Análise abrangente de metilação de DNA usando um método baseado em captação de domínio de ligação de metil-CpG em pacientes com leucemia linfocítica crônica

O uso de técnicas de sequenciação da próxima geração para analisar os perfis globais de metilação do DNA tem sido cada vez mais popular nos últimos anos. Os ensaios de metilação em todo o genoma, incluindo métodos baseados em microarray e não microarray, foram desenvolvidos com base no seguinte: conversão de bisulfito de DNA genômico, digestão de enzimas de restrição sensíveis à metilação e imunoprecipitação de DNA metilado usando anticorpos específicos de CpG de metilo .

A metilação aberrante do DNA é uma das características da leucemia e linfomas, incluindo a leucemia linfocítica crónica (CLL). Anteriormente, vários grupos, incluindo o nosso, caracterizaram os perfis de metilação do DNA de diferentes subgrupos prognósticos de CLL e controles de células B normais e saudáveis ​​usando a conversão de bisulfito de DNA genômico, seguidos de métodos baseados em micro-matriz ou seqüenciamento de todo o genoma ^{1 , 2 , 3} <Sup class = "xref"> 4. A conversão de bisulfito de DNA genômico leva à desaminação de citosinas não modificadas para uracilo, deixando as citosinas metiladas modificadas no genoma. Uma vez convertido, o estado de metilação do DNA pode ser determinado por amplificação e sequenciação de PCR usando diferentes métodos quantitativos ou qualitativos, como a seqüenciamento de bisulfito de microorganismos ou todo o genoma (WGBS). Embora os métodos baseados em conversão de bisulfito tenham muitas vantagens e sejam amplamente utilizados em diferentes tipos de câncer para analisar os níveis de metilação do DNA, existem algumas desvantagens associadas a esta técnica. O seqüenciamento do WGBS permite a resolução de pares de bases únicas com menores quantidades de DNA e é a melhor opção para analisar um grande número de amostras. No entanto, este método não diferencia as modificações entre os níveis de 5 mC e 5 hmC no genoma ^{5 , 6} . Além disso, os métodos baseados em microarray não oferecem completo cSuperação do genoma.

Em um estudo recente de nosso laboratório ⁷ , os métodos baseados em imunoprecipitação, em vez de conversão de bisulfito, foram utilizados para identificar regiões altamente diferenciadas e diferenciadas de CpG em escala global em pacientes com CLL e controles saudáveis ​​normais. Secerto de próxima geração de domínio de ligação de inmetil-CpG (MBD) (MBD-seq), o enriquecimento de DNA fragmentado de cadeia dupla depende do grau de metilação de CpG. Este método pode superar as desvantagens do método de conversão de bisulfito e também pode proporcionar cobertura genômica de metilação de CpG de maneira independente e independente de PCR. Além disso, ao contrário dos métodos de microarray baseados em conversão de bisulfito, MBD-seq pode ser usado para analisar o estado de metilação de elementos repetitivos, como longos elementos nucleares intercalados (LINEs), elementos nucleares intercalados curtos (SINEs), repetições terminais longas (LTRS) Etc. No entanto, em comparação com os métodos de conversão de bisulfito,Um protocolo MBD-seq requer uma quantidade relativamente grande de DNA de entrada. Além disso, a qualidade das leituras de seqüências e os dados dependem da especificidade, afinidade e qualidade dos anticorpos utilizados.

O presente estudo explica um protocolo MBD-seq detalhado para enriquecer DNA metilado para sequenciação da próxima geração. Ele usa um kit comercial de enriquecimento de ligação de DNA metilado (listado na Tabela de Materiais ), bem como uma tubulação computacional para visualizar e interpretar dados de seqüenciamento de metilação para identificar regiões hiper e hipometiladas específicas de CLL em comparação com controles saudáveis ​​normais. Basicamente, este método faz uso da capacidade do MBD da interação da proteína MBD2 humana com CpGs metilados para extrair DNA enriquecido com CpGs metilados, e isso é seguido pelo seqüenciamento de alto rendimento do DNA metilado.