Real-time iontophorese met tetramethylammonium om volume-fractie en tortuositeit van de extracellulaire ruimte van de hersenen te kwantificeren

De extracellulaire ruimte (ECS) is het netwerk van door elkaar verbonden kanalen buiten alle hersencellen en bevat zowel interstitiële vloeistof als extracellulaire matrix ( Figuur 1a pt Figuur 1b ). De verspreiding van veel stoffen die nodig zijn voor de hersencelfunctie, met inbegrip van voedingsstoffen, hormonen en neurotransmitters, komt door diffusie door de ECS voor. Veranderingen in de fysieke parameters van deze ruimte, met inbegrip van volume, geometrie en extracellulaire matrix, kunnen de diffusie drastisch beïnvloeden door de ECS en de lokale ionconcentraties baden van de hersenen, die een belangrijke invloed hebben op de celfunctie van de hersenencel ^{1 , 2} .

Real-time iontoforese (RTI) wordt gebruikt om twee structurele kenmerken van een hersengebied te bepalen: volume fractie en tortuositeit ^{3 , 4 ,}"Xref"> 5. Volumefractie ( a ) is het aandeel van weefselvolume dat door de ECS ( V _ECS ) wordt bezet ten opzichte van het totale weefselvolume ( V _weefsel ) in een representatief elementair volume;

Tortuosity ( λ ) is de relatieve belemmering die een stof tegenkomt wanneer het diffundeert door een hersengebied in vergelijking met een medium zonder obstructies;

Waar D ^* (cm ² s ^-1 ) de effectieve diffusiecoëfficiënt van de stof in de hersenen en D (cm ² s ^-1 ) is, is de vrije diffusiecoëfficiënt van de stof in een vrij medium, zoals verdunde agarosegel.

Vandaag de meest gebruikte sonde stof voor de RTI methode is het kleine kationtetramethylammonium (TMA). TMA heeft een molecuulgewicht van 74 g / mol, dissocieert volledig in oplossing en heeft één positieve lading. RTI studies met dit ion hebben aangetoond dat α 0,2 en λ 1,6 ^{1 , 2} . Dit betekent dat de ECS ongeveer 20% van het totale hersenvolume bedraagt ​​en dat de diffusie van een klein inert molecuul ongeveer 2,5 keer langzamer voorkomt in de ECS dan in een medium zonder obstakels ³ . Beide α pt λ variëren echter met de leeftijd van de hersenen, regio en staat en in pathologische omstandigheden ¹ . Wijzigingen van deze parameters zijn gekoppeld aan de ontwikkeling van de hersenen, veroudering, slaap, epilepsie en vele andere fundamentele processen en hersenziekten ^{1, 6} . Terwijl andere technieken a pt λ meeten, kan RTI zowel in gelokaliseerde gebieden van levend weefsel in realtime meten. Om deze reden is RTI een onontbeerlijk instrument geworden voor het onderzoeken van veranderingen in a pt λ tijdens acute en omkeerbare uitdagingen.

De theorie ter ondersteuning van RTI werd oorspronkelijk gevalideerd door Nicholson en Phillips, en de techniek is sinds die tijd zeer uitgebreid gebruikt ^{4 , 7} . Experimenten die RTI gebruiken, beginnen met het vrijkomen van een puls van TMA van een bron-micro-elektrode door iontoforese in een verdunde agarosegel. Eens uitgeworpen diffundeerden de ionen vrij van de puntbron, waarbij ze kiezen uit een potentieel oneindig aantal willekeurige wegen ( Figuur 1d ). De veranderende concentratie van het ionen wordt mettertijd gemeten met behulp van een ionen-selectieve micro-elektrode (ISM) die ruwweg is gepositioneerd100 μm weg ( figuur 1c ). De veranderingen in TMA-concentratie worden getekend en op een curve aangebracht die de berekening van zowel D als het transportnummer van de iontoforese micro-elektrode mogelijk maakt (parameters beschreven in het protocol). Met deze waarden wordt de procedure herhaald in een hersengebied van belang om D ^* te verkrijgen en zowel α als λ te berekenen. Beheersing van de iontoforese micro-elektrode, dataverzameling, grafieken en montage van de TMA-concentratiecurve en berekening van de experimentele parameters worden doorgaans uitgevoerd door de programma's Wanda en Walter, die speciaal hiervoor zijn ontworpen (de software en hun handleidingen zijn Vrij verkrijgbaar bij de auteurs op aanvraag).

Het protocol gedeelte van deze review beschrijft de basisprocedures die nodig zijn voor het ontwerpen en uitvoeren van RTI in knaagdierbreinzen. De techniek is ook gebruikt in niet-staafEnt modellen, waaronder menselijke hersenen plakjes en de vivo hersenpreparaten ^{1 , 4 , 6 , 8 , 9} . Het gedeelte Representatieve resultaten biedt zowel ideale als niet-ideale resultaten om nuances in data-interpretatie te markeren. Tenslotte behandelt de discussie sectie probleemoplossingstechnieken, beperkingen van RTI, alternatieve technieken die gebruikt worden om de ECS te bestuderen en toekomstige toepassingen van RTI.

Figuur 1: Diagrammen van diffusie via ECS. (A) Schema van ECS: Toont de grootte en locatie van het ECS in een typische hersenpreparaat. Geel markeert de ECS tussen de grijze hersencel processen. Het volume van de ECS bedraagt ​​ongeveer 20% van het totale weefsel volume ( dwz volume fractie = 0.2) onder fysiologische omstandigheden. ( B ) vergroot diagram van de ECS: benadrukt fysieke parameters die bijdragen aan tortuositeit, inclusief hersencel geometrie (grijs) en extracellulaire matrix (aangetoond als een netwerk van veelkleurige glycosaminoglycanen en proteoglycanen). ( C ) 3D-diagram van diffusie van een puntbron: Demonstreert de netto beweging van inerte moleculen van een iontoforetische bron naar een ISM. Met uitzondering van diffusiebarrières en cellulaire opname diffundeerden de moleculen in alle richtingen naar buiten, waardoor er een bolvormige concentratievoorzijde ontstaat. Het ISM kwantificeert de lokale concentratie van de inerte moleculen die vrijkomen van de iontoforetische bron. ( D ) Computer simulatie van diffusie in ECS van de hersenen: [Verre links] Instelling voor Monte Carlo simulatie; Groene bollen vertegenwoordigen hersencelprocessen en het rode kruis vertegenwoordigt een puntbron. Deze opstelling modelleren het hersenweefsel diagramma in figuur 1a . [Middenbeelden] 3 en6 moleculen die willekeurige bewegingen verrichten als ze diffunderen door de extracellulaire ruimte van de hersenen, weergegeven in 2 dimensies. [Verre rechts] Willekeurige wandelingen van veel moleculen die uit de puntbron worden vrijgegeven. De netto beweging van alle moleculen uit de puntbron is naar buiten, zoals afgebeeld in figuur 1c . De cumulatieve willekeurige wandelingen schetsen de ruimten tussen de cellen ( dwz de ECS, zie referentie ⁵ voor verdere uitleg). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.