측면에서 인구의 분리 나 Myc 유도 T 세포 급성 림프 모구 백혈병 제브라 피쉬
Summary
여기서는 myc의 유도 T 세포 급성 림프 모구 백혈병의 모델 제브라 피쉬 (T-ALL)에서 측면 인구 세포를 분리하는 방법을 설명한다. 이 쪽 인구 분석은 매우 민감하고 제브라 피쉬 T-ALL에 대해 설명하지만, 다른 악성 및 비 악성 제브라 피쉬의 세포 유형에 적용 할 수있다.
Abstract
건강 악성 조직 중 어느 하나에서 이종 세포 집단은 상기 DNA 결합 염료 훽스트 33342. 셀이 "측면 인구"유출하는 차동 기능을 특징으로 세포 집단을 포함 할 수있다 훽스트 33342 후 유세포 방법을 이용하여 식별 될 수있다 염료는 자외선 (UV) 레이저에 의해 여기된다. 많은 세포 유형의 측면 인구는 stem- 또는 전구와 같은 세포가 포함되어 있습니다. 그러나 모든 종류의 세포는 식별 측면 인구가 있습니다. 다니오의 레 리오 (rerio), 제브라 피쉬는 T 세포 급성 림프 구성 백혈병 (T-ALL)의 생체 내 모델의 강력한을 가지고 있지만 이러한 제브라 피쉬 T-ALLS가 있는지 여부 측면 인구는 알 수 없습니다. 여기에 설명 된 방법은 제브라 피쉬 T-ALL의 측면 인구 세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 우선, 제브라 피쉬의 T-ALL은 하나의 세포 단계의 배아로 TOL2 플라스미드의 미세 주입을 통해 생성됩니다. 종양 무대로 성장했으면하는 그들은 항문의 절반 이상으로 확장T-ALL 세포를 수확 할 수 있습니다. 그 다음, 세포를 Hoechst 33342로 염색하고 측면 세포에 대한 유동 세포 계측법으로 검사한다. 이 방법은 zebrafish T-ALL 연구에 광범위한 응용이 있습니다. 제브라 피쉬에는 이러한 측면 세포가 암 줄기 세포와 유사한지를 확인하는 알려진 세포 표면 마커는 없지만 생체 내 기능 이식 분석이 가능합니다. 또한, 단일 세포 transcriptomics이 측면 인구 세포의 유전 특징을 식별하는 데 적용 할 수 있습니다.
Introduction
측면 집단 분석은 세포막상의 ATP 결합 카세트 (ABC) 전달체 단백질의 높은 수치로 인해 DNA 결합 염료 Hoechst 33342를 유출시키는 조직 내 특정 세포의 증진 된 능력을 이용합니다. Hoechst 33342 염료를 유출하는 세포는 염료가 UV 레이저로 여기 된 후 이중 파장 유동 세포 계측법 분석을 사용하여 확인할 수 있습니다. 이 분석법은 처음에 마우스 조혈 줄기 세포 (HSC) 1 을 확인하는 데 사용되었지만 이후 많은 조직과 암에서 줄기 / 전구 세포 집단을 확인하는 데 사용되었습니다 (참고 문헌 2 참조). 그러나 모든 세포 집단이 부수적 인 집단을 가지고있는 것은 아니며, 모든 부 모집단이 줄기 / 전구 세포를 위해 풍부하지는 않습니다.
제브라 피쉬는 인간의 암을 연구하기위한 강력한 척추 동물 모델 시스템입니다. 3 , 4 , 전통적인 murine암의 델. Zebrafish의 배아는 외부 형질 전환 및 암 개시 및 진행을 포함한 병리학 적 과정의 생체 내 관찰을 용이하게 수정 된 광학적 분명합니다. 현재까지, 측면 인구 분석은 잠재적 인 줄기 또는 전구 세포만을 조혈 모세포를 식별하는 제브라 피쉬의 신장 골수에 적용, 그리고 어떤 제브라 피쉬 암 모델 5, 6되었습니다 감지합니다.
T 세포 급성 림프 모구 백혈병의 모델 제브라 피쉬 (T-ALL)는 형태 학적으로 인간 T-ALL 7, 8, 11 유전자와 유사하다. T-ALL은, 인간의, 소아 10 ~ 15 %와 모든 경우 9 성인의 25 %를 차지하는 공격적인 악성 종양이다. T-ALL의 치료가 개선 된 반면, 재발은 여전히 일반적이며 예후와 연관되어 있습니다. T-ALL 종양은 heterogene입니다조직 구성 단위 및 백혈병 개시 세포 (저소득) 등 다양한 종양 세포의 소집단가 포함되어 있습니다. 저소득 그들의 단일 세포에서 종양 전체를 자라게 할 수있는 능력, 및 종양 세포 집단 내 저소득의 주파수에 의해 정의는 제한 희석 이식 분석 (LDA)을 통해 수신자로 변화하는 셀 용량을 이식하여 계산 될 수있다. LDA 실험은 저소득 8, 10, 11의 주파수를 계산하기 위해 제브라 수행 하였지만, 이러한 판정은 제 지나고되고 저소득의 잠재적 분리를 허용하지 않는다. 따라서, 방법은 전향 적으로 암 줄기 세포의 활동에 대한 풍부한 인구가 부족한 분리합니다. 식별 및 지브라 피쉬 T-ALLS 측으로부터 세포 집단을 분리하는 것은 이러한 결함을 해결하기위한 첫 단계이다.
여기에 제시된 프로토콜은 효율적으로 zebr에서 T-ALL 종양을 생성하는 방법에 대해 설명합니다(tol2-mediated transgenesis)를 이용하여 T-ALL 종양 세포를 수확하고 Hoechst 33342로 염색하여 세포의 부작용을 확인한다. 제브라 피쉬 T-ALL 에 대한 미래 의 생체 내 실험 은 측면 세포가 LIC를 강화 시키거나 다른 줄기 – 또는 전구체 – 유사 성질을 갖는지 여부를 포함 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
측면 집단 분석은 매우 민감합니다. 따라서 프로토콜을 조금만 변경하면 측면 세포를 검출하는 데 어려움이 발생할 수 있습니다. 첫째, 얼룩 단계 동안 온도는 각 동물 / 세포 시스템에 특정입니다. 포유류 시스템의 경우, 측면 집단 분석은 일반적으로 37 ° C에서 수행됩니다 2 . 제브라 피쉬 T-ALL 세포가 37 ℃에서 배양되었을 때, 많은 세포가 죽어서이 배양 온도를 용납 할 수 없게…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 시카고 대학 여성위원회 (University Board of Chicago Women Board), 웬디 윌 사건 기금 (Wendy Will Case Fund), 시카고 대학 종합 암 센터 지원 교부금 (P30 CA014599)에 의해 지원되었습니다. 이 실험을 설정하는 데 도움을 주신 시카고 대학교의 Flow Cytometry Core와 de Zhong 연구실의 다른 회원, 특히 Leslie Pedraza 및 Sean McConnell에게 감사드립니다.
Materials
| Syngeneic zebrafish (CG2) | See Mizgireuv et al., 2006 | ||
| rag2:c-myc plasmid | Langenau Laboratory | ||
| rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab | rag2 promoter from Langenau Laboratory | ||
| pCS2-transposase plasmid | Chien Laboratory | ||
| NotI -HF restriction enzyme | New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 units in 25 µL |
| mMessage Machine SP6 Transcription Kit | Ambion | Thermo Fisher Scientific – AM1340 | 25 reactions |
| QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
| SteREO Discovery V8 Microscope | Carl Zeiss Microscopy | 495015-0008-000 | |
| Digital microinjector | Tritech Research | MINJ-D | |
| Brass straight-arm needle holder | Tritech Research | MINJ-4 | |
| Magnetic base and stand | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN153 | |
| Glass capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm without filament |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf North America Inc. | 930001007 | |
| Phenol Red solution | Sigma Life Science | P0290 | 0.5% concentration 100 mL |
| Plastic Transfer pipettes | Fisherbrand | 137119D | graduated 7.5 mL bulb |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific – NC0342409 | 100 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific – SH3007103 | 500 mL |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco by Life Technologies | 1001-023 | pH 7.4 (1x) – 500 mL |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 – 300 unit vials |
| 40 um mesh filter | Falcon Corning Brand | 352340 | Case of 50 |
| Trypan blue | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL – Solution (0.4%) |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
| Verapamil | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |
Referências
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