माइक प्रेरित टी-सेल में साइड जनसंख्या का अलगाव Zebrafish में तीव्र लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया
Summary
यहां, हम एक तकनीक का वर्णन करते हैं जो माईसी प्रेरित टी-सेल तीव्र लिम्फोब्लास्टिक लेकिमिया (टी-ऑल) के एक zebrafish मॉडल से पक्ष जनसंख्या की कोशिकाओं को अलग करने के लिए। इस ओर की आबादी परख अत्यधिक संवेदनशील है और इसे zebrafish T-ALL के लिए वर्णित किया गया है, लेकिन यह अन्य घातक और गैर-घातक zebrafish सेल प्रकारों के लिए लागू हो सकता है।
Abstract
विषम सेल आबादी, या तो स्वस्थ या घातक ऊतकों से, एक अंतर डीएनए बाध्यकारी डाई हेक्स्ट 33342. कोशिकाओं की इस "पक्ष जनसंख्या" तपका करने की क्षमता की विशेषता कोशिकाओं की आबादी हो सकती 33342 Hoechst के बाद प्रवाह cytometric विधियों का उपयोग कर पहचाना जा सकता है डाई एक पराबैंगनी (यूवी) लेजर से उत्साहित है। कई प्रकार की कोशिकाओं के किनारे आबादी stem- या पूर्वज की तरह सेल शामिल हैं। हालांकि, सभी प्रकार की कोशिकाओं एक पहचान ओर आबादी है। Danio rerio, zebrafish, टी सेल घातक लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया (टी सभी) की विवो मॉडल में एक मजबूत है, लेकिन इन zebrafish टी Alls है कि क्या एक ओर जनसंख्या अज्ञात है। विधि यहाँ वर्णित कैसे zebrafish टी सभी में पक्ष आबादी कोशिकाओं को अलग करने की रूपरेखा। शुरू करने के लिए, zebrafish में टी सभी एक कोशिका चरण भ्रूण में tol2 प्लास्मिड के microinjection के माध्यम से उत्पन्न होता है। एक बार जब ट्यूमर एक चरण के लिए बड़े हो गए हैं, जिस पर वे अणि के आधे से अधिक में विस्तारमल के शरीर, टी-सभी कोशिकाओं काटा जा सकता है कोशिकाओं को फिर Hoechst 33342 के साथ दाग दिया जाता है और पक्ष जनसंख्या कोशिकाओं के लिए प्रवाह साइटमैट्री द्वारा जांच की जाती है। इस विधि में zebrafish T-all अनुसंधान में व्यापक अनुप्रयोग हैं जबकि ज़ीब्राफीज में कोई ज्ञात कोशिका सतह के निशान नहीं हैं, जो पुष्टि करते हैं कि इन पक्ष की आबादी की कोशिकाएं कैंसर के स्टेम कोशिका हैं, जैसे कि विवो कार्यात्मक प्रत्यारोपण assays संभव हैं। इसके अलावा, इन पक्षीय जनसंख्या कोशिकाओं के आनुवंशिक गुणों की पहचान करने के लिए सिंगल-सेल ट्रांसस्क्रिप्टमिक्स लागू किया जा सकता है।
Introduction
पक्ष आबादी परख एक ऊतक के भीतर कुछ कोशिकाओं की बढ़ी क्षमता एटीपी बाध्यकारी कैसेट (एबीसी) कोशिका झिल्ली पर ट्रांसपोर्टर प्रोटीन का उच्च स्तर के कारण DNA बाइंडिंग डाई Hoechst 33342 तपका के लिए से फ़ायदा उठाने की। कोशिकाओं है कि तपका 33342 Hoechst डाई दोहरी तरंगदैर्ध्य प्रवाह cytometric विश्लेषण उपयोग करने के बाद डाई एक यूवी लेजर से उत्साहित है पहचाना जा सकता है। यह परख पहले murine hematopoietic स्टेम सेल (HSCs) 1 पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, लेकिन यह बाद से कई ऊतकों और कैंसर में स्टेम / पूर्वज सेल आबादी की पहचान के लिए इस्तेमाल किया गया है (संदर्भ 2 में समीक्षा)। बहरहाल, कोशिकाओं के सभी आबादियों एक तरफ आबादी है, और सभी पक्ष आबादी नहीं स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के लिए समृद्ध कर रहे हैं।
Zebrafish पारंपरिक murine मो से अधिक लाभ की एक संख्या के साथ, मानव कैंसर 3, 4 के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली हड्डीवाला आनुवंशिक मॉडल प्रणाली हैकैंसर के dels। Zebrafish भ्रूण बाह्य निषेचित और ऑप्टिकली स्पष्ट हैं, transgenesis और कैंसर दीक्षा और प्रगति सहित वैकृत प्रक्रियाओं के इन विवो अवलोकन की सुविधा कर रहे हैं। तिथि करने के लिए, पक्ष आबादी परख संभावित स्टेम या पूर्वज कोशिकाओं केवल zebrafish में गुर्दे मज्जा लिए लागू किया गया एचएससी की पहचान के लिए, और किसी भी zebrafish कैंसर मॉडल 5, 6 के लिए नहीं पता लगाने के लिए।
टी सेल घातक लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया के zebrafish मॉडल (टी सभी) आकृति विज्ञान और आनुवंशिक रूप से करने के लिए मानव टी सभी 7, 8, 11 के समान है। टी सभी एक आक्रामक द्रोह कि मानव में, बाल चिकित्सा का 10-15% और वयस्क सभी मामलों 9 की 25% का योगदान है। टी सभी के उपचार में सुधार हुआ है, वहीं पतन अभी भी आम है और एक गरीब रोग का निदान के साथ जुड़ा हुआ है। टी सभी ट्यूमर heterogene हैंous और ल्यूकेमिया की शुरुआत कोशिकाओं (LICs) सहित कई अलग अलग ट्यूमर कोशिका उप-जनसंख्या, होते हैं। LICs एक एकल कोशिका से पूरे ट्यूमर regrow करने की क्षमता है, और एक ट्यूमर कोशिका जनसंख्या के भीतर LICs की आवृत्ति द्वारा परिभाषित कर रहे एक सीमित कमजोर पड़ने प्रत्यारोपण परख (LDA) के माध्यम से प्राप्तकर्ताओं में अलग सेल खुराक रोपाई से गणना की जा सकती। झील प्राधिकरण प्रयोगों zebrafish में प्रदर्शन किया गया है जबकि LICs 8, 10, 11 की आवृत्ति की गणना करने के इस संकल्प मसा में किया जाता है और LICs के संभावित अलगाव के लिए अनुमति नहीं है। इसलिए, एक विधि भावी अलग करने के लिए आबादी कैंसर स्टेम सेल गतिविधि के लिए समृद्ध कमी है। पहचान करना और zebrafish टी Alls से पक्ष आबादी कोशिकाओं को अलग इस कमी को संबोधित करने की दिशा में पहला कदम है।
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल बताता है कि कैसे कुशलतापूर्वक zebr में टी सभी ट्यूमर उत्पन्न करने के लिएafish उपयोग tol2 की मध्यस्थता transgenesis, फसल टी सभी ट्यूमर कोशिकाओं, और उन्हें 33342 Hoechst के साथ दाग कोशिकाओं की ओर आबादी की पहचान। Zebrafish टी सभी के साथ विवो प्रयोगों में शामिल हो सकते हैं भविष्य की ओर आबादी कोशिकाओं LICs के लिए समृद्ध या अन्य stem- या पूर्वज की तरह गुण होते हैं है या नहीं।
Protocol
Representative Results
Discussion
साइड जनसंख्या परख अत्यधिक संवेदनशील है; इसलिए प्रोटोकॉल में छोटे बदलाव पक्ष आबादी की कोशिकाओं का पता लगाने में कठिनाई का कारण बन सकते हैं। सबसे पहले, धुंधला हो जाना चरण के दौरान तापमान प्रत्येक पशु / स?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम शिकागो महिला बोर्ड, वेंडी विल कैस फंड, और शिकागो विश्वविद्यालय के व्यापक कैंसर केंद्र सहायता अनुदान (पी 30 सीए 0145 99) द्वारा समर्थित था। हम इस प्रयोग की स्थापना के लिए शिकागो विश्वविद्यालय में फ्लो साइटोमेट्री कोर का धन्यवाद करना चाहते हैं, और साथ ही जोंग लैब के अन्य सदस्यों, विशेष रूप से लेस्ली पेड्राज़ा और सीन मैककोनेल का धन्यवाद करना चाहते हैं।
Materials
| Syngeneic zebrafish (CG2) | See Mizgireuv et al., 2006 | ||
| rag2:c-myc plasmid | Langenau Laboratory | ||
| rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab | rag2 promoter from Langenau Laboratory | ||
| pCS2-transposase plasmid | Chien Laboratory | ||
| NotI -HF restriction enzyme | New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 units in 25 µL |
| mMessage Machine SP6 Transcription Kit | Ambion | Thermo Fisher Scientific – AM1340 | 25 reactions |
| QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
| SteREO Discovery V8 Microscope | Carl Zeiss Microscopy | 495015-0008-000 | |
| Digital microinjector | Tritech Research | MINJ-D | |
| Brass straight-arm needle holder | Tritech Research | MINJ-4 | |
| Magnetic base and stand | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN153 | |
| Glass capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm without filament |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf North America Inc. | 930001007 | |
| Phenol Red solution | Sigma Life Science | P0290 | 0.5% concentration 100 mL |
| Plastic Transfer pipettes | Fisherbrand | 137119D | graduated 7.5 mL bulb |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific – NC0342409 | 100 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific – SH3007103 | 500 mL |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco by Life Technologies | 1001-023 | pH 7.4 (1x) – 500 mL |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 – 300 unit vials |
| 40 um mesh filter | Falcon Corning Brand | 352340 | Case of 50 |
| Trypan blue | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL – Solution (0.4%) |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
| Verapamil | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |
Referências
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