在侧群的分离的Myc诱导的T细胞急性淋巴细胞白血病斑马鱼
Summary
在这里，我们描述了一种从myc诱导的T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）的斑马鱼模型中分离侧群体细胞的技术。这种侧群体测定是高度敏感的，描述为斑马鱼T-ALL，但它可能适用于其他恶性和非恶性斑马鱼细胞类型。
Abstract
异质细胞群，从任一健康或恶性组织，可以含有其特征在于，外排至DNA结合染料赫斯特33342细胞的这种“侧群”的差分能力的细胞群可使用的Hoechst 33342后流式细胞方法来鉴定染料由紫外线（UV）激光激发。许多细胞类型的侧群包含茎或祖细胞样细胞。然而，并非所有类型的细胞具有可识别的侧群。 斑马鱼 ，斑马鱼， 在 T细胞急性淋巴细胞性白血病（T-ALL）的体内模型中一个健壮的，但这些斑马鱼T-承滴盘是否具有侧群是未知的。这里所描述的方法概述了如何分离在斑马鱼T-ALL侧群细胞。首先，经由TOL2质粒的显微注射到单细胞阶段的胚胎产生的T-ALL在斑马鱼。一旦肿瘤已发展到一个阶段，在其业务拓展到超过一半的ANI的马氏体，T细胞可以收获。然后将细胞用Hoechst 33342染色，并通过流式细胞术检查侧群细胞。该方法在斑马鱼T-ALL研究中有广泛应用。虽然斑马鱼中没有已知的细胞表面标志物证实这些侧面细胞是否是癌症干细胞样的，但是体内功能性移植测定是可能的。此外，单细胞转录组学可以应用于鉴定这些侧群体细胞的遗传特征。
Introduction
侧群体测定利用细胞膜上的ATP结合盒（ABC）转运蛋白的高水平来增强组织内某些细胞的能力，从而排出DNA结合染料Hoechst 33342。使用UV激光激发染料后，可以使用双波长流式细胞术分析鉴定外排Hoechst 33342染料的细胞。该测定首先用于鉴定鼠造血干细胞（HSCs） 1 ，但是它已被用于鉴定许多组织和癌症中的干细胞/祖细胞群（参见参考文献2）。然而，并不是所有的细胞群均具有侧面群体，并且并不是所有的侧面群体都富含茎/祖细胞。
斑马鱼是一种强大的脊椎动物遗传模型系统，用于研究人类癌症3,4 ，具有优于传统小鼠的许多优点癌症的皮肤。斑马鱼胚胎在外部受精并且是光学透明的，促进转基因和体内观察病理过程，包括癌症起始和进展。迄今为止，用于检测潜在的干细胞或祖细胞的侧面群体测定仅已经应用于斑马鱼中的肾脏骨髓来识别HSC，而不是任何斑马鱼癌模型5,6 。
T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）的斑马鱼模型与人类T-ALL 7,8,11的形态学和遗传学相似。 T-ALL是一种侵略性恶性肿瘤，在人类中占儿童的10-15％，成人ALL的占25％。虽然T-ALL的治疗有所改善，但复发仍然很常见，预后不良。 T-ALL肿瘤是异质的并含有许多不同的肿瘤细胞亚群，包括白血病起始细胞（LIC）。 LIC通过其从单个细胞再生整个肿瘤的能力来定义，并且可以通过有限稀释移植测定（LDA）将不同的细胞剂量移植到受体中来计算肿瘤细胞群体内的LIC的频率。虽然已经在斑马鱼中进行LDA实验以计算LIC 8,10,11的频率，但是这种确定是事后做出的，并且不允许LIC的预期分离。因此，缺乏前瞻性分离富集癌症干细胞活性的群体的方法。识别和分离侧群体细胞与斑马鱼T-ALLs是解决这一缺陷的第一步。
这里提出的方案描述了如何有效地产生斑马鱼的T-ALL肿瘤afish利用TOL2介导的转基因，收获T-ALL肿瘤细胞，并用Hoechst 33342染色他们能够识别细胞的侧群。未来与斑马鱼T-ALL 体内实验可以包括侧群细胞是否被富集低收入国家或有其他茎或祖样性质。
Protocol
Representative Results
Discussion
侧群测定法是高度敏感的;因此，该协议的微小变化可导致在检测侧群细胞是困难的。首先，在染色步骤中的温度是特定于每个动物/细胞系统。对于哺乳动物系统中，侧群测定典型地在37℃下2进行。当斑马鱼T-ALL细胞在37℃孵育，许多细胞死亡，这使得在该温育温度不可接受（数据未示出）。当小林和他的同事（2008），斑马鱼解剖肾髓的侧群分析中，温育在25℃，5</s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由芝加哥妇女委员会的大学，温迪威尔案例基金和芝加哥综合癌症中心支援津贴大学（P30 CA014599）的支持。我们要感谢在芝加哥大学的流式细胞仪核心提供的帮助在建立这个实验，并且还有德容实验室的其他成员，特别是莱斯利·佩德拉萨和肖恩·麦康诺。
Materials
| Syngeneic zebrafish (CG2) | See Mizgireuv et al., 2006 | ||
| rag2:c-myc plasmid | Langenau Laboratory | ||
| rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab | rag2 promoter from Langenau Laboratory | ||
| pCS2-transposase plasmid | Chien Laboratory | ||
| NotI -HF restriction enzyme | New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 units in 25 µL |
| mMessage Machine SP6 Transcription Kit | Ambion | Thermo Fisher Scientific – AM1340 | 25 reactions |
| QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
| SteREO Discovery V8 Microscope | Carl Zeiss Microscopy | 495015-0008-000 | |
| Digital microinjector | Tritech Research | MINJ-D | |
| Brass straight-arm needle holder | Tritech Research | MINJ-4 | |
| Magnetic base and stand | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN153 | |
| Glass capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm without filament |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf North America Inc. | 930001007 | |
| Phenol Red solution | Sigma Life Science | P0290 | 0.5% concentration 100 mL |
| Plastic Transfer pipettes | Fisherbrand | 137119D | graduated 7.5 mL bulb |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific – NC0342409 | 100 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific – SH3007103 | 500 mL |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco by Life Technologies | 1001-023 | pH 7.4 (1x) – 500 mL |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 – 300 unit vials |
| 40 um mesh filter | Falcon Corning Brand | 352340 | Case of 50 |
| Trypan blue | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL – Solution (0.4%) |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
| Verapamil | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |
Referências
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