Protocole pour la différenciation de cellules souches pluripotentes induites par l'homme dans des cultures mixtes de neurones et Glia pour des tests de neurotoxicité

1. Expansion de cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPSC) NOTE: Les hiPSC peuvent être cultivés sur un substrat de mélange de protéines approprié en présence de mTeSR1 contenant des suppléments mTeSR1 5x (préparés selon les instructions du fabricant, plaque ~ 100 fragments de colonie / boîte de Petri de 60 mm). Lorsque les colonies hiPSC atteignent une taille appropriée (voir un exemple de colonie dans la Figure 2A ), passez les cellules comme décrit ci-dessous (une fois par semaine). Revêtir des vaisselles avec une matrice de membrane basée sur hESC (ci-après dénommée «matrice qualifiée») ou tout autre substrat protéique approprié. Conservez la matrice qualifiée (voir la Table des matériaux ) à -80 ° C dans des aliquotes de 200 μL dans des tubes froids de 1,5 mL et des pipettes froides de 5 ou 10 ml. Avant de passer, décongéler 200 μL de matrice qualifiée sur glace. Diluer 200 μL de matrice qualifiée en 20 mL de milieu DMEM / F12 (dilution 1: 100). Enduire des boîtes de Petri de 60 mm avec cette solution (5 mL / plat). Incuber les plats enduits à 37 ° C pendant au moins 1 h. Brillance et décongélation du fragment de colonie HiPSC Après avoir coupé les colonies hiPSC (voir l'étape 1.3 pour la procédure de coupe de la colonie hiPSC), restreignez doucement et lentement les fragments de colonies hiPSC dans le milieu de congélation des cellules souches, ~ 100 fragments / 250 μL (voir la Table des matériaux). Aliquotez les fragments de colonies dans des flacons appropriés pour la cryoconservation (250 μL / flacon). Placez les flacons dans un récipient rempli de 2-propanol et placez le récipient à -80 ° C pendant au moins 2 h et jusqu'à 2 semaines. Transférer les flacons dans la phase vapeur d'un réservoir d'azote liquide. Pour redémarrer la culture, décongeler 1 flacon congelé dans un bain d'eau à 37 ° C. Recueillir doucement les fragments de colonie hiPSC dans 7 mL de hiPSC complet préchaufféMoyen (voir la table des matières ) dans un tube de 15 ml en utilisant une pipette de 1, 2 ou 5 mL. Centrifuger les fragments de colonies hiPSC à 130 xg pendant 3 min. Retirez le surnageant et resustez doucement les fragments de colonie hiPSC dans 1 mL de milieu hiPSC complet en utilisant une pipette de 1, 2 ou 5 mL. En outre, diluer la suspension cellulaire dans 3 ou 4 mL de milieu hiPSC complet. Placer les fragments de colonie hiPSC dans une plaque de Petri 60 mm (matricielle matricielle qualifiée) (~ 100 fragments / plat, enduire la vaisselle comme décrit à l'étape 1.1). Incuber les hiPSC à 37 ° C et 5% de CO 2 . Effectuer un changement moyen total tous les jours. Passage des colonies HiPSC REMARQUE: les HiPSC non indifférenciés devraient avoir une forme ronde, avec de gros nucléoles et sans cytoplasme abondant. Les colonies indifférenciées devraient être caractérisées par une morphologie plate et très serrée. Seules les colonies indifférenciées (environ 1 mm iN diamètre) doivent être coupés pour un passage ultérieur. Couper les colonies de cellules souches dans des carrés d'environ 200 μm x 200 μm en utilisant une seringue de 1 mL avec une aiguille 30G ou tout autre outil disponible dans le commerce (voir la Table des matières). Utilisez un microscope stéréoscopique à un grossissement de 4x dans une armoire à flux laminaire à température ambiante. Détachez les fragments de colonies de la surface du plat à l'aide d'une pipette de 200 μL en pipetteant doucement le milieu en dessous pour soulever les pièces. Transférer les fragments de colonies (~ 100 pièces) à une plaque matricielle qualifiée-DMEM / F12 remplie de 4 mL de milieu hiPSC complet (voir la Table des matériaux, enduire la vaisselle comme décrit à l'étape 1.1). Incuber la (les) nouvelle (s) plaque (s) à 37 ° C et 5% de CO 2 . Effectuer un changement moyen total tous les jours et inspecter la morphologie des colonies en utilisant un microscope à contraste de phase à des grossissements de 4X et 10X. 2. HiPSC DiffereNtiation dans les neurones mixtes et Glia REMARQUE: la procédure dure approximativement 28 jours, avec les étapes principales décrites dans la figure 1 (partie supérieure). Figure 1: Représentation schématique du protocole de différenciation neuronale. (Partie supérieure) Les colonies IMR90-hiPSC peuvent être coupées en fragments pour former des corps embryoïdes (EB). Après 2 jours in vitro (DIV), les EB peuvent être plaqués sur des plaques enduites de matrice laminées ou standard et cultivées en présence d'un milieu d'induction neuroépithéliale (NRI) pour générer des dérivés neuroectodermiques (rosettes, ici colorées pour nestin (vert) et β -III-tubuline (rouge)). Les rosettes peuvent être dissociées, collectées, reconstituées sur des plats revêtus de matrice laminés ou standard, et différenciées en neurones matures (NF200, rouge) et gliales(GFAP, vert) en présence d'un milieu de différenciation neuronale (ND). (Partie inférieure) Les NSC dérivés de la rosette (nestin, rouge) peuvent être développés en présence d'un milieu d'induction neurale (NI), cryoconservé ou encore différenciés en présence de milieu ND pour former des neurones mixtes (NF200, vert) et gliaux ( GFAP, rouge) cultures. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Production de corps embryoïdes (EB) (Jours 0 → 1) REMARQUE: cette procédure nécessite de bonnes compétences manuelles et de précision. Les fragments de colonies HiPSC devraient être de même taille pour obtenir des corps embryoïdes homogènes (EB) dans les prochaines étapes. Les colonies morphologiquement différenciées (avec de grandes fractions cytoplasmiques et petits nucléoles) doivent être éliminées. Rafraîchir le milieu HiPSC (plaque de Petri de 3 mL / 60 mm) avant de couper les colonies hiPSC indifférenciées (environ 1 mm de diamètreEter, voir la figure 2A ) dans des conditions stériles (comme décrit à l'étape 1). Couper les colonies indifférenciées (comme le montrent les figures 2A et 2B ) en fragments d'environ 200 μm x 200 μm en utilisant une seringue de 1 mL avec une aiguille 30G. Utiliser un microscope stéréoscopique à un grossissement de 4X dans une armoire à flux laminaire à température ambiante. Détachez les fragments de colonies de la surface du plat à l'aide d'une pipette de 200 μl en faisant pipeter doucement le milieu en dessous pour soulever les pièces. Transférer tous les fragments détachés et le tube moyen à 15 ml en utilisant une pipette de 1, 2 ou 5 mL. Rincer le plat avec 2 ml de milieu HiPSC complet pour récupérer tous les fragments. Centrifuger à 112 xg pendant 1 min. Aspirer le surnageant et ressusciter doucement les fragments dans 5 ml de milieu hiPSC EB complet (voir la Table des matériaux ). Plaquer le coDes fragments de lony dans une boîte de Petri ultra-basse de 60 mm (plaque de Petri de 5 mL / 60 mm). Incuber la boîte de Petri pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO 2 . Le jour suivant (Jour 1), collecter les EB et leur milieu dans un tube de 15 mL en utilisant une pipette de 1, 2 ou 5 mL. Centrifuger les EB à 112 xg pendant 1 min. Aspirer soigneusement le surnageant et ressusciter doucement les EB dans 5 ml de milieu hiPSC EB complet en utilisant une pipette de 1, 2 ou 5 mL. Replacer les EB sur une nouvelle boîte de Petri à fixation ultra-basse de 60 mm (5 pi / 60 mm de boîte à pétri). Incuber la boîte de Petri pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO 2 . Le jour 1, revêtir la vaisselle avec la matrice de la membrane du sous-sol ( p. Ex. Matrigel, ci-après dénommée «matrice standard») ou tout autre substrat de protéine approprié ( p . Ex ., Laminine). Conservez la matrice standard (voir la Table des matériaux ) à -80 ° C enDes aliquotes de 200 μL utilisant des tubes froids de 1,5 ml et des pipettes froides de 5 ou 10 ml. Décongeler 200 μL de matrice standard sur glace. Diluer 200 μL de matrice standard dans 20 mL de milieu DMEM / F12 (dilution 1: 100). Enduire des boîtes de Petri de 60 mm avec cette solution (5 mL / plat). Incuber les plats enduits à 37 ° C pendant la nuit. REMARQUE: Ces plats seront utilisés pour plaquer les EB (environ 50 EB / plat) et générer des agrégats neuroépithéliaux (rosettes); Voir l'étape 2.3. Génération d'agrégats neuroépithéliaux (rosettes) (jours 2 → 7) Le jour 2, retirer la solution de revêtement de matrice standard des boîtes de Petri de 60 mm (pas besoin de rincer les plaques) et les remplir avec 5 mL / plat de milieu d'induction neuroépithélial complet (NRI); Voir la table des matières . Transférer les EB flottants (de l'étape 2.1.14) aux plats enrobés (~ 50 EB / plat) à l'aide d'une pipette de 200 μL sous une stéréoscopieCroscope à un grossissement de 4x et placé dans une armoire à flux laminaire. REMARQUE: Il est essentiel de sélectionner des EBs homogènes et de taille moyenne (~ 200 à 300 μm de diamètre). Des EB trop petites peuvent ne pas survivre bien pendant la différenciation neuroectodermique, alors que les EB trop larges ont tendance à subir une nécrose de noyau. Incuber la vaisselle à 37 ° C et 5% de CO 2 . Le lendemain (Jour 3), vérifiez la vaisselle au microscope à un grossissement de 10x pour s'assurer que les EB sont tous attachés. Effectuez doucement un changement de milieu total avec un NRI complet. Changez le milieu NRI tous les deux jours jusqu'au jour 7, lorsque les agrégats neuroépithéliaux (rosettes) devraient être visibles. Le jour 7, revérifier la matrice standard (ou la laminine), comme décrit à l'étape 2.2, sur n'importe quel format de plaque ou plat: plaques à 96 puits (100 μL / puits), plaques à 24 puits (250 μL / puits), 12- Des plaques de puits (500 μL / puits), des puces MEA (pour l'activité électrique, 1 mL / puce de puits unique), ou 60 mm de disrime de PetriS (4 mL / plat). Incuber les plaques / vaisselle revêtues pendant au moins 2 h à 37 ° C et 5% de CO 2 . La dissociation de la rosette et la différenciation neuronale (jours 8 → 28) REMARQUE: cette procédure nécessite de bonnes compétences manuelles et de précision. Pour éviter de collecter des cellules mésodermiques et endodermiques, seules les structures de type rosette ectodermiques doivent être dissociées et collectées. Le jour 8, couper les structures en forme de rosette en fragments sous un microscope stéréoscopique à un grossissement 10X dans des conditions stériles. Utilisez une seringue de 1 mL avec une aiguille 30G. Notez que les rosettes ont tendance à se détacher facilement du plat lorsqu'il est touché avec l'aiguille. Compléter le détachement des fragments de rosette en utilisant une pipette de 200 μL. Transférer le plat sous le capot de flux laminaire et collecter les fragments de rosette et leur milieu dans un tube conique de 15 ml en utilisant une pipette de 1, 2 ou 5 mL. Rincer le plat avec 2 ml de milieu NRI pour récupérerTous les fragments. Tournez les fragments de rosette à 112 xg pendant 2 min. Aspirer le surnageant. Remplacer doucement la pastille dans 1 mL de 1x DPBS (sans calcium et magnésium) et pipeter doucement les fragments de rosette vers le haut et vers le bas en utilisant une pipette de 1000 μL pour les dissocier partiellement. Ajouter 4 ml de milieu NRI complet et compter les cellules en utilisant du bleu trypan et un compteur automatique de cellules (voir la Table des matières ) REMARQUE: Diluer 20 μL de suspension cellulaire dans 20 μL de bleu trypan. Cette étape peut être omise si les cellules ne peuvent pas être introduites dans une suspension à une seule cellule. Si les fragments de rosette ne semblent pas complètement dissociés, des fragments de rosettes dérivés d'environ 50 EB / plat de 60 mm peuvent être remis en suspension dans 50 ml de milieu NRI complet et plaqué, comme indiqué dans le tableau 1 . Aspirer la solution de revêtement de matrice standard (ou laminine) des plaques de Petri, des plaques et / ou des chips MEA (de l'étape 2.3.7). Ne les laissez pas sécher. Placer les cellules dans un milieu NRI complet selon le plan d'étude (environ 15 000 cellules / cm 2 , voir Tableau 1 pour les indications de volume du placage). Incuber les plaques pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO 2 . Le jour 10, effectuez un changement de milieu total en utilisant un milieu de différenciation neuronal complet (ND); Voir la table des matières. Rafraîchir le support ND complet deux fois par semaine jusqu'au jour 28. Caractériser les dérivés des cellules neuronales / gliaires, comme décrit à l'étape 5 (voir le tableau 2 pour les critères d'acceptation générale). 3. Expansion et différenciation des cellules souches neuronales (NSC) dérivées par HiPSC dans les neurones mixtes et Glia REMARQUE: Les NSC dérivés de fragments de rosette peuvent être développés et maintenus selon la procédure décrite ci-dessous ( Figure 1 , partie inférieure). Cela permet d'augmenterNombre de cellules pour la différenciation et les tests chimiques. Enduire une boîte de Petri de 60 mm (ou un ballon T-25) avec 5 ml de solution de revêtement DMEM / F12 de matrice standard et l'incuber pendant au moins 2 h à 37 ° C et 5% de CO 2 (comme décrit à l'étape 2.2). Faire tourner les fragments de rosette dérivés des étapes 1-2 (voir étape 2.4) dans un tube conique de 15 ml à 112 xg pendant 2 min. Remplacer doucement la pastille dans 5 ml de milieu d'induction neurale (NI); Voir la table des matières. Transférer les cellules sur une plaque de Petri 60 mm (ou une fiole T-25) standard. Culture des NSC dérivés de rosette en présence de NI medium, rafraîchissant le milieu tous les deux jours jusqu'à ce que les cellules atteignent la confluence. Lorsqu'il est confluent, passez les NSC comme décrit dans les étapes suivantes. REMARQUE: Passer les NSC environ une fois par semaine; Envisager d'utiliser des plats, des flacons ou des assiettes fraîchement revêtus, selon le plan d'étude. Supprimer l'intégralité NI medium et gentlRincez les NSC avec du DPBS (sans calcium et magnésium). Ajouter 1,5 ml de 0,05% de trypsine-EDTA préchauffée à 37 ° C à la boîte de Petri 60 mm (ou flacon T-25) contenant les cellules et la placer dans l'incubateur pendant 1 min. Tapez doucement le plat (ou le flacon) pour détacher les cellules. Ajouter 1,5 ml d'inhibiteur de trypsine préchauffé à 37 ° C et transférer les cellules dans un tube de 15 ml. Rincer la boîte de Petri (ou le ballon T-25) avec un volume égal de milieu NI (1,5 mL) et collecter le volume dans le même tube de 15 ml. Centrifuger les cellules à 130 xg pendant 3 min. Supprimez le surnageant et resuspendez doucement les cellules dans 1 ml de milieu NI complet en utilisant une pipette de 1000 ul. En outre, diluer la suspension cellulaire dans 3 ou 4 ml de milieu NI complet et compter les cellules en utilisant du bleu de trypan et un compteur de cellules automatisé. Placer les NSC sur la boîte de Petri de 60 mm (ou flacon T-25) à partir de l'étape 3.1 à une densité d'environ 50 000 cellules / cm 2 . <li> Effectuez un changement moyen total avec un support NI complet tous les deux jours. Caractériser les cellules pour la présence de dérivés de cellules neuronales / gliales, comme décrit à l'étape 5. NOTE: Les NSC peuvent être différenciés en cultures mixtes de neurones et de glie dans un milieu ND complet (comme décrit aux étapes 2.4.11-2.4.13), rafraîchissant le milieu ND complet deux fois par semaine pendant 21 jours. 4. Cryopreservation et décongélation NSC dérivées HiPSC REMARQUE: lors du passage, les NSC peuvent être gelés et redémarré suivant cette procédure. Centrifugement NSC passaged (à partir de l'étape 3.12) à 130 xg pendant 3 min. REMARQUE: les cellules doivent être comptées à l'étape 3.14. Ressuscissez doucement et lentement les NSC à 3 x 10 6 / mL de milieu de congélation (voir la Table des matières ). Aliquoter les cellules dans des flacons appropriés pour la cryoconservation (environ 0,5 mL = 1,5 x 10 6 / flacon). Placer les flacons dans un récipientLiner avec du 2-propanol et placer le récipient à -80 ° C pendant un minimum de 2 h et jusqu'à 2 semaines. Transférer les flacons à la phase vapeur d'un réservoir d'azote liquide. Pour redémarrer la culture cellulaire, décongeler 1 flacon congelé dans un bain d'eau à 37 ° C. Recueillir doucement les cellules dans 7 ml de milieu NI préchauffé dans un tube de 15 ml en utilisant une pipette de 1000 ul. Centrifuger les cellules à 130 xg pendant 3 min. Retirez le surnageant et resuspendez doucement les cellules dans 1 mL de milieu NI complet en utilisant une pipette de 1000 μl. Diminuer davantage la suspension cellulaire dans 3 ou 4 mL de milieu NI complet et compter les cellules en utilisant du bleu de trypan et un compteur de cellules automatisé (note: diluer 20 μL de suspension cellulaire dans 20 μL de bleu trypan; la viabilité après décongélation doit être ≥ 80 %). Placer les NSC dans une boîte de Petri 60 mm revêtue (ou une fiole T25) à une densité d'environ 50 000 cellules / cm 2 . 5. CharaCterisation de cellules neuronales et gliaques dérivées de HiPSC NOTE: Lors de la différenciation, les dérivés neuronaux et gliaux peuvent être caractérisés en utilisant différentes techniques, telles que celles décrites dans les sections suivantes. Analyses quantitatives en temps réel de la PCR (qPCR) 10 Faites tourner les fragments de colonies HiPSC, EBs et / ou NSC à 130 xg pendant 3 min. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 100 μl de tampon de lyse à ARN froid fourni dans un kit approprié pour l'extraction de l'ARN. Alternativement, collecter des dérivés neuronaux / gliaux directement à partir des plaques en aspirant le milieu et en ajoutant un tampon de lyse à ARN froid dans les puits pour collecter les cellules. Isoler l'ARN en suivant les instructions du fabricant. Inverser-transcrire 500 ng de l'ARN total en utilisant un kit approprié pour l'ARN à la rétrotranscription d'ADNc. Exécutez les réactions qPCR en double en utilisant un mélange maître approprié et une amorce(Voir la table des matières ). Enregistrez l'émission fluorescente en temps réel: 45 cycles avec un amorçage d'amorces à 60 ° C. Normaliser les quantités d'ARN relatives à GAPDH et β-actine en tant que gènes de référence et utiliser des hiPSC indifférenciés ou des cellules non traitées pour les conditions d'étalonnage (méthode ΔΔCt). Alternativement, utilisez une autre méthode appropriée. Immunocytochimie et imagerie à haute teneur (HCI) 6 , 11 Fixer les colonies hiPSC, les NSC et / ou les dérivés neuronaux / gliaux avec du paraformaldéhyde froid à 4% pendant 15 minutes à température ambiante. Laver doucement les cellules dans 1X PBS et stocker les plaques à 4 ° C pendant 1 mois maximum. Lorsqu'ils sont prêts à colorer, perméabiliser les cellules dans un tampon de perméabilisation (1x DPBS contenant 0,1% de triton-X-100 et 3% de BSA) pendant 15 minutes à température ambiante. Supprimer la perméabilisation buFermer et incuber les cellules dans le tampon de blocage (3% BSA / 1X DPBS) pendant 15 min à température ambiante pour éviter la liaison non spécifique des anticorps. Enlever le tampon de blocage et incuber les cellules pendant une nuit à 4 ° C dans un tampon de blocage contenant des anticorps primaires appropriés (voir la Table des matières ). Laver les cellules 3 fois avec 1x PBS. Incuber les cellules pendant 45 minutes à température ambiante dans un tampon de blocage contenant des anticorps secondaires conjugués au fluorochrome (voir le tableau des matériaux ), contre-colorant les noyaux avec du colorant DAPI. Quantifier l'intensité de fluorescence moyenne et les pourcentages relatifs de types de cellules en utilisant une plate-forme d'imagerie à contenu élevé appropriée, si disponible (voir la Table des matériaux ). NOTES: Pour déterminer le niveau d'intensité du fond fluorescent, incuber certaines cellules / puits avec des anticorps secondaires seuls. L'analyse cytométrique en flux de Live (non fixe), undDes hiPSC peuvent être effectués pour évaluer l'expression des marqueurs spécifiques de PSC, tels que SSEA4 (voir le tableau des matériaux ). Les colonies hiPSC indifférenciées peuvent être analysées pour l'activité de la phosphatase alcaline en utilisant des kits BCIP / NBT disponibles dans le commerce, en suivant les instructions du fabricant (voir la Table des matériaux ). En outre, des analyses et analyses de matrice de protéines en phase inverse (RPPA) peuvent être effectuées, comme décrit dans la référence 12 (pour une liste d'anticorps testés, voir la Table des matières ). Mesures électrophysiologiques 13 Placer les fragments de rosette dissociés (après 7 DIV) ou les NSC dérivés de rosettes sur des tableaux multi-électrodes revêtus (MEA, voir la Table des matériaux ) en milieu ND complet (~ 1 x 10 5 cellules / puce MEA à un seul puits). Différencier les cellules pendant 3 semaines en milieu ND complet, rafraîchissantE moyenne deux fois par semaine. À la fin de la différenciation, sceller les puces MEA avec une membrane semi-perméable sous une hotte à flux laminaire afin de maintenir les cultures stériles pour des mesures répétées. Remplacez l'une des électrodes par une seule référence au sol, ce qui permet d'enregistrer les enregistrements des électrodes restantes. Enregistrez le taux de tir moyen (MFR, nombre de pointes / min) en utilisant un amplificateur MEA avec la régulation intégrée de la température réglée à 37 ° C et 5% de CO 2 . Détecter des pics à partir des données brutes MEA en utilisant une limite de seuil de -4,7σ (σ représente l'écart type du bruit de base). Traiter les données post-enregistrement avec un logiciel approprié.