Die Isolierung der Seiten Bevölkerung in Myc-induzierte T-Zell akute lymphatische Leukämie in Zebrabärbling
Summary
Hier beschreiben wir eine Technik, die die Seitenpopulation Zellen aus einem Zebrabärbling Modell der myc-induzierten T-Zell-akuter lymphatischer Leukämie (T-ALL) zu isolieren. Diese Seite Bevölkerung Test ist hochempfindlich und wird für Zebrabärbling T-ALL beschrieben, aber es kann auch auf andere maligne und nicht-maligne Zebrabärbling Zelltypen anwendbar.
Abstract
Heterogene Zellpopulationen, aus entweder gesund oder malignes Geweben, enthalten können eine Population von Zellen durch eine Differential Fähigkeit gekennzeichnet können den DNA-bindenden Farbstoff Hoechst 33342 Diese „Neben population“ von Zellen Efflux durchflusszytometrischen Verfahren nach dem Hoechst 33342 identifiziert werden, unter Verwendung von Farbstoff wird durch ein Ultraviolett (UV) Laser angeregt. Die Seiten Bevölkerung vieler Zelltypen enthält Stamm- oder Vorläuferähnlichen Zellen. Allerdings sind nicht alle Zelltypen haben eine identifizierbare Seiten Bevölkerung. Danio rerio, Zebrafisch, hat eine robusten in vivo Modell der T-Zell – akuter lymphatischer Leukämie (T-ALL), aber ob dieser Zebrabärbling T-All hat eine Seitenpopulation ist unbekannt. Das hier beschriebene Verfahren beschreibt, wie die Seiten Bevölkerung Zellen in Zebrabärbling T-ALL zu isolieren. Um zu beginnen, die T-ALL in Zebrabärbling wird über die Mikroinjektion von TOL2 Plasmide in eine Zellstadium Embryonen erzeugt. Sobald die Tumoren, bei denen auf eine Stufe gewachsen erweitern sie in mehr als der Hälfte des animal der Körper, die T-ALL-Zellen können geerntet werden. Die Zellen werden dann mit Hoechst 33342 und untersucht durch Durchflußzytometrie für Seitenpopulation Zellen gefärbt. Dieses Verfahren hat breite Anwendungen in Zebrabärbling T-ALL-Forschung. Zwar gibt es keine bekannten Zelloberflächenmarker in Zebrabärbling , dass diese Nebenpopulation Zellen Krebsstammzellen-like, in vivo Transplantation funktionelle Assays sind möglich sind , bestätigen , ob. Darüber hinaus könnte Single-Cell-Transkriptomik die genetischen Merkmale dieser Seite Bevölkerung Zellen zu identifizieren, angewandt werden.
Introduction
Die Seiten Population Assay nutzt die verbesserte Fähigkeit bestimmter Zellen in einem Gewebe, das den DNA-bindenden Farbstoff Hoechst 33342 aufgrund des hohen Niveaus von der ATP-Bindungskassette (ABC) -Transporter-Proteine auf der Zellmembran Efflux. Die Zellen, die den Farbstoff Hoechst 33342 Efflux können duale Wellenlänge Durchflusszytometrieanalyse identifiziert werden, nachdem der Farbstoff durch einen UV-Laser angeregt wird. Dieser Test wurde zuerst 1 murinen hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) zu identifizieren , verwendet, aber es seither verwendet Stamm- / Vorläuferzellpopulationen in vielen Geweben und Krebserkrankungen zu identifizieren (in Bezug auf 2 überprüft). Allerdings sind nicht alle Populationen von Zellen haben eine Seitenpopulation, und nicht alle sind für die Populationen Seiten Stamm- / Vorläuferzellen angereichert ist.
Der Zebrabärbling ist ein leistungsfähiges wirbel genetisches Modellsystem zur Untersuchung von menschlichem Krebs 3, 4, mit einer Reihe von Vorteilen gegenüber herkömmlichem Maus – models von Krebs. Zebrabärblingembryonen werden extern befruchtet und sind optisch klar, erleichtert und die Transgenese in vivo Beobachtung von pathologischen Prozessen, einschließlich Krebs Initiierung und Progression. Bis heute zu den Seiten Population Assay potentiellen Stamm- oder Vorläuferzellen erkennen wurde lediglich an der Nierenmark in Zebrabärbling angewendet worden HSCs zu identifizieren, und nicht auf irgendwelche Zebrabärbling Krebsmodellen 5, 6.
Der Zebrafisch Modell der T-Zell – akute lymphatische Leukämie (T-ALL) ist morphologisch und genetisch ähnlich der menschlichen T-ALL 7, 8, 11. T-ALL ist eine aggressive Bösartigkeit , die beim Menschen macht 10-15% der Kinder und 25% der erwachsenen alle Fälle 9. Während die Behandlung von T-ALL verbessert hat, ist Rückfall immer noch üblich und ist mit einer schlechten Prognose verbunden. T-ALL-Tumoren sind heterogeneous und enthält viele verschiedene Subpopulationen von Tumorzellen, einschließlich Leukämie initiierende Zellen (LICs). LICs ist durch ihre Fähigkeit definiert, um den gesamten Tumor aus einer einzelnen Zelle, und die Frequenz des LICs in einer Tumorzellpopulation nachwachsen kann durch Verpflanzen unterschiedliche Zell Dosen in Empfänger über eine Grenzverdünnung Transplantation Assay (LDA) berechnet werden. Während LDA Experimente haben in Zebrabärbling durchgeführt worden , um die Häufigkeit des LICs 8, 10, 11 zu berechnen, wird diese Feststellung im Nachhinein gemacht und für die Isolierung von prospektiven LICs nicht gestattet. Deshalb, um ein Verfahren prospektiv eine Population von Krebsstammzellaktivität angereichert zu isolieren fehlt. Identifizierung und Isolierung von Nebenpopulation Zellen von Zebrabärbling T-All ist der erste Schritt auf dem Weg, diesen Mangels Adressierung.
Das Protokoll hier vorgestellten, wie effizient T-ALL-Tumoren in Zebr erzeugenafish Verwendung TOL2-vermittelte Transgenese, ernten die T-ALL-Zellen Tumoren und verfärben sie mit Hoechst 33342 die Seiten Population von Zellen zu identifizieren. Zukunft de – vivo – Experimente mit Zebrabärbling T-ALL könnten , ob die Seitenpopulation Zellen für LICs angereichert oder andere Stamm- oder Vorläuferähnlichen Eigenschaften.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Seiten Population Assay ist hochempfindlich; Daher kleine Änderungen an dem Protokoll kann in Nachweisseitenpopulation Zellen in einer Schwierigkeit führen. Zuerst wird die Temperatur während des Färbeschritt spezifisch für jedes Tier / Zellensystem. Für Säugetiersystemen wird die Seitenpopulation Assay typischerweise bei 37 ° C 2 durchgeführt. Wenn die Zebrabärbling T-ALL-Zellen bei 37 ° C inkubiert wurden, starben viele der Zellen, die diese Inkubationstemperatur inakzeptabel gem…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der University of Chicago Women's Board, der Wendy Will Case Fund und der University of Chicago Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30 CA014599) unterstützt. Wir danken dem Flow Cytometry Core an der University of Chicago für ihre Hilfe bei der Erstellung dieses Experiments und auch für andere Mitglieder des de Jong Labors, insbesondere Leslie Pedraza und Sean McConnell.
Materials
| Syngeneic zebrafish (CG2) | See Mizgireuv et al., 2006 | ||
| rag2:c-myc plasmid | Langenau Laboratory | ||
| rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab | rag2 promoter from Langenau Laboratory | ||
| pCS2-transposase plasmid | Chien Laboratory | ||
| NotI -HF restriction enzyme | New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 units in 25 µL |
| mMessage Machine SP6 Transcription Kit | Ambion | Thermo Fisher Scientific – AM1340 | 25 reactions |
| QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
| SteREO Discovery V8 Microscope | Carl Zeiss Microscopy | 495015-0008-000 | |
| Digital microinjector | Tritech Research | MINJ-D | |
| Brass straight-arm needle holder | Tritech Research | MINJ-4 | |
| Magnetic base and stand | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN153 | |
| Glass capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm without filament |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf North America Inc. | 930001007 | |
| Phenol Red solution | Sigma Life Science | P0290 | 0.5% concentration 100 mL |
| Plastic Transfer pipettes | Fisherbrand | 137119D | graduated 7.5 mL bulb |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific – NC0342409 | 100 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific – SH3007103 | 500 mL |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco by Life Technologies | 1001-023 | pH 7.4 (1x) – 500 mL |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 – 300 unit vials |
| 40 um mesh filter | Falcon Corning Brand | 352340 | Case of 50 |
| Trypan blue | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL – Solution (0.4%) |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
| Verapamil | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |
Referências
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