光片为主的生活的荧光显微镜或固定和染色<em>赤拟谷盗</em>胚胎

在赤拟谷盗赤拟谷盗 ，属于大家族暗中甲虫（拟步甲科），具有农业和生命科学领域内历史悠久，是果后的第二个最好的研究模型昆虫的模式生物飞行果蝇 。在过去的四个十年里，它成为发育遗传学的强大和受欢迎的昆虫的模式生物，在进化发育生物学，并在过去的二十年中，在各种原因的胚胎形态：

果蝇和赤同属Holometabola，但约300万年前的^{1，2，3，4}分歧。而果蝇胚胎发育通常被认为是高度衍生， 赤示出devel的更祖模式即在昆虫物种^{5，6，7，8，9}的一个相当大的比例发现opment。首先， 赤呈现出非渐开头的发展， 即，其口器和天线胚胎发生^{10，11，12，13，14，15}中已出现。其次， 赤如下短胚芽发展， 即腹部段germband伸长^{16，17，18，19}在从后部生长区依次加入的原理。第三， 赤开发和后来降级两个额外的胚胎外膜即羊膜，它涵盖了胚胎只腹侧，和浆膜，其完全包住胚胎^{20，21，22。}两种膜起到至关重要的形态发生²³以及抗微生物^24，25和²⁶干燥保护作用。第四，embryonically显影腿是在幼虫生命阶段完全功能和蛹变态^{27，28，29，30，31}时用作原基为成人腿。

由于其体积小，适度的要求，在实验室赤的培养是相当简单的。野生型培养物（WT）菌株或转基因品系通常由周围100-300成人和可以保持一升玻璃瓶（足迹80厘米^2）往三四十厘米高（约50克）与由全谷物小麦的生长培养基内面粉补充有非活性干酵母。供水是没有必要的。这样，即使小型实验室，以保持小型或中型商用虫孵化器内的几十个甲虫文化。 赤的后面发育阶段（幼虫后约4龄，蛹和成虫）很容易从生长培养基通过筛分分离。同步胚胎，恒温产蛋介质上短期内得到成年人。对于快速发展，甲虫培养物保持在32℃（每代约四周），而贮存保持在22-25℃通常执行（每一代约十周）。

在过去的十年中，许多标准TEChniques已经逐渐适应和赤优化，总结在新兴的模式生物书^32。非常重要的是先进遗传方法例如胚胎^33，幼虫^34,35或亲本^36，37基于RNA干扰的基因敲除，与任一piggyBac转 ^38，39或米诺斯 ⁴⁰转座系统和CRISPR /基于Cas9基因组种系转化工程^41。此外， 赤基因组被测序大约十年前^42，并且现在是在第三轮基因组的装配释放^43，其允许高效且全基因组鉴定和基因⁴⁴的系统的分析</s向上>或其它遗传元件^45，46。另外，四个其它鞘翅目物种的基因组可用于比较遗传方法^{47，48,49，50。}与测序基因组关联，两次大规模的遗传分析已经执行， 即 ，插入诱变屏幕⁵¹和基于干扰系统的RNA基因敲除画面^52，53。

与宽视场，共焦或基于光的片材显微镜（LSFM）荧光实时成像允许观察赤的胚胎形态作为时间多维上下文（ 表1）的函数（ 即 ，形态发生）。在宽视场和共聚焦荧光显微镜，该EXCIT通货膨胀和发射光通过相同的物镜引导。在这两种方法中，整个试样被照亮每记录二维平面。因此，试样承受非常高的能量水平。在LSFM，只有在焦平面中的荧光团是兴奋由于通过使用两个垂直布置的物镜（ 图1）照明和探测的去耦。 LSFM有两种法服实现-该单个平面照明显微镜（SPIM）和数字扫描的激光基于片材的荧光显微镜（DSLM， 图2） -和在传统的方法提供了几个重要的优点：（ⅰ）固有光学切片能力， （ⅱ）良好的轴向分辨率，（ⅲ）强烈降低光致漂白的水平，（ⅳ）非常低的光毒性，（v）的高信噪比，（ⅵ）相对高的采集速度，（ⅶ）成像沿多个方向和（viⅱ）更深的组织穿透由于低数值孔径照射物镜^54，55，56的使用。

LSFM已经在赤已成功地应用于记录几乎整个胚胎的形态发生⁵⁷和分析外胚膜破裂的原则，在背封²³的开端。为了提高LSFM的吸引力在赤社区和一般昆虫科学，这是非常重要的，建立标准作业程序，改进方法，协议和资源的水平池在显微镜变成了一个易于在发育生物学实验室-use标准工具和生物学问题留在人们关注的焦点。

该协议开始于赤的基本</ em>的培养， 即维修，繁殖和胚胎收集。接着，两个实验策略中示出：（ⅰ）的定制的转基因品系实时成像和（ii）该染色用荧光染料（ 表2）固定的胚胎的成像。 （i）所述琼脂糖柱，（ii）所述琼脂糖半球和（iii）所述新的蛛网持有人：随后，具有稍微不同的目的三个安装技术详细（ 图3和表3）进行说明。该协议然后解释与LSFM获取数据的步骤。影像学技术和关键因素进行了概述。最后，胚胎检索解释并提供了基本的数据处理建议。在代表性结果，从活体成像数据的两个新的定制和胶质-蓝^58个的转基因株系被示出和各个成像数据集作为可下载资源提供。此外，图像该染色用各种荧光染料的固定胚胎的数据表示。讨论集中在质量控制方面，实时成像方式的电流限制和协议的其他物种的适应性。

该协议是针对配有样品室和用于标准化样品架^{54，59，60，}这是典型的直径由金属，塑料或玻璃筒形元件可旋转的夹持机构基于光的片材荧光显微镜写入在毫米范围内。该协议也适用于这两种法服实施方式中， 即 SPIM和DSLM，以及用于与两个或更多照明和检测臂^61，62，63设置。代表结果表明在两个光谱信道的数据，绿色（ILlumination用488nm的激光，检测通过五十零分之五百二十五通过七十零分之六百零七带通滤波器的带通滤波器）和红色（照明用561纳米的激光，检测），但是协议可以扩展到三个或四个光谱信道。