yin, X., et al. Hitting the target: fragment screening with acoustic in situ co-crystallization of proteins plus fragment libraries on pin-mounted data-collection micromeshes. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 70, 1177-1189 (2014).
- Wu, P., Noland, C., Ultsch, M., Edwards, B., Harris, D., Mayer, R., Harris, S. F. Developments in the Implementation of Acoustic Droplet Ejection for Protein Crystallography. JALA. 21, 97-106 (2015).
- Zipper, L. E., et al. A simple technique to reduce evaporation of crystallization droplets by using plate lids with apertures for adding liquids. Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 70, 1707-1713 (2014).
- Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. Microcrystal manipulation with laser tweezers. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69, 1297-1302 (2013).
- Newman, J. Initial Evaluations of the Reproducibility of Vapor-Diffusion Crystallization. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63, 826-832 (2007).
- Reis, N. M., Chirgadze, D. Y., Blundell, T. L., Mackley, M. R. The effect of protein-precipitant interfaces and applied shear on the nucleation and growth of lysozyme crystal. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1127-1139 (2009).
- McPherson, A., Koszelak., S., Axelrod, H., Day, J., Robinson, L., McGrath, M., Williams, R., Cascio, D. The effects of neutral detergents on the crystallization of soluble proteins. J. Crystal Growth. 76 (3), 547-553 (1986).
- Sauter, C., Ng, J. D., Lorber, B., Keith, G., Brion, P., Hosseini, M. W., Lehn, J. -. M., Giegé, R. Additives for the crystallization of proteins and nucleic acids. J. Crystal Growth. 196, 365-376 (1999).
- McPherson, A., Cudney, B. Searching for silver bullets: an alternative strategy for crystallizing macromolecules. J. Struct. Biol. 156, 387-406 (2006).
- Gorrec, F. Protein crystallization screens developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Drug Discov. Today. 21, 819-825 (2016).
- Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal. Biochem. 357, 289-298 (2006).
- Chari, A., et al. ProteoPlex: stability optimization of macromolecular complexes by sparse-matrix screening of chemical space. Nat. Methods. 12, 859-865 (2015).
- Newman, J., Egan, D., Walter, T. S., Meged, R., Berry, I., Ben Jelloul, M., Sussman, J. L., Stuart, D. I., Perrakis, A. Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61, 1426-1431 (2005).
- Wilson, J. Automated Evaluation of Crystallisation Experiments. Cryst. Rev. 10, 73-84 (2004).
- Snell, E. H., et al. Establishing a training set through the visual analysis of crystallization trials. Part I: ∼150 000 images. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64, 1123-1130 (2008).
- Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55, 379-386 (2011).
- Newman, J., Fazio, V., Lawson, B., Peat, T. The C6 Web Tool: A Resource for the Rational Selection of Crystallization Conditions. Cryst. Growth & Des. 13, 12219-12223 (2010).
Citar este artigo
Gorrec, F., Löwe, J. Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology. J. Vis. Exp. (131), e55790, doi:10.3791/55790 (2018).