عزل السكان الجانب في الخلايا التائية التي يسببها ميك الخلايا اللمفاوية الحادة اللمفاوية في الزرد
Summary
هنا، نحن تصف تقنية لعزل الخلايا السكان الجانب من نموذج الزرد من التي يسببها MYC T خلايا سرطان الدم الليمفاوي الحاد (T-ALL). هذا الاختبار السكان الجانب حساس للغاية، ويوصف لالزرد T-ALL، لكنها قد تكون قابلة للتطبيق لأنواع الخلايا الزرد الخبيثة وغير الخبيثة الأخرى.
Abstract
قد تحتوي على السكان الخلايا غير المتجانسة، سواء من أنسجة صحية أو خبيثة، مجموعة من الخلايا التي تتميز القدرة التفاضلية ل إفلوكس الحمض النووي ملزم صبغ هويشت 33342. هذا "الجانب السكان" من الخلايا يمكن تحديدها باستخدام أساليب تدفق سايتوميتريك بعد هويشت 33342 صبغ هو متحمس بواسطة الأشعة فوق البنفسجية (أوف) الليزر. السكان الجانب من العديد من أنواع الخلايا يحتوي على الجذعية أو السلف مثل الخلايا. ومع ذلك، ليس كل أنواع الخلايا لديها عدد سكان يمكن التعرف عليها. دانيو ريريو ، الزرد، لديها قوية في نموذج الجسم الحي من الخلايا التائية سرطان الدم الليمفاوي الحاد (T-آل)، ولكن ما إذا كانت هذه الزرد T-ألز لديها سكان الجانب غير معروف. الطريقة الموصوفة هنا الخطوط العريضة لكيفية عزل الخلايا السكانية الجانبية في الزرد T-آل. للبدء، يتم إنشاء T-آل في الزرد عن طريق ميكروينجكتيون من البلازميدات tol2 في الأجنة مرحلة واحدة الخلية. مرة واحدة وقد نمت الأورام إلى مرحلة التي تتوسع في أكثر من نصف العانيجسم مال، يمكن حصاد الخلايا T-آل. ثم تلطخ الخلايا مع هويشت 33342 وفحصها عن طريق التدفق الخلوي للخلايا السكان الجانبية. هذه الطريقة لديها تطبيقات واسعة في الزرد T- جميع البحوث. في حين لا توجد علامات سطح الخلية المعروفة في الزرد التي تؤكد ما إذا كانت هذه الخلايا السكانية الجانبية هي سرطان الخلايا الجذعية مثل، في الجسم الحي فحوصات زرع وظيفية ممكنة. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق ترانسكريبتوميكس خلية واحدة لتحديد السمات الوراثية لهذه الخلايا السكانية الجانبية.
Introduction
المقياس السكاني الجانب يستفيد من تعزيز قدرة خلايا معينة داخل الأنسجة ل إفلوكس الحمض النووي ملزمة صبغ هويشت 33342 بسبب مستويات عالية من البروتين أتب ملزمة (أبك) البروتينات الناقل على غشاء الخلية. الخلايا التي تفرغ صبغ هويشت 33342 يمكن تحديدها باستخدام تحليل الطول الموجي المزدوج تحليل سايتوميتريك بعد صبغ متحمس بواسطة ليزر الأشعة فوق البنفسجية. وقد استخدم هذا الفحص لأول مرة لتحديد الخلايا الجذعية المكونة للدم الفئران (هسس) 1 ، ولكنها استخدمت منذ ذلك الحين لتحديد السكان الخلايا الجذعية / السلف في العديد من الأنسجة والسرطانات (استعرض في المرجع 2). ومع ذلك، ليس كل السكان من الخلايا لديها سكان الجانب، وليس إثراء جميع السكان الجانب للخلايا الجذعية / السلف.
الزرد هو نظام نموذج وراثي الفقاريات قوية لدراسة السرطان البشري 3 ، 4 ، مع عدد من المزايا على مو التقليدية الفئرانديلس، بسبب، برج السرطان. وتخصيب الأجنة الزرد خارجيا وهي واضحة بصريا، وتسهيل ترانزجينيسيس والمراقبة في الجسم الحي من العمليات المرضية، بما في ذلك بدء السرطان والتقدم. وحتى الآن، وقد تم تطبيق فحص السكان الجانب للكشف عن الجذعية المحتملة أو الخلايا السلف فقط إلى نخاع الكلى في الزرد لتحديد هسس، وليس إلى أي نماذج السرطان الزرد 5 ، 6 .
نموذج الزرد من الخلايا التائية سرطان الدم الليمفاوي الحاد (T-آل) هو شكليا وراثيا مماثلة للإنسان T-آل 7 ، 8 ، 11 . T-آل هو خبيثة عدوانية التي، في البشر، تمثل 10-15٪ من الأطفال و 25٪ من البالغين جميع الحالات 9 . في حين أن علاج T-آل قد تحسنت، والانتكاس لا يزال شائعا ويرتبط مع سوء التشخيص. الأورام T-آل هي غير متجانسةأوس وتحتوي على العديد من المجموعات السكانية الفرعية للورم مختلفة، بما في ذلك خلايا بدء سرطان الدم (ليس). وتعرف المركبات الليفية الليفية عن طريق قدرتها على إعادة نمو الورم بأكمله من خلية واحدة، ويمكن حساب تواتر الخلايا الليفية داخل خلايا الخلايا السرطانية عن طريق زرع جرعات خلايا متفاوتة إلى مستلمين عن طريق مقايسة زرع التخفيف المحدود (لدا). في حين أجريت تجارب لدا في الزرد لحساب وتيرة الليكود 8 ، 10 ، 11 ، ويتم هذا التحديد في وقت متأخر ولا يسمح لعزلة المحتملين من البلدان المنخفضة الدخل. لذلك، هناك طريقة لعزل مستقبلي للسكان المخصب لنشاط الخلايا الجذعية السرطانية غير موجودة. تحديد وعزل الخلايا السكانية الجانبية من الزرد T-ألز هو الخطوة الأولى نحو معالجة هذا النقص.
بروتوكول المعروضة هنا يصف كيفية توليد بكفاءة T- آل أورام في زبرأفيش باستخدام ترانسجينيسيس tol2 بوساطة، وحصاد خلايا الأورام T-آل، وصمة عار لهم مع هويشت 33342 لتحديد الجانب السكان من الخلايا. المستقبل في التجارب المجراة مع الزرد T-آل يمكن أن تشمل ما إذا كان يتم إثراء الخلايا السكانية الجانبية لل ليكس أو يكون لها خصائص أخرى الجذعية أو السلف.
Protocol
Representative Results
Discussion
فحص السكان الجانب حساس للغاية. وبالتالي، يمكن التغييرات الطفيفة على البروتوكول يؤدي إلى صعوبة في الكشف عن خلايا سكان الجانب. أولا، ودرجة الحرارة خلال تلطيخ خطوة هي خاصة بكل نظام الحيوانية / الخلية. لأنظمة الثدييات، يتم إجراء فحص سكان الجانب عادة عند 37 درجة مئوية <sup cla…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل جامعة مجلس شيكاغو للمرأة، وصندوق ويندي الحالة سوف، وجامعة شيكاغو الشامل للسرطان مركز دعم جرانت (P30 CA014599). ونود أن نشكر التدفق الخلوي الأساسية في جامعة شيكاغو لمساعدتهم في تأسيس هذه التجربة، وكذلك الأعضاء الآخرين في مختبر دي يونج، ولا سيما ليزلي بيدرازا وسين مكونل.
Materials
| Syngeneic zebrafish (CG2) | See Mizgireuv et al., 2006 | ||
| rag2:c-myc plasmid | Langenau Laboratory | ||
| rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab | rag2 promoter from Langenau Laboratory | ||
| pCS2-transposase plasmid | Chien Laboratory | ||
| NotI -HF restriction enzyme | New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 units in 25 µL |
| mMessage Machine SP6 Transcription Kit | Ambion | Thermo Fisher Scientific – AM1340 | 25 reactions |
| QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
| SteREO Discovery V8 Microscope | Carl Zeiss Microscopy | 495015-0008-000 | |
| Digital microinjector | Tritech Research | MINJ-D | |
| Brass straight-arm needle holder | Tritech Research | MINJ-4 | |
| Magnetic base and stand | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN153 | |
| Glass capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm without filament |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf North America Inc. | 930001007 | |
| Phenol Red solution | Sigma Life Science | P0290 | 0.5% concentration 100 mL |
| Plastic Transfer pipettes | Fisherbrand | 137119D | graduated 7.5 mL bulb |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific – NC0342409 | 100 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific – SH3007103 | 500 mL |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco by Life Technologies | 1001-023 | pH 7.4 (1x) – 500 mL |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 – 300 unit vials |
| 40 um mesh filter | Falcon Corning Brand | 352340 | Case of 50 |
| Trypan blue | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL – Solution (0.4%) |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
| Verapamil | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |
Referências
- Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A., Mulligan, R. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Golebiewska, A., Brons, N. H. C., Bjerkvig, R., Niclou, S. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8, 136-147 (2011).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111 (3), 1131-1137 (2008).
- Tsinkalovsky, O., Vik-Mo, A. O., Ferreira, S., Laerum, O. D., Fjose, A. Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties. Differentiation. 75 (3), 175-183 (2007).
- Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299, 887-890 (2003).
- Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. J Vis Exp. , e2790 (2011).
- Martelli, A. M., et al. Targeting signaling pathways in T-cell acute lymphoblastic leukemia initiating cells. Adv Biol Regul. 56, 6-21 (2014).
- Smith, A. C. H., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
- Blackburn, J. S., et al. Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in T cell acute lymphoblastic leukemia through Akt/mTORC1 pathway activation. Cancer Cell. 25, 366-378 (2014).
- . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. JoVE Science Education Database. , (2016).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Pesquisa do Câncer. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , (1993).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct “side population” of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci. USA. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Komuro, H., et al. Identification of side population cells (stem-like cell population) in pediatric solid tumor cell lines. J Pediatr Surg. 42 (12), 2040-2045 (2007).
- Moshaver, B., et al. Identification of a small subpopulation of candidate leukemia-initiating cells in the side population of patients with acute myeloid leukemia. Stem Cells. 26 (12), 3059-3067 (2008).
