JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

عزل بروتينات الشعيرة المتوسطة من أنسجة الفئران المتعددة لدراسة التعديلات المرتبطة بالشيخوخة بعد الترجمة

Published: May 18, 2017
doi:
10.3791/55655
, , , ,
1Department of Cell Biology and Physiology, School of Medicine,University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

في هذه الطريقة، نقدم الإجراءات البيوكيميائية لعزل سريعة وفعالة من البروتينات خيوط (إف) وسيطة من أنسجة الماوس متعددة. يمكن استخدام إفس معزولة لدراسة التغيرات في التعديلات بعد متعدية من قبل الطيف الكتلي وغيرها من المقايسات الكيميائية الحيوية.

Abstract

الشعيرات المتوسطة (إفس)، جنبا إلى جنب مع خيوط الأكتين والأنابيب الدقيقة، تشكل الهيكل الخلوي – عنصرا هيكليا حاسما في كل خلية. أداء طبيعي توفر إفس الخلايا مع مرونة الميكانيكية والقدرة على الإجهاد، في حين أن خلل هيكلي خلل إف يخل بالصحة الخلوية، وكان مرتبطا مع العديد من الأمراض البشرية. التعديلات بعد متعدية (بتمس) تنظم بشكل حاسم ديناميات إف استجابة للتغيرات الفسيولوجية وتحت ظروف الإجهاد. ولذلك، فإن القدرة على رصد التغييرات في توقيع بتم من إفس يمكن أن تسهم في فهم وظيفي أفضل، وتكييف في نهاية المطاف، من نظام إف كمجيب مجيب أثناء الإصابة الخلوية. ومع ذلك، فإن العدد الكبير من البروتينات إف، التي يتم ترميزها من قبل أكثر من 70 الجينات الفردية ويعبر عنها بطريقة تعتمد على الأنسجة، هو التحدي الرئيسي في فرز الأهمية النسبية لمختلف بتمس. تحقيقا لهذه الغاية، والأساليب التي تمكن من مراقبة بتمس على إف البروتيناتعلى مستوى الكائن الحي، بدلا من أفراد الأسرة المعزولين، أن يسرع التقدم في مجال البحوث في هذا المجال. هنا، نقدم طرق البيوكيميائية لعزل الكلي، المنظفات القابلة للذوبان، وجزء مقاوم للمنظفات من البروتينات إف من 9 أنسجة الماوس المختلفة (الدماغ والقلب والرئة والكبد والأمعاء الدقيقة والأمعاء الغليظة والبنكرياس والكلى، و طحال). نحن أيضا إظهار بروتوكول الأمثل لعزل سريع من البروتينات إف باستخدام مصفوفة ليسينغ والتجانس الآلي من أنسجة الماوس المختلفة. بروتوكول الآلي هو مفيد ل إفس التنميط في التجارب ذات حجم عينة عالية (كما هو الحال في نماذج المرض التي تنطوي على حيوانات متعددة والمجموعات التجريبية). ويمكن استخدام العينات الناتجة عن مختلف التحليلات المصب، بما في ذلك التنميط القائم على الطيف الكتلي بتم. باستخدام هذه الأساليب، ونحن نقدم بيانات جديدة لإظهار أن إف البروتينات في أنسجة الماوس المختلفة (الدماغ والكبد) تخضع لتغييرات موازية فيما يتعلق إكسبريسمستويات سيون و بتمس خلال الشيخوخة.

Introduction

إفس هي عائلة من البروتينات التي في البشر يتم ترميزها من قبل 73 الجينات وتصنيفها إلى ستة أنواع رئيسية: أنواع I-إيف هي السيتوبلازمية (على سبيل المثال كيراتينس الظهارية والشعر (K)، ميوسيت ديسمين، العصبية، الدبقية الليفي الحمضية البروتين (غفاب) و اخرين)؛ النوع الخامس هي اللامين النووي. والنوع السادس هي إفس في عدسة العين 1 . من حيث التنظيم الجزيئي، والبروتينات إف لديها ثلاثة مجالات مشتركة: نطاق "ملف" قضيب ملفوفة للغاية، و "الرأس" و "ذيل" المجالات الكروية. إذا تجمع تيترامرز البروتين لتشكيل السلائف خيوط قصيرة، والتي يتم تضمينها في نهاية المطاف في خيوط ناضجة التي تشكل الهياكل الهيكلية الهيكلية والهياكل النووية الحيوية المشاركة في الحماية الميكانيكية 2 ، والاستشعار الإجهاد 3 ، 4 ، وتنظيم النسخ 5 والنمو، وغيرها من الوظائف الخلوية الحرجة"> 1 ، 6 ، 7 .

وتسلط الضوء على أهمية وظيفية للنظام إف من وجود العديد من الأمراض البشرية الناجمة عن الطفرات الصفر في الجينات إف، بما في ذلك الاعتلال العصبي، اعتلال عضلي، واضطرابات هشاشة الجلد، اختلالات التمثيل الغذائي، ومتلازمات الشيخوخة المبكرة 8 . بعض الطفرات الجينية إف لا تسبب، ولكن تأهب ناقلاتهم إلى تطور المرض، مثل كيراتينس الظهارية بسيطة في أمراض الكبد 9 . ويرجع هذا الأخير إلى وظائف حرجة واقية من الإجهاد إفس في الظهارة. إفس بشكل عام هي من بين البروتينات الخلوية الأكثر وفرة في ظل الظروف القاعدية، ولكن هي أكثر بقوة الناجم خلال أنواع مختلفة من الإجهاد 10 . على سبيل المثال، أظهرت الدراسات الحديثة تقييم التغيرات على نطاق البروتيوم في الديدان الخيطية C. ايليجانس أن إفس متعددة هي أوبريغولاتد للغاية وعرضة لتجميععلى خلال الشيخوخة العضوية 11 ، 12 . منذ الحفاظ على بنية إف المناسبة أمر ضروري للمقاومة الخلوية لمختلف أشكال الإجهاد 10 ، إف التجميع قد تسهم أيضا في الانخفاض الوظيفي خلال الشيخوخة. ومع ذلك، الدراسات على مستوى العضوية فحص البروتينات متعددة الثدييات إف عبر الأنسجة المختلفة التي تمر بالإجهاد غير موجودة.

إفس هي هياكل ديناميكية للغاية التي تتكيف مع تلبية مطالب الخلوية. كيراتينس، على سبيل المثال، الخضوع للدراجات البيولوجية مستقلة بين ذوبان (غير خيطي) وغير قابلة للذوبان (الخيطية) بروتين تجمع 13 . في ظل الظروف الفسيولوجية العادية حوالي 5٪ يمكن استخراج مجموع K8 / K18 تجمع في المنظفات خالية من العازلة، بالمقارنة مع ما يقرب من 20٪ التي يمكن أن تذوب في المنظفات غير الأيونية نونيديت P-40، وهو قابل للمقارنة كيميائيا كيميائيا ل تريتون- X100 14 ، </sأوب> 15 . خلال الانقسام هناك زيادة ملحوظة في الذوبان من نوع بسيط K8 الظهارية و K18 14 ، وهو أقل وضوحا في كيراتينس البشرة ولكن أكثر وضوحا في فيمنتين والنوع الثالث من البروتينات إيف الثالث 15 ، 16 . يتم تنظيم خصائص الذوبان من البروتينات إف بإحكام من قبل الفسفرة، وهو مفتاح بعد متعدية تعديل (بتم) لإعادة خيوط الذوبان والذوبان 17 ، 18 ، 19 ، 20 . وتخضع معظم المؤسسات المالية الدولية لتنظيم واسع من قبل عدد من بتمس في المواقع المحفوظة، مما أدى إلى تغييرات وظيفية 17 .

والغرض من هذا الأسلوب هو إدخال المحققين الذين هم جديدون إلى حقل إف إلى الاستخراج البيوكيميائية والأساليب التحليلية لدراسة البروتينات إف عبر أنسجة الماوس متعددة. محددالحليف، ونحن نركز على عزل البروتينات إف باستخدام طريقة استخراج الملح عالية وتقييم التغيرات في بتمس عن طريق الكتلة الطيفية والأجسام المضادة التي تستهدف بتم. هذه الأساليب بناء على الإجراءات المنشورة سابقا 21 ولكن تشمل تعديلات لاستخراج أنواع مختلفة من البروتين إف للكشف عن آلية مشتركة للتنظيم عبر الأسرة إف. على سبيل المثال، K8 أسيتيلاتيون في بقايا يسين معين ينظم تنظيم خيوط، في حين أن هيبيراسيتيلاتيون يعزز K8 عدم القابلية للذوبان وتشكيل الكلي 22 . وقد كشفت الدراسات التنميط البروتينات العالمية الأخيرة بالإضافة إلى ذلك أن معظم البروتينات إف محددة الأنسجة هي أيضا تستهدف الاستمالة وأن معظم إف المواقع تقتصر تقتصر على نطاق قضيب المحفوظة للغاية. وهذا يبرز الحاجة إلى أساليب مناسبة للتنميط العالمي للنظام إف. كما نقدم طريقة سريعة لعزل البروتينات إف من أنسجة متعددة باستخدام التجانس الآلي في أوبتيميزينغ ليسينغ مصفوفة. الاستعدادات الناتجة هي مناسبة لتحليل بتم المصب عن طريق مطياف الكتلة وغيرها من الأساليب.

Protocol

تمت الموافقة على البروتوكول وأداء وفقا للجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية (إاكوك) في جامعة كارولينا الشمالية. 1 – الأعمال التحضيرية إعداد تريتون-X العازلة (1٪ تريتون X-100، 5 ملي إثيلينديامين?…

Representative Results

وهناك طريقة سريعة جديدة لارتفاع استخراج الملح المستندة إلى البروتينات إف من أنسجة الماوس متعددة باستخدام مصفوفة ليسينغ. تم تعديل الطريقة التقليدية 25</s…

Discussion

الأساليب التي تمكن توصيف البيوكيميائية للبروتينات إف يمكن أن تكون مفيدة لفهم الظواهر الفيزيولوجية المرضية العديدة في نظم الثدييات، لأن البروتينات إف على حد سواء علامات ومغيرات من الإجهاد الخلوي والأنسجة 29 . ويستند المبدأ الكامن وراء الطريقة الحالية ع?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد نيه منح نيه R01 DK110355، DK093776 [نتس]، DK102450 [نتس]، و P30 DK034987 [إلى ونك تشابل هيل]. المؤلفين أشكر ديكشيتا رامانارايانان للمساعدة مع قر وتجارب لطخة الغربية.

Materials

Dynabeads Protein G ThermoFisher Scientific 10009 immunoprecipitation beads
PBS ThermoFisher Scientific 10010049 for buffers
Purelink RNA mini kit ThermoFisher Scientific 12183018 RNA extraction from tissue
Purelink DNAse set ThermoFisher Scientific 12185010A on column DNA digestion
Dynamag-2 ThermoFisher Scientific 12321D magnet for use with dynabeads
GelCode Blue Stain Reagent ThermoFisher Scientific 24592 mass spectrometry-compatible gel stain
Pierce ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher Scientific 32106 for use in western blot
High Capacity cDNA reverse transcription kit ThermoFisher Scientific 4368813 for use in gene expression analysis
Proflex 3×32-well PCR System ThermoFisher Scientific 4484073 PCR system
PVDF transfer membrane  ThermoFisher Scientific 88520 for western blot
Power Up SYBR master mix ThermoFisher Scientific A25778 for qPCR analysis
RNAlater ThermoFisher Scientific AM7020 solution for tissue storage prior to RNA isolation
Novex 4-20% Tris Glycine Gel ThermoFisher Scientific XP04205BOX Precast protein gel
Anti-Keratin 8 antibody (TS1) ThermoFisher Scientific MA514428 for western blot detection of K8
Anti-Vimentin ThermoFisher Scientific MA511883 for western blot detection of vimentin
Tris Glycine Transfer Buffer (25X) ThermoFisher Scientific LC3675 for wet transfer of protein gels
2X SDS Sample Buffer ThermoFisher Scientific LC2676 for preparing protein gel samples
Tris Glycine SDS Running Buffer (10X) ThermoFisher Scientific LC26755 for running protein gels
Lysing beads – Matrix D MP Biomedicals 116913100 Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction
Lysing beads – Matrix SS MP Biomedicals 116921100 Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction
NanoDrop Lite Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-LITE measurement of protein and nucleic acid
Precellys 24 homogenizer Bertin Instruments EQ03119 Automated tissue homogenizer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Eriksson, J. E., et al. Introducing intermediate filaments: from discovery to disease. J Clin Invest. 119 (7), 1763-1771 (2009).
  2. Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. J Biol Chem. 290 (28), 17145-17153 (2015).
  3. Perez-Sala, D., et al. Vimentin filament organization and stress sensing depend on its single cysteine residue and zinc binding. Nat Commun. 6, 7287 (2015).
  4. Dialynas, G., et al. Myopathic lamin mutations cause reductive stress and activate the nrf2/keap-1 pathway. PLoS Genet. 11 (5), e1005231 (2015).
  5. Hobbs, R. P., et al. Keratin-dependent regulation of Aire and gene expression in skin tumor keratinocytes. Nat Genet. , (2015).
  6. Chung, B. M., Rotty, J. D., Coulombe, P. A. Networking galore: intermediate filaments and cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 600-612 (2013).
  7. Gruenbaum, Y., Aebi, U. Intermediate filaments: a dynamic network that controls cell mechanics. F1000 Prime Rep. 6, (2014).
  8. Omary, M. B. "IF-pathies": a broad spectrum of intermediate filament-associated diseases. J Clin Invest. 119 (7), 1756-1762 (2009).
  9. Omary, M. B., Ku, N. O., Strnad, P., Hanada, S. Toward unraveling the complexity of simple epithelial keratins in human disease. J Clin Invest. 119 (7), 1794-1805 (2009).
  10. Toivola, D. M., Strnad, P., Habtezion, A., Omary, M. B. Intermediate filaments take the heat as stress proteins. Trends Cell Biol. 20 (2), 79-91 (2010).
  11. Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging. C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
  12. David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in. C. elegans. PLoS Biol. 8 (8), (2010).
  13. Windoffer, R., Beil, M., Magin, T. M., Leube, R. E. Cytoskeleton in motion: the dynamics of keratin intermediate filaments in epithelia. J Cell Biol. 194 (5), 669-678 (2011).
  14. Chou, C. F., Riopel, C. L., Rott, L. S., Omary, M. B. A significant soluble keratin fraction in ‘simple’ epithelial cells. Lack of an apparent phosphorylation and glycosylation role in keratin solubility. J Cell Sci. 105 ( Pt. 2, 433-444 (1993).
  15. Omary, M. B., Ku, N. O., Liao, J., Price, D. Keratin modifications and solubility properties in epithelial cells and in vitro). Subcell Biochem. 31, 105-140 (1998).
  16. Lowthert, L. A., Ku, N. O., Liao, J., Coulombe, P. A., Omary, M. B. Empigen BB: a useful detergent for solubilization and biochemical analysis of keratins. Biochem Biophys Res Commun. 206 (1), 370-379 (1995).
  17. Snider, N. T., Omary, M. B. Post-translational modifications of intermediate filament proteins: mechanisms and functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 163-177 (2014).
  18. Snider, N. T., Weerasinghe, S. V., Iniguez-Lluhi, J. A., Herrmann, H., Omary, M. B. Keratin hypersumoylation alters filament dynamics and is a marker for human liver disease and keratin mutation. J Biol Chem. 286 (3), 2273-2284 (2011).
  19. Eriksson, J. E., et al. Specific in vivo phosphorylation sites determine the assembly dynamics of vimentin intermediate filaments. J Cell Sci. 117 (Pt. 6, 919-932 (2004).
  20. Sahlgren, C. M., et al. Mitotic reorganization of the intermediate filament protein nestin involves phosphorylation by cdc2 kinase). J Biol Chem. 276 (19), 16456-16463 (2001).
  21. Snider, N. T., Omary, M. B. Assays for Posttranslational Modifications of Intermediate Filament Proteins. Methods Enzymol. 568, 113-138 (2016).
  22. Snider, N. T., et al. Glucose and SIRT2 reciprocally mediate the regulation of keratin 8 by lysine acetylation. J Cell Biol. 200 (3), 241-247 (2013).
  23. Danneman, P., Suckow, M. A., Brayton, C., Suckow, M. A. . The laboratory mouse. , (2013).
  24. Weiss, W., Weiland, F., Gorg, A. Protein detection and quantitation technologies for gel-based proteome analysis. Methods Mol Biol. 564, 59-82 (2009).
  25. Achtstaetter, T., Hatzfeld, M., Quinlan, R. A., Parmelee, D. C., Franke, W. W. Separation of cytokeratin polypeptides by gel electrophoretic and chromatographic techniques and their identification by immunoblotting. Methods Enzymol. 134, 355-371 (1986).
  26. Ku, N. O., et al. Studying simple epithelial keratins in cells and tissues. Methods Cell Biol. 78, 489-517 (2004).
  27. Julien, J. P., Mushynski, W. E. Multiple phosphorylation sites in mammalian neurofilament polypeptides. J Biol Chem. 257 (17), 10467-10470 (1982).
  28. Hubbard, B. D., Lazarides, E. Copurification of actin and desmin from chicken smooth muscle and their copolymerization in vitro to intermediate filaments. J Cell Biol. 80 (1), 166-182 (1979).
  29. Ku, N. O., Strnad, P., Bantel, H., Omary, M. B. Keratins: Biomarkers and modulators of apoptotic and necrotic cell death in the liver. Hepatology. 64 (3), 966-976 (2016).
  30. Huiatt, T. W., Robson, R. M., Arakawa, N., Stromer, M. H. Desmin from avian smooth muscle. Purification and partial characterization. J Biol Chem. 255 (14), 6981-6989 (1980).
  31. Zackroff, R. V., Goldman, R. D. In vitro assembly of intermediate filaments from baby hamster kidney (BHK-21) cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (12), 6226-6230 (1979).
  32. Franke, W. W., Schmid, E., Osborn, M., Weber, K. The intermediate-sized filaments in rat kangaroo PtK2 cells. II. Structure and composition of isolated filaments. Cytobiologie. 17 (2), 392-411 (1978).
  33. Small, J. V., Sobieszek, A. Studies on the function and composition of the 10-NM(100-A) filaments of vertebrate smooth muscle. J Cell Sci. 23, 243-268 (1977).
  34. Dahl, D., Bignami, A. Glial fibrillary acidic protein from normal human brain. Purification and properties. Brain Res. 57 (2), 343-360 (1973).
  35. Steinert, P. M., Idler, W. W., Zimmerman, S. B. Self-assembly of bovine epidermal keratin filaments in vitro. J Mol Biol. 108 (3), 547-567 (1976).
  36. Goldman, R. D., Cleland, M. M., Murthy, S. N., Mahammad, S., Kuczmarski, E. R. Inroads into the structure and function of intermediate filament networks. J Struct Biol. 177 (1), 14-23 (2012).
  37. Oshima, R. G. Intermediate filaments: a historical perspective. Exp Cell Res. 313 (10), 1981-1994 (2007).
  38. Mashukova, A., Forteza, R., Salas, P. J. Functional Analysis of Keratin-Associated Proteins in Intestinal Epithelia: Heat-Shock Protein Chaperoning and Kinase Rescue. Methods Enzymol. 569, 139-154 (2016).
  39. Schinzel, R., Dillin, A. Endocrine aspects of organelle stress-cell non-autonomous signaling of mitochondria and the ER. Curr Opin Cell Biol. 33, 102-110 (2015).
  40. Taylor, R. C., Berendzen, K. M., Dillin, A. Systemic stress signalling: understanding the cell non-autonomous control of proteostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 211-217 (2014).
  41. Lemieux, G. A., et al. Kynurenic acid is a nutritional cue that enables behavioral plasticity. Cell. 160 (1-2), 119-131 (2015).
  42. Oosten-Hawle, P., Porter, R. S., Morimoto, R. I. Regulation of organismal proteostasis by transcellular chaperone signaling. Cell. 153 (6), 1366-1378 (2013).
  43. Ulgherait, M., Rana, A., Rera, M., Graniel, J., Walker, D. W. AMPK modulates tissue and organismal aging in a non-cell-autonomous manner. Cell Rep. 8 (6), 1767-1780 (2014).
  44. Aynardi, M. W., Steinert, P. M., Goldman, R. D. Human epithelial cell intermediate filaments: isolation, purification, and characterization. J Cell Biol. 98 (4), 1407-1421 (1984).
  45. Shea, J. M., et al. Purification of desmin from adult mammalian skeletal muscle. Biochem J. 195 (2), 345-356 (1981).
  46. Liao, J., Lowthert, L. A., Ghori, N., Omary, M. B. The 70-kDa heat shock proteins associate with glandular intermediate filaments in an ATP-dependent manner. J Biol Chem. 270 (2), 915-922 (1995).
  47. Liao, J., Omary, M. B. 14-3-3 proteins associate with phosphorylated simple epithelial keratins during cell cycle progression and act as a solubility cofactor. J Cell Biol. 133 (2), 345-357 (1996).
  48. Ku, N. O., Fu, H., Omary, M. B. Raf-1 activation disrupts its binding to keratins during cell stress. J Cell Biol. 166 (4), 479-485 (2004).
  49. Hendriks, I. A., Vertegaal, A. C. A comprehensive compilation of SUMO proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (9), 581-595 (2016).
  50. Agnetti, G., Lindsey, M. L., Foster, D. B. . Manual of cardiovascular proteomics. , (2016).
  51. Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 536-550 (2014).
  52. Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Rep. 16 (9), 1071-1083 (2015).
  53. Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24 (5), 535-542 (2013).
  54. Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (6), 427-439 (2010).
  55. Creixell, P., Linding, R. Cells, shared memory and breaking the PTM code. Mol Syst Biol. 8, 598 (2012).
  56. Minguez, P., et al. Deciphering a global network of functionally associated post-translational modifications. Mol Syst Biol. 8, (2012).
  57. Snider, N. T., Park, H., Omary, M. B. A conserved rod domain phosphotyrosine that is targeted by the phosphatase PTP1B promotes keratin 8 protein insolubility and filament organization. J Biol Chem. 288 (43), 31329-31337 (2013).
  58. Gorospe, J. R., et al. Molecular findings in symptomatic and pre-symptomatic Alexander disease patients. Neurology. 58 (10), 1494-1500 (2002).

Tags

Intermediate Filament ProteinsPost-translational ModificationsTriton X-100 BufferHigh Salt BufferPBS EDTA BufferSDS Sample BufferCentrifugationHomogenization

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Battaglia, R. A., Kabiraj, P., Willcockson, H. H., Lian, M., Snider, N. T. Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications. J. Vis. Exp. (123), e55655, doi:10.3791/55655 (2017).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image