كشف "يغاندس إستروجين" في "منتجات العناية الشخصية" استخدام "الإستروجين الخميرة الشاشة الأمثل" "المختبر التدريس الجامعي"
Summary
ويعرض هذا المقال على شاشة الإستروجين خميرة أمثل للتحديد الكمي يغاندس في “منتجات العناية الشخصية” (PCPs) التي تربط الإستروجين مستقبلات ألفا (ERα) و/أو بيتا (ERβ). الأسلوب يتضمن خيارين الركازة اللونية، حضانة مبردة ستة أيام لاستخدامها في الدورات الجامعية، والأدوات الإحصائية لتحليل البيانات.
Abstract
شاشة الإستروجين الخميرة (نعم) يستخدم للكشف عن يغاندس إستروجين في عينات بيئية، وقد طبقت على نطاق واسع في الدراسات لاختلال الغدد الصماء. وتشمل يغاندس إستروجين سواء كانت طبيعية أو من صنع الإنسان “البيئي الإستروجين” (EEs) وجدت في العديد من السلع الاستهلاكية بما في ذلك “منتجات العناية الشخصية” (بكبس)، والبلاستيك والمبيدات الحشرية، والأطعمة. EEs تعطيل هرمون إشارات في البشر والحيوانات الأخرى، ويحتمل أن خفض معدل الخصوبة وزيادة خطر الإصابة بأمراض. وعلى الرغم من أهمية EEs والغدد الصماء الإخلال بالمواد الكيميائية الأخرى (EDCs) للصحة العامة، غير هو اختلال الغدد الصماء المدرجة عادة في المناهج الجامعية. ويشارك هذا النقص جزئيا بسبب الافتقار إلى أنشطة المختبرات ذات الصلة التي توضح المبادئ حين يجري أيضا متاحة لطلاب المرحلة الجامعية. ويعرض هذا المقال محسنة نعم للتحديد الكمي يغاندس في منتجات العناية الشخصية التي تربط الإستروجين مستقبلات ألفا (ERα) و/أو بيتا (ERβ). يتضمن الأسلوب أحد ركائز اللونية اثنين (اورثو-نيتروفينيل-β-د-جالاكتوبيرانوسيدي (أونبج) أو الكلورية الأحمر-β-د-جالاكتوبيرانوسيدي (كبرج)) التي هي المشقوق من β-جالاكتوسيداسي، 6 أيام حضانة مبردة خطوة إلى تيسير استخدامها في دورات المختبرات الجامعية، وتطبيق الآلي لحسابات لاكز، ورمز R لتحليل الانحدار اللوجستي 4-المعلمة المرتبطة بها. البروتوكول قد صمم للسماح لطلاب المرحلة الجامعية لتطوير وإجراء التجارب التي كانت الشاشة المنتجات التي يختارونها يقلد الإستروجين. في هذه العملية، ويتعلمون عن اختلال الغدد الصماء وخلية ثقافة وملزم مستقبلات، نشاط إنزيم، والهندسة الوراثية، والإحصاءات والتصميم التجريبي. في نفس الوقت، هم أيضا ممارسة المهارات المختبرية الأساسية وقابلة للتطبيق على نطاق واسع، مثل: حساب تركيزات؛ مما يجعل الحلول؛ مما يدل على أسلوب تعقيم؛ متسلسل تمييع المعايير؛ تشييد والتحريف المنحنيات القياسية؛ تحديد المتغيرات والضوابط؛ جمع وتنظيم وتحليل البيانات؛ بناء وتفسير الرسوم البيانية؛ واستخدام معدات المختبرات المشتركة مثل ميكروبيبيتورس والطيفية. وبالتالي، تنفيذ هذا التحليل يشجع الطلاب على الانخراط في التعلم القائم على التحقيق مع استكشاف القضايا الناشئة في مجال العلوم البيئية والصحية.
Introduction
شاشة الإستروجين الخميرة (نعم) يستخدم على نطاق واسع لقياس يغاندس التي تحاكي استراديول (E2 أو 17β-استراديول) في مجموعة متنوعة من المصفوفات، بما في ذلك المياه والأنسجة النباتية والمنتجات الاستهلاكية والأطعمة1،2،3، 4. جماعياً، تسمى هذه يغاندس “الاستروجينات البيئية (EEs).” نعم وضعت أصلاً منخفض التكلفة و في المختبر البديل للاختبارات في فيفو مثل الاعتداء مهبلي القوارض5،6 والمرقط تغذية المقايسة7. والهدف من هذه التجارب هو لتحديد إذا كان منتج يحتوي على المواد الكيميائية التي تحفز أو عرقلة الآليات المعتمدة على الإستروجين. كشف EEs أمر بالغ الأهمية، نظراً لأنها يمكن أن تتداخل مع الإستروجين الذاتية العادية الإشارات، لا سيما أثناء التطور الجنيني. هذا التدخل يهدد الصحة بزيادة مخاطر السمنة والعقم والسرطان وفقدان المعرفي8.
وعلى الرغم من أهمية EEs ويشكل الأخرى للصحة العامة، غير هو اختلال الغدد الصماء المدرجة عادة في المناهج الجامعية. وتشارك هذا النقص جزئيا بسبب قلة الأنشطة التي توضح المبادئ حين يجري أيضا متاحة لطلاب المرحلة الجامعية. بالإضافة إلى ذلك، توجد اختلافات عديدة من البروتوكول نعم9،،من1011،،من1213، ويجعل هذا التنوع الأمثل الفحص وقتاً طويلاً ليس على وجه التحديد تدريب منسقي مختبر التقنيات ذات الصلة. وأخيراً، نعم فحوصات وعادة ما تكتمل يوم طويل ما يزيد على 1 أو 2 أيام متتالية مع حضانة O/N. هذا التوقيت غير متوافقة مع تنسيق دورات المختبرات الجامعية، الذي يجتمع عادة مرة واحدة/الأسبوع لعدة ح.
واستجابة لهذه الاحتياجات، تقارير هذه المخطوطة بروتوكولا نعم 96-جيدا أمثل الذي يتضمن أساليب استخراج ethanolic “منتجات العناية الشخصية” (بكبس)3 ، وهو خطوة تبريد 6 أيام لاستيعاب الاجتماعات الأسبوعية في المختبر. الإيثانول المطلق هو المذيبات عضوية تنوعاً التي يمكن حل مجموعة متنوعة من الذوائب القطبية ونونبولار. وعلاوة على ذلك، ومناسبة للمقررات الجامعية لأنها سهولة المتاحة نسبيا غير سام، بأسعار معقولة والامتزاج مع المياه؛ كما أنه يتبخر بسهولة دون معدات خاصة. ومع ذلك، الإيثانول ليست مثالية لاستخراج عمود المصباح بشدة عوامل اختلال الغدد الصماء أو العديد من الزيوت والشموع، الأخيرين يجري المكونات المشتركة في استخراج ضعف الكفاءة PCPs. يزيد من خطر نتائج سلبية كاذبة. مع هذا القيد في الاعتبار، ينبغي اختيار إجراءات استخراج (مثلاً، واستخراج ethanolic أو استخراج المرحلة الصلبة) أن خصائص نموذج عنوان المحققين وتلبية أهداف الدراسة (البحث مقابل التعليم الجامعي).
نعم تعتمد على المؤتلف Saccharomyces cerevisiae التي أنشئت أصلاً من قبل الدكتور تشارلز ميلر في جامعة تولين. يرجى الاطلاع على ميلر et al. (2010) لخريطة كاملة ل المهندسة بلازميد14. تحول الخميرة مع هذه البلازميدات مؤثرا ERα النووية البشرية صريحة أو ERβ (وتسمى أيضا ESR1 و ESR2، على التوالي) عندما تزرع في الوسائط التي تحتوي على اللبن (بالنسبة ERα) أو السكر أو اللبن (ل ERβ). إذا كانت المواد الكيميائية إستروجين موجودة في وسائل الإعلام، ربط المستقبلات، إنشاء مجمعات مستقبلات يجند أن تنشيط التعبير β-جالاكتوسيداسي (لاكز) على مستوى يتناسب مع تركيز المواد الكيميائية إستروجين. يتم تفكيك خلايا الخميرة ثم إطلاق سراح المتراكمة β-جالاكتوسيداسي. يحتوي المخزن المؤقت تحلل أما أونبج أو كبرج، التي هي المشقوق من β-جالاكتوسيداسي لإنتاج منتجات الأصفر أو الأحمر، على التوالي. منتجات اللونية يمكن قياسها كمياً عن طريق قياس امتصاص استخدام جهاز المطياف الضوئي في لوحة ميكروويل. درجة تغير اللون غير متناسب إلى تركيز يغاندس إستروجين الذي تعرضت له الخميرة.
اختيار الركازة (كبرج أو أونبج) يعتمد على إمكانية امتصاص خلفية الناشئة عن العينات التي يجري اختبارها. على سبيل المثال، غالباً ما إضافة المستخلصات النباتية لوناً أصفر لوسائط الإعلام بشكل مصطنع يضخم التدابير استروجينيسيتي إذا أونبج (كمياً في 405 نانومتر) كالركيزة ل β-جالاكتوسيداسي. مع المستخلصات، كبرج النباتية (كمياً في 574 nm) قد تكون ركيزة اللونية أكثر ملاءمة. كبرج هو أكثر تكلفة من أونبج ولكنه يستخدم في عشر مولاريتي. ويعرض هذا المقال استروجينيسيتيس من حزب المؤتمر الشعبي مقتطفات كمياً باستخدام أونبج وكبرج.
التحديد الكمي استروجينيسيتي عينات البيئية باستخدام ERα و ERβ اتباع نهج أكثر شمولاً من استخدام واحد فقط من هذه المستقبلات. في الحيوانات، يحمل هذه المستقبلات توزيع الأنسجة المتمايزة والأنشطة التنظيمية والانتماءات الملزمة يغاندس إستروجين ومكافحة إستروجين15. على سبيل المثال، فيتويستروغنز النباتية عادة ربط ERβ أكثر بقوة2، في حين أن المواد الكيميائية الاصطناعية يمكن إظهار الأفضلية لأي من ERα أو ERβ أو يمكن ربط كلا مستقبلات جيدا أيضا15. ولذلك، لا يتنبأ ملزمة لمستقبلات الإستروجين واحد ملزمة للآخر بالضرورة.
على الرغم من أن EEs توجد في كثير من المنتجات الاستهلاكية (مثلاً، مبيدات الآفات، المنظفات، المواد اللاصقة، ومواد التشحيم، والبلاستيك والأطعمة، والمستحضرات الصيدلانية) فضلا عن النباتات، البيانات المقدمة تم الحصول عليها باستخدام مجموعة مختارة من بكبس. بكبس مقنعة، سهولة المتاحة والميزانية ودية وذات الصلة بيئياً لطلاب المرحلة الجامعية. يمكن دعوة الطلاب لجلب ما بكبس المفضلة من المنزل الاختبار في المختبر. أنها أيضا البحث في قاعدة “الجلد العميقة” وضعها الفريق العامل البيئي16 لتوليد مقارنات تستند إلى فرضية من بكبس مع ارتفاع وانخفاض درجات السمية. وبهذه الطريقة، يمكن الطلاب في نفس الوقت على تطوير مهارات مختبرية متقدمة؛ الانخراط في التعلم الموجه ذاتيا، وعلى أساس التحقيق؛ وتستكشف القضايا الناشئة في مجال العلوم البيئية والصحية.
Protocol
Representative Results
Discussion
نعم طريقة منخفضة تكلفة المستخدمة للكشف عن يغاندس إستروجين في عينات بيئية، مثل المياه، والغذاء، والأنسجة النباتية، أو منتجات العناية الشخصية. البيانات المقدمة هنا مقارنة 2 مستقبلات الإستروجين (ERα و ERβ)، وركائز 2 (أونبج وكبرج)، والجداول الزمنية 2 (بروتوكول 2 (د) دون التبريد) والمتعلق بسبعة أيام بالنسبة للتبريد لقياس استروجينيسيتي في منتجات العناية الشخصية عن طريق التحليل نعم. د 7، بروتوكول مبردة باستخدام كبرج والخميرة معربا عن ERα و/أو ERβ أفضل يوضحها ايقس بينما أيضا كونها متوافقة مع ضيق الوقت الذي تفرضه دورات المختبرات الجامعية التي تجتمع مرة واحدة فقط/الأسبوع لعدة ح. في الواقع، مقارنة بمقايسة د 2 دون التبريد، مقايسة المبردة سبعة أيام ارتبط بانخفاض التباين عبر لوحة replicates. وبالإضافة إلى ذلك، تم توسيع الجزء الخطي من المنحنى المعياري قليلاً للبيانات التي تم جمعها باستخدام مقايسة المبردة. يحدد نطاق الكشف والرزن الجزء المنحنى القياسي الخطي وهي الجزء الوحيد من المنحنى المعياري الذي يمكن استخدامه لاقحم إيكس عينة.
في جميع ولكن واحدة من العينات التي تم اختبارها، إيكس تقاس باستخدام كبرج كانت أقل من تلك الكمية مع أونبج. مع معامل الانقراض أعلى وأدنى كم والخامسكحد أقصى، كبرج عشر مرات أكثر حساسية من أونبج17. وبالتالي، يمكن استخدامه في تركيزات أقل كبرج ويمكن استخدامها للكشف عن كميات أقل من β-جالاكتوسيداسي. لهذه الأسباب، كبرج المفضل عموما على مدى18،أونبج19. بيد لا يفسر حساسية الركازة أكبر اكتشاف القيم إيك السفلي مع كبرج. يمكن أن تكون القيم يق أعلى الكشف مع أونبج بسبب التدخل مصفوفة مع المقايسة، كما لاحظ المؤلفون الآخرون2،18. أصباغ الصفراء من مقتطفات منتجات العناية الشخصية يمكن تضخيم قيم يق الكشف مع أونبج. الآخرين قد التحايل على هذه المشكلة قبل بما في ذلك الضوابط المخضب التصميم التجريبي2، نهج أن يضاعف عدد اللوحات في تجربة. عندما تدخل المصفوفة قد تكون إشكالية، قد يكون كبرج الركازة أفضل مقايسة نعم، على الرغم من أنها أكثر تكلفة ويتطلب أوقات أطول في الحضانة من أونبج. وعلاوة على ذلك، تغير لون الناجمة عن انقسام الركازة من β-جالاكتوسيداسي أكثر مأساوية مع كبرج، مما يجعل من الأسهل للطلاب لوضع تصور لنتائج.
ميلر وآخرون (2010)، الذين هندسيا الخميرة المستخدمة في هذا البروتوكول، ولاحظ أن الخميرة معربا عن ERβ كانت 30 x أكثر حساسية ل 17β-استراديول من الخميرة معربا عن ERα، استنتاج مدعومة ب البيانات لدينا14. وبصرف النظر عن الفروق المحتملة في بلازميد البناء، ميلر وآخرون (2010) لا يمكن أن يفسر هذا الاختلاف في حساسية14. اختلاف واحد بين بنيات بلازميد اثنين أن التعبير ERα ينظمها اللبن، بينما يخضع التعبير ERβ السكر أو اللبن. الخميرة المستخدمة في التحليل نعم مثقف في وسائل الإعلام الجلوكوز ويعطي اللبن إلا عند هي تضعف في بداية المقايسة. ولذلك، قد تتراكم الخميرة معربا عن ERβ إعداد نسخة أعلى من البروتينات مستقبلات قبل بدء الفحص، مما يمنح حساسية أعلى لأستروجين يغاندس.
حساسية أقل للتعبير عن ERα الخميرة قد يفسر ارتفاع معدلات عدم الكشف عن استروجينيسيتي في عينات تقاس بالمقارنة مع ERβ ERα. لزيادة احتمالية أن عينة إيكس سوف يتم الكشف عن، المستخدمين يمكن أن تستخدم المذيبات استخراج مختلفة وأساليب أو إضافة كميات أعلى من عينة للخميرة. إذا استخدمت زيادة حجم العينة، ينبغي تعديل تركيزات المعايير E2 بنفس الحجم من معايير ونماذج يمكن استخدامها في المقايسة. واحد الحد من إضافة نموذج أكثر أن الخميرة يمكن أن يتسامح مع الإيثانول 6-10% فقط، مع التسامح أفضل في درجة حرارة الحضانة من 30 مقابل 35 درجة مئوية20. للتحكم في التأثيرات الإيثانول في الخميرة، ينبغي إضافة ثلاث آبار “الخميرة فقط” إلى تخطيط لوحة المحققين وتأكيد أن التطوير التنظيمي610 من هذه الآبار “الخميرة فقط” قابلة للمقارنة ل التطوير التنظيمي610 من آبار مراقبة المركبات فورا بعد إضافة لاكز المخزن المؤقت. وبدلاً من ذلك، يمكن إضافة العينات الذائبة في الإيثانول إلى لوحات ميكروويل الجافة والايثانول تبخرت قبالة قبل إضافة الخميرة. ديميثيلسولفوكسيدي ([دمس]) يستخدم أيضا فحوصات مذيب عينة بنعم، ولكن ينبغي أن يكون تركيز العامل النهائي [دمس] مع الخميرة محدودة إلى 1%12.
مقايسة نعم أداة فحص قوية للكشف عن استروجينيسيتي في عينات بيئية. على وجه التحديد، نعم يكشف يغاندس التي تربط مستقبلات الإستروجين النووية التي تتفاعل مع عناصر الإستروجين استجابة لتوجيه التعبير الجيني14. ومع ذلك، قد نعم أيضا أوجه القصور الهامة. نعم لم يكشف EEs التي تعمل من خلال آليات غير النووية مثل الغشاء مستقبلات الإستروجين أو الآليات التي تنطوي على عناصر إضافية مثل عوامل النسخ 1 البروتين المنشط (AP-1). وعلاوة على ذلك، نظراً لأن الخميرة لا تملك نفس القدرة الأيضية كخلايا الثدييات، لا يمكن الكشف عن نعم يغاندس التي تتطلب التنشيط الأيضي لتكون إستروجين.
وباﻹضافة إلى ذلك، مقايسة نعم لا يمكن سهولة التفريق بين يغاندس إستروجين ومكافحة إستروجين في العينات المعقدة. بدلاً من ذلك، أنه يقيس صافي استروجينيسيتي، وهو تأثير مجموع يغاندس إستروجين واستروجين لمكافحة. لقياس تركيز الخصوم ER أو تقييم النشاط المثبطة للخلائط، يمكن تعديل المقايسة التي تفرخ الخميرة مع مؤثر القياسية (17β-استراديول) ومجموعة من اختبار عينة تركيزات12. يحدد إذا كان الخصوم في العينات التي يمكن أن تقلل نشاط فعل مؤثر مراسل هذه العملية وتوفر شاشة مفيدة لتحديد وجود الخصوم ER في عينات.
البروتوكول المعروضة هنا يمكن استيعاب مجموعة متنوعة من أنواع العينات، وعلى الرغم من أن بعض العينات قد تتطلب إدخال تعديلات على خطوات الإعداد الاستخراج وعينه. على سبيل المثال، يتطابق إيكس تباينا كبيرا فيما بين بعض منتجات العناية الشخصية. تميل إلى احتواء قطرات النفط العينات أكثر من متغير أو خلاف ذلك ليست متجانسة تماما، مما يشير إلى أن من المفيد أكثر محبتين مذيب مثل إثيل الاثير. وبدلاً من ذلك، يمكن أن يستبعد الزيوت والشمع في منتجات العناية الشخصية عن طريق استخراج العينات مع الإيثانول 50% بدلاً من 100% إيثانول.استخراج إيثانول 50% أيضا التقاط المزيد يغاندس الاستروجيني للذوبان في الماء (مثلاً، بعض أصباغ). ولكن الإيثانول 50% يتبخر ببطء أكثر من 100% إيثانول وهكذا يجوز تمديد وقت استخراج. بالإضافة إلى ذلك، كانت بعض العينات (مثل الصابون) السامة للخلايا للخميرة، الناتج في الخلية انخفاض كثافة القياسات (OD610). فوكس et al. (2008) نقترح أن تكون تضعف هذه العينات واختبارها إذا كانت الخلية كثافة الخلافات تتجاوز 30% مقارنة بالسيارة مراقبة الآبار12.
إذا تم استخدام مقايسة نعم لأغراض البحوث التحليلية، يمكن اختبار منحنيات تمييع عينة برك وقائيا تحديد الكميات المناسبة من استخراج المراد إضافتها إلى الخميرة في الخطوة 4، 5. وبدلاً من ذلك، يمكن أن يكون اختبار مقتطفات في وقت واحد على وحدات تخزين متعددة (مثلاً، 5 ميليلتر واستخراج 20 ميليلتر إضافة إلى الخميرة في الخطوة 4، 5) أو تخفيف تمتد للحجم (مثلاً، ميليلتر 0.2، ميليلتر 2 و 20 ميليلتر). وحدات التخزين “مناسبة” لاستخراج هي تلك التي تحديد استروجينيسيتي عن طريق مطابقة القيم لاكز على طول الجزء الخطي من المنحنى المعياري. التحسين يمنع المشاكل الناجمة عن إضافة عينة كبيرة جداً أو صغيرة جداً للخميرة، مثل سيتوتوكسيسيتي، وسلبيات كاذبة، أو استروجينيسيتي أن تجاوز المنحنى القياسي. وكما ذكر أعلاه، ينبغي أن تعدل أحجام العينات ومعايير E2 عند استخدام كميات مختلفة من يجند أن الخميرة معرضون إلى حجم متسقة وتركيز الإيثانول أو أي مركبة أخرى عبر اللوحة.
على الرغم من إمكانية السلبيات الكاذبة، مقايسة نعم قد حددت كأداة اختبار الطبقة 3 لاختلال الغدد الصماء شوج et al. (2013)، وضعت منظمة الصحة العالمية “بروتوكول الطبقات” شامل “اختلال الغدد الصماء” (تيبيد)21. للتعليم الجامعي، المقايسة ثمين لتدريس المفاهيم المرتبطة باختلال الغدد الصماء وخلية ثقافة وملزم مستقبلات، نشاط إنزيم، والهندسة الوراثية، والإحصاءات والتصميم التجريبي. الطلاب الذين يستخدمون المقايسة أيضا ممارسة المهارات المختبرية الأساسية وقابلة للتطبيق على نطاق واسع مثل متسلسل تمييع المعايير؛ استخراج العينات؛ مما يجعل الحلول؛ تشييد والتحريف المنحنيات القياسية؛ حساب تركيزات؛ مما يجعل الحلول؛ مما يدل على أسلوب تعقيم؛ استزراع الخلايا؛ تحديد المتغيرات والضوابط؛ جمع وتنظيم وتحليل البيانات؛ بناء وتفسير الرسوم البيانية؛ واستخدام معدات المختبرات المشتركة مثل ميكروبيبيتورس والطيفية.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان تمويل هذا المشروع قبل بدء التمويل TME وعمرو من جامعة ولاية لويزيانا للتكنولوجيا وجامعة فيرمان، على التوالي. تم توفير التمويل الإضافي “منحة النهوض بكلية الحقوق” عام 2015 إلى عمرو و TME من “الكليات المرتبطة” الجنوب، ومنحة “ولاية لويزيانا” ابسكور بفوند TME من المؤسسة الوطنية للعلوم والمجلس ولاية لويزيانا من الحكام، وعلى جائزة سفر إلى TME من جامعة الجنوب. نشكر الدكتور ديفيد يوبانكس (قضية فورمان) للمساعدة في التحليل الإحصائي والسيد كريستوفر مور على “إعطاء لنا يد” أثناء التصوير.
Materials
| Equipment | |||
| Vortex Mixer (for single or multiple tubes) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-215-365 | Any mixer will suffice. |
| Bucket centrifuge | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 75-063-839 | Any bucket centrifuge will suffice if it is capable of centrifuging conical tubes at 4000 rpm. |
| Bunsen burner | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 17-012-823 | Any Bunsen burner will suffice, or an alcohol burner (Fisher Scientific 04-245-1) can be used instead. |
| Incubator | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 50125590H | Any incubator will suffice if it is capable of maintaining 30 °C. |
| Microplate reader | BioTek (www.biotek.com) | EPOCH2 | A different brand of plate reader will suffice if it can measure absorbance at wavelengths of 405, 574, and 610 nm. |
| Gen5 microplate reader and imager software | BioTek (www.biotek.com) | GEN5 | Software required depends on make and model of plate reader; GEN5 software is intended for use with BioTek plate reader. |
| Refrigerator | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 05LREEFSA | Any refrigerator will suffice if it is capable of maintaining 4 °C. |
| Pipettor or PipetAid compatible with 1-10 ml serological pipets | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-681-15E | Any pipettors will suffice if they are compatible with 1- and 10-ml serological pipets. |
| P10 micropipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F144562G | Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing 5 µl. |
| P200 micropipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F144565G | Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing up to 200 µl. |
| P300 multichannel pipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FBE1200300 | Any multichannel pipettor will suffice if it is capable of dispensing 50 to 205 µl. |
| Repeating pipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F164001G | Must be able to deliver 100-320 µl; this pipettor is optional because a multichannel pipettor can be used instead. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Sterile 15-ml conical tubes with caps | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 05-539-801 | |
| Glass scintillation vials | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 03-337-4 | |
| Polystyrene 96-well, flat-bottom microplates with lid (non-sterile) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 12565501 | |
| Polypropylene 96-well, flat-bottom microplates without lid | Cole-Parmer (www.coleparmer.com) | EW-01728-81 | |
| 100 ml glass beakers | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-539H | Any glass beakers will suffice if they are autoclavable. |
| 250 ml glass Erlenmeyer flasks | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FB500250 | Any glass Erlenmeyer flasks will suffice if they are autoclavable. |
| Sterile, adhesive, porous film | VWR (www.vwr.com) | 60941-086 | |
| Metal forceps | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 12-000-157 | Any metal forceps will suffice. |
| Reagent reservoir | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 07-200-127 | |
| Filtration units (0.2 µm) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 09-761-52 | |
| Squirt bottle (for ethanol) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-897-10 | Any laboratory squirt bottles will suffice. |
| Autoclavable storage bottles | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 06-414-1D | Any autoclavable glass storage bottles will suffice. |
| 10 ml glass serological pipets (sterile) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-678-27F | Any glass serological pipets will suffice. |
| 1 ml glass serological pipets (sterile) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-678-27C | Any glass serological pipets will suffice. |
| P10 micropipettor tips | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-3810 | Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above. |
| P200 micropipettor tips | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-8810 | Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above. |
| P300 micropipettor tips | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-9810 | Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above. |
| Syringe tips for repeating pipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F164150G | Only required if a repeating pipettor is used. |
| Sterile petri dishes | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FB0875712 | Any sterile petri dishes will suffice. |
| Parafilm | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | S37440 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast | |||
| Saccharomyces cerevisiae strains that lack the TRP1 gene product (e.g. W303a) | American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org) | MYA-151 | Recombinant yeast are also available upon request from the authors. |
| Receptor/reporter plasmid for ERα | Addgene (www.addgene.org) | pRR-ERalpha-5Z (Plasmid #23061) | |
| Receptor/reporter plasmid for ERβ | Addgene (www.addgene.org) | pRR-ERbeta-5Z (Plasmid #23062) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Difco agar | BD (www.bd.com) | 214530 | |
| Dithiothreitol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | D0632 | CAUTION: Dithiothreitol is an acute skin and eye irritant. Use appropriate personal protection equipment (gloves, fume hood, dust mask) to avoid skin and eye contact, inhalation and ingestion. |
| Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | N1127 | |
| Chlorophenol red-β-D-galactopyranoside | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 10884308001 | |
| Yeast nitrogen base | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | Y0626 | |
| Glucose | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | G8270 | |
| Galactose | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | G5388 | |
| Adenine sulfate | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | A9126 | |
| Uracil | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | U0750 | |
| Leucine | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | L8000 | |
| Histidine | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | H8000 | |
| 17 β-Estradiol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) MP Biomedicals | E8875-250 mg 0219456401 – 1 mg | CAUTION: Estradiol is a suspected carcinogen and reproductive toxicant. It is harmful if inhaled, swallowed, or absorbed through skin. Estradiol may cause harm to breast-fed children and fetuses. Estradiol is very toxic to aquatic life. Use appropriate personal protection (gloves, fume hood, dust mask) and avoid exposure during pregnancy and lactation. Estradiol should be disposed of as hazardous waste and not released to the environment. |
| 100% ethanol | Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com) | 111000200 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S0876 | |
| Magnesium chloride | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | M8266 | |
| Potassium chloride | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | P9333 | |
| Sarkosyl (N-lauroylsarcosine sodium salt) | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | L5125 | |
| Sodium carbonate | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S7795 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel is convenient spreadsheet software for managing data outputs and generating .csv files for R analysis. | |
| Java software (required for Appendix 1 application) | Oracle Corporation | To calculate LacZ values using the application in Appendix 1, first download free Java software (https://www.java.com/en/download/), then open the LacZ application in Appendix 1. LacZ results created by the application can be copied by pressing "control (ctrl) + c" on PC keyboards, or "command + c" on Mac keyboards. | |
| JMP statistical software version 13.0.0 | SAS Institute | Appendix 2 includes directions on using JMP to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve. The curve is used to interpolate test sample estradiol equivalents (EEQs), relative to the estradiol standard curve. | |
| R statistical computing and graphics software | R Foundation | Free R software can be downloaded from https://www.r-project.org/. Directions and code for using R to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve are given in Appendix 2. |
Referências
- Agradi, E., Vegeto, E., Sozzi, A., Fico, G., Regondi, S., Tome, F. Traditional healthy Mediterranean diet: estrogenic activity of plants used as food and flavoring agents. Phytother Res. 20 (8), 670-675 (2006).
- Morgan, H. E., Dillaway, D., Edwards, T. M. Estrogenicity of soybeans (Glycine max) varies by plant organ and developmental stage. Endocr Disruptors. 2 (1), (2014).
- Myers, S. L., Yang, C. Z., Bittner, G. D., Witt, K. L., Tice, R. R., Baird, D. D. Estrogenic and anti-estrogenic activity of off-the-shelf hair and skin care products. J Exp. Sci Environ Epidemiol. 25 (3), 271-277 (2015).
- Wagner, M., Oehlmann, J. Endocrine disruptors in bottled mineral water: estrogenic activity in the E-Screen. J Steroid Biochem Mol Biol. 127 (1-2), 128-135 (2011).
- Arnold, S. F., Robinson, M. K., Notides, A. C., Guillette, L. J., McLachlan, J. A. A yeast estrogen screen for examining the relative exposure of cells to natural and xenoestrogens. Environ Health Perspect. 104 (5), 544-548 (1996).
- Odum, J., et al. The rodent uterotrophic assay: critical protocol features, studies with nonyl phenols, and comparison with a yeast estrogenicity assay. Regul Toxicol Pharmacol. 25 (2), 176-188 (1997).
- Mellanen, P., et al. Wood-derived estrogens: studies in vitro with breast cancer cell lines and in vivo in trout. Toxicol Appl Pharmacol. 136 (2), 381-388 (1996).
- Balsiger, H. A., de la Torre, R., Lee, W. Y., Cox, M. B. A four-hour yeast bioassay for the direct measure of estrogenic activity in wastewater without sample extraction, concentration, or sterilization. Sci Total Environ. 408 (6), 1422-1429 (2010).
- Coldham, N. G., Dave, M., Sivapathasundaram, S., McDonnell, D. P., Connor, C., Sauer, M. J. Evaluation of a recombinant yeast cell estrogen screening assay. Environ Health Perspect. 105 (7), 734-742 (1997).
- De Boever, P., Demaré, W., Vanderperren, E., Cooreman, K., Bossier, P., Verstraete, W. Optimization of a yeast estrogen screen and its applicability to study the release of estrogenic isoflavones from a soygerm powder. Environ Health Perspect. 109 (7), 691-697 (2001).
- Fox, J. E., Burow, M. E., McLachlan, J. A., Miller, C. A. Detecting ligands and dissecting nuclear receptor-signaling pathways using recombinant strains of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nat Protoc. 3 (3), 637-645 (2008).
- Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environ Toxicol Chem. 15 (3), 241-248 (1996).
- Miller, C. A., Tan, X., Wilson, M., Bhattacharyya, S., Ludwig, S. Single plasmids expressing human steroid hormone receptors and a reporter gene for use in yeast signaling assays. Plasmid. 63 (2), 73-78 (2010).
- Delfosse, V., Grimaldi, M., Cavaillès, V., Balaguer, P., Bourguet, W. Structural and functional profiling of environmental ligands for estrogen receptors. Environ Health Perspect. 122 (12), 1306-1313 (2014).
- Eustice, D. C., Feldman, P. A., Colberg-Poley, A. M., Buckery, R. M., Neubauer, R. H. A sensitive method for the detection of beta-galactosidase in transfected mammalian cells. Biotechniques. 11 (6), (1991).
- Buller, C., Zang, X. P., Howard, E. W., Pento, J. T. Measurement of beta-galactosidase tissue levels in a tumor cell xenograft model. Methods Find Exp Clin Pharmacol. 25 (9), 713-716 (2003).
- Pelisek, J., Armeanu, S., Nikol, S. Evaluation of beta-galactosidase activity in tissue in the presence of blood. J Vasc Res. 37 (6), 585-593 (2000).
- Gray, W. D. Studies on the alcohol tolerance of yeasts. J Bacteriol. 42 (5), 561-574 (1941).
- Schug, T. T., et al. Designing endocrine disruption out of the next generation of chemicals. Green Chem. 15 (1), 181-198 (2013).
