Интеграция миниатюрной твердофазной экстракции и LC-MS / MS Обнаружение 3-нитротирозина в моче человека для клинических применений

В последние годы воздействие окислительного стресса на клиническое проявление было выдвинуто на первый план ¹ . Один из исследованных биомаркеров представляет собой 3-нитротирозин (3-NT), конечный стабильный продукт, образующийся при взаимодействии реакционноспособных видов азота (RNS) с тирозином, предшественником нейротрансмиттера катехоламина. Хотя 3-NT может иметь клиническое значение в качестве биомаркера для RNS in vivo, существенные изменения свойств и функций тирозина могут неблагоприятно влиять на соответствующие белки и клеточные функции ^{1 , 2} . Новые исследования показали, что 3-NT может играть важную роль в воспалительных заболеваниях ³ , нейродегенеративных расстройствах ^{4 , 5} , сердечно-сосудистых заболеваниях ⁶ и диабете ^7, а также в условиях, связанных с окислительным стрессом. Однако эти обманкиОснованные на результатах методологий, не обладающих чувствительностью и / или селективностью ^{8 , 9 , 10 , 11} . Огромные диапазоны концентраций 3-НТ для биологических образцов, о которых сообщалось ранее в литературе, показывают, что с этими анализами связаны серьезные аналитические проблемы, и требуется техническое усовершенствование для точного количественного определения уровней 3-НТ и проверки его роли в патологии этих условий ,

Количественное определение свободных 3-NT в биологических матрицах представляет особый вызов человеку и инструменту ^{8 , 9 , 10 , 11} . Во-первых, уровень следа эндогенного 3-NT требует ультрачувствительного обнаружения; Во-вторых, существование многочисленных структурно подобных аналогов, особенно тирозина, которое присутствует вОгромный избыток, требует высокой степени избирательности; В-третьих, артефактное образование 3-NT тирозиновым нитрованием с вездесущим нитратом и нитритом требует особого рассмотрения при подготовке образца, чтобы избежать ложной переоценки 3-NT.

Среди широкого спектра методологий, используемых для измерения 3-NT, MS / MS считается золотым стандартным методом из-за его превосходной чувствительности и селективности ^{11 , 12 , 13 , 14} . Газовая хроматография (ГХ), связанная с MS / MS, обеспечивает лучшую чувствительность, однако незаменимые этапы дериватизации образцов слишком утомительны и требуют много времени, чтобы быть эффективными для клинической полезности ^{15 , 16} . LC-MS / MS не требует сложной дериватизации образцов, что делает его более перспективным. Тем не менее, есть несколько препятствий для преодоления, таких какВ литературе необходимо повысить чувствительность методов LC-MS / MS, которые необходимо улучшить для измерения низких концентраций 3-NT ^{7 , 17 , 18,} и относительно длительное время поворота должно быть сокращено для высокопроизводительных приложений ^{12 , 13 , 17 , 19} ,

Кроме того, при рассмотрении клинических применений важную роль играет используемая биологическая матрица. Это должно быть легко и недорого для получения и неинвазивного, если это возможно, ^{20 , 21 , 22} . Плазма, традиционно используемая в литературе, не является клинически желательной матрицей, поэтому была запрошена методология использования неинвазивной и рентабельной мочи.

Несколько попыток разработать relМетоды LC-MS / MS были разработаны с использованием мочи ^{9 , 10 , 11} . Тем не менее, они все еще не были избирательными, надежными или эффективными для клинического использования. Эффективность преобладающего SPE с использованием традиционного картриджа с обращенной фазой (тип C18) в качестве очистки образца для анализа 3-NT была поставлена ​​под сомнение и предложена последовательная SPE сильного катионного обмена (SCX) и обратная фаза C18-OH ^{6 , 7 , 19} . В недавно разработанном методе LC-MS / MS использовался многоступенчатый процесс очистки ручного C18 SPE, препаративной жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) и онлайн-SPE для анализа 3-NT ²³ . Хотя этот метод был достаточно чувствительным для клинических целей, с LLOQ 0,041 нМ, процесс очистки был интенсивным и утомительным и требовалКрасный 3 мл мочи, что ограничивает его возможность высокой пропускной способности. В качестве сорбента SPE использовали молекулярно-импринтированный полимер для повышения эффективности процесса очистки ¹⁴ , но полученный LLOQ (0,7 мкг / мл) был недостаточно низким для клинических образцов. Другой метод требовал двумерной (2D) LC-MS / MS и иммуноаффинной хроматографии для очистки образца для достижения предела обнаружения (LOD) 0,022 нМ ²⁴ . Хотя все эти методы сделали успехи в оценке 3-NT, ни один из них не достиг чувствительности, надежности и эффективности, необходимых для клинических применений.

Чтобы исследовать патологию свободного 3-NT и его роль биомаркера окислительного стресса в клинических условиях, мы разработали простую, эффективную, точную и точную методологию, позволяющую применять высокопроизводительные клинические применения ²⁵ . Миниатюрный катион смешанного режима(MCX) была выполнена 96-луночная микропланшетная микропланшетная установка для обеспечения простой и эффективной очистки образца и обогащения 3-NT в одной экстракции, минуя недостатки, существующие в существующих методах, которые требуют дериватизации, испарения и 2D-LC. Жидкая хроматография с 0,01% HCOOH в качестве добавки в подвижной фазе обеспечивала повышенный сигнал с быстрым временем цикла. Селективность была дополнительно улучшена за счет применения мягкого раствора элюирования NH ₄ OAc для селективного элюирования 3-NT и использования перехода MRM как для 3-NT, так и для внутреннего стандарта (IS). Матричный эффект был компенсирован за счет использования уменьшенного количества предпочтительной ¹³ С-меченой изотопной ИС для количественной оценки. С появлением этой методологии исследователи и клиницисты смогут проверить роль 3-НТ в клинических условиях и дополнительно изучить влияние окислительного стресса.