Het bestuderen van celcyclusreguleerde genuitdrukking door twee complementaire celsynchronisatieprotocollen

Overgang door alle fasen van de celcyclus wordt gekoppeld aan een strak gereguleerd genuitdrukkingsprogramma. Deze gecoördineerde "aan en uit" van gentranscriptie gedurende de celcyclus wordt geacht onder controle te zijn van complexe transcriptie regulerende systemen, die niet alleen de timing reguleren, maar ook de niveaus van genuitdrukking. Deregulatie van belangrijke celcycluscomponenten is bekend om bij te dragen tot de ontwikkeling van verschillende aandoeningen en is een goed gevestigd kenmerk van tumorigenese ^{1 , 2} . Genoom-brede transcriptomische analyses uitgevoerd in gist- en zoogdiercellen hebben aangetoond dat een groot aantal genen periodieke genuitdrukkingspatronen in de celcyclus vertoont, wat aangeeft dat transcriptieve fluctuaties tijdens de celcyclus een afspiegeling vormen van de tijdelijke vereiste van een gegeven genproduct In een precieze fase ^{3 , 4 ,} </suP> ⁵ .

Een belangrijke taak in de studie van celcyclusreguleerde genuitdrukking is de synchronisatie van cellen in specifieke celcyclusfasen. Cellsynchronisatie helpt de associatie van een genuitdrukkingspatroon te interpreteren met een bepaalde cyclusfaseovergang, en het heeft geleid tot een beter inzicht in de regulering en functie van talrijke genen. Cellsynchronisatie is ook belangrijk voor het bestuderen van het werkingsmechanisme van anticancermiddelen, omdat chemotherapeutische middelen bekend zijn om zowel de genuitdrukking als de celcycluskinetiek ^{6 , 7 te} beïnvloeden. Niettemin is het vaak moeilijk om te bepalen of genuitdrukkingsverschillen die voortvloeien uit de behandeling met deze middelen een directe reactie op de behandeling zijn of gewoon het gevolg zijn van veranderingen in celcyclusprofielen. Om te onderscheiden tussen deze mogelijkheden, moet genuitdrukking worden geanalyseerd in cellen die s zijn geweestGechronchroniseerd voorafgaand aan toevoeging van het chemotherapeutische geneesmiddel.

Met uitzondering van enkele primaire cellen, zoals vers geïsoleerde lymfoïde cellen, die een homogene celpopulatie vormen die gesynchroniseerd zijn in G08, groeien in vitro gevestigde cellijnen asynchroon in cultuur. Onder regelmatige groeivoorwaarden worden deze asynchrone cyclische cellen gevonden in alle fasen van de celcyclus, maar bij voorkeur in G1 ⁹ . Daarom biedt deze context geen optimaal scenario voor functionele of genexpressieanalyses in een specifieke celcyclusfase (bijvoorbeeld G1, S, enz.). Niet-getransformeerde immortalized cellijnen ( bijv. Fibroblasten) kunnen worden gesynchroniseerd met zogenaamde fysiologische methoden ¹⁰ . Deze methoden zijn gebaseerd op de bewaarde primaire celkenmerken van niet-getransformeerde cellen, zoals celcontact remming en afhankelijkheid van de groeifactor om verder te gaan fietsen. VerwijderingVan serum in combinatie met contactinhibitie maakt niet-getransformeerde cellen gearresteerd bij G0 / G1. Echter, de gesynchroniseerde celcyclusinvoer en de progressie vereisen vaak subcultuur, die ook kunstmatige loslating van de cellen inhoudt en opnieuw opbouwt ¹⁰ . Belangrijker nog, deze methode is niet geschikt voor synchronisatie van getransformeerde cellijnen, de overgrote meerderheid van gevestigde cellijnen die momenteel in gebruik zijn, gekenmerkt door het ontbreken van celcontact gemedieerde groei remming of respons op groeifactor onttrekking. Zo is het duidelijk dat alternatieve methoden nodig zijn voor efficiënte celsynchronisatie in specifieke fasen van de celcyclus. In het algemeen zijn de meest gebruikte synchronisatiemethoden gebaseerd op transiënte chemische of farmacologische remming van een bepaald punt van de celcyclus, typisch DNA synthese of mitotische spindelvorming. Inhibitie van DNA-synthese synchroniseert cellen door ze in de late G1 of vroege S-fase te arresteren. Dit kan achi zijnDoor middel van toevoeging van verbindingen zoals mimosine, een inhibitor van nucleotidebiosynthese ^{11 , 12} , aphidicoline, een inhibitor van DNA-polymerasen ^{13 , 14} , hydroxyureum, een inhibitor van ribonucleotide reductase ^{15 , 16} of door overmaat hoeveelheden thymidine ^{17 , 18} . Aan de andere kant kunnen remmers van microtubule-polymerisatie, zoals colchicine of nocodazol, de mitotische spindelvorming blokkeren, wat leidt tot cellynchronisatie in de vroege M-fase ^{19 , 20 , 21} .

In dit werk beschrijven wij een methode waarbij twee complementaire synchronisatieprotocollen zijn gebaseerd op transiënte chemische remming voor het bestuderen van de expressie van celcyclusreguleerde genen bij het mRNAniveau. Deze methode is essentieel voor het bepalen van de rol van celcyclusgenen in specifieke celcyclusprocessen. Bovendien biedt het een algemeen kader voor het bestuderen van de impact van anticancerbehandelingen om nauwkeurig medicijnresponsieve genen te detecteren en misinterpretaties af te leiden die zijn afgeleid van verstoringen in de celcyclusprogressie die door deze medicijnen wordt gegenereerd.